流式細(xì)胞術(shù)貝克曼

1、 臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 疾病診斷疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù) 免疫調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)：細(xì)胞因子：細(xì)胞因子/受體的相互作用受體的相互作用 共刺激分子受體共刺激分子受體/配體的相互作用配體的相互作用 發(fā)病機理發(fā)病機理：腫瘤的發(fā)病與機體的免疫力低下、以及信號傳遞腫瘤的發(fā)病與機體的免疫力低下、以及信號傳遞 障礙有關(guān)障礙有關(guān) 藥物藥物/疫苗效果的評價疫苗效果的評價：腫瘤生物治療的時機選擇、以及效果腫瘤生物治療的時機選擇、以及效果 的監(jiān)測的監(jiān)測 免疫狀態(tài)評價免疫狀態(tài)評價： 移植、放化療等移植、放化療等. 細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析: :在細(xì)胞周期在細(xì)胞周期( (G

2、0G0，G1G1，S S， G2 G2 ，M)M)的各個時期，的各個時期，DNADNA的含量隨各時相呈現(xiàn)的含量隨各時相呈現(xiàn) 出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記DNADNA，并并 由流式細(xì)胞儀進行分析，可以得到細(xì)胞各個時由流式細(xì)胞儀進行分析，可以得到細(xì)胞各個時 期的分布狀態(tài)，計算出期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。 了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可 利用細(xì)胞周期蛋白（利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖核增殖 抗原（抗原（PCNAPCN

3、A）等，對細(xì)胞周期進行精確的分期：等，對細(xì)胞周期進行精確的分期： G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M. DNA含量及細(xì)胞周期分析含量及細(xì)胞周期分析 0 200 400 600 8001000 DNA content C o u n t Normal Cell Cycle 1. 腫瘤的早期診斷。腫瘤的早期診斷。 2. 腫瘤的良惡性判斷。腫瘤的良惡性判斷。 3. 觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及周期分布。觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及周期分布。 4. 療效監(jiān)測療效監(jiān)測 細(xì)胞功能分析細(xì)胞功能分析 1.吞噬功能試驗吞噬功能試驗 2.氧爆發(fā)試驗氧爆發(fā)試驗 3.根據(jù)根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同將淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因

4、子的不同將CD4+或或 CD8+分為介導(dǎo)細(xì)胞免疫的分為介導(dǎo)細(xì)胞免疫的I型細(xì)胞和介導(dǎo)體液型細(xì)胞和介導(dǎo)體液 免疫的免疫的II型細(xì)胞型細(xì)胞. 4.藥物泵的功能檢測藥物泵的功能檢測 5.NK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性檢測細(xì)胞的腫瘤殺傷活性檢測 6.血小板的粘附血小板的粘附,聚集功能檢測聚集功能檢測 樹突狀細(xì)胞分析（樹突狀細(xì)胞分析（Dendritic Cells,DC) uDC是主要的抗原遞呈細(xì)胞，同時又是重要的先 天免疫細(xì)胞，還是具有免疫調(diào)控功能的一個細(xì)胞 群，沒有發(fā)現(xiàn)特異性的抗原標(biāo)記 uDC研究的主要內(nèi)容包括直接分析計數(shù)、體外誘 導(dǎo)檢測,一般分為兩群PDC,MDC u當(dāng)前DC檢測的方法： 1）Lin-,CD

5、11c,CD123,同時可能表達(dá) CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4對外周血或其它組織DC進 行分析 3） CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85 /CD123 T細(xì)胞分析細(xì)胞分析 u相對計數(shù)相對計數(shù)淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項目和意義 疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK 自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低 AIDS降低降低嚴(yán)重嚴(yán)重 降低降低 增高增高降低降低 SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低 慢性活動性肝炎、慢性活動性肝炎、 肝硬化肝硬化 降低降低正常正常 或或 增高增高 降低降低降低降低 腫瘤腫瘤

6、降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低 CD4細(xì)胞絕對計數(shù)細(xì)胞絕對計數(shù) u對AIDS病人的診斷、療效和預(yù)后有重要的指導(dǎo) 意義，一般認(rèn)為CUTOFF值為200/ul. u絕對計數(shù)是加入濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)微球與標(biāo)本一起 測定，流式細(xì)胞儀控制軟件在設(shè)置后能自動計算 出濃度 u對任何細(xì)胞群體都可以進行絕對計數(shù) Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定 u根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類 型和生物學(xué)功能,人的4+ 細(xì)胞可以分為1、2 u1細(xì)胞產(chǎn)生 2、 12、 、 等 細(xì)胞因子,主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的 免疫反應(yīng)、遲發(fā)性過敏反應(yīng),并 在清除病毒等細(xì)胞內(nèi)致病因子 方面起著重要作用 u2細(xì)胞分泌 4、 5、 6、

7、 10、 13等細(xì)胞因子,主要促進體液 免疫反應(yīng),中和胞外病原體 u相應(yīng)地，CD8+T細(xì)胞也可以分 為Tc1和Tc2 Th1細(xì)胞：細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì) 胞毒性T細(xì)胞的生長和活化 、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo) 遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能 亢進將導(dǎo)致炎癥慢性遷延 ，器官特異性自身免疫病 ，急性排異反應(yīng)和接觸性 皮炎等的發(fā)病和免疫病理 損傷。 Th2細(xì)胞細(xì)胞 ：介導(dǎo)體液免疫， 促進B細(xì)胞的生長、活化和 分化，是IgG1和IgE類抗 體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢 進將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng) ，參與高IgE綜合癥和嗜酸 性粒細(xì)胞增多癥。 Th1Th2檢測檢測Tips u一定要確定T細(xì)胞是否已經(jīng)活化，細(xì)胞轉(zhuǎn)運阻滯是否成功，

8、胞 膜打孔是否有效 u一定要用胞漿內(nèi)同型對照（特別是FITC標(biāo)記時） ，以便分別部分弱表達(dá)的細(xì)胞因子。 TETRAMER u抗原遞呈細(xì)胞（APC）攜帶抗原片段通過與TCR復(fù)合物結(jié)合，在APC和T細(xì) 胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞免疫效 應(yīng)。MHC-四聚體染色技術(shù)用于抗原特異性T細(xì)胞分析的原理在于體外模仿 上述抗原遞呈的過程來實現(xiàn)對特異性T細(xì)胞的鑒定，通過流式細(xì)胞儀這種高 通量分析儀器對標(biāo)本中這群細(xì)胞進行分析 u四聚體技術(shù)的優(yōu)勢是：可以對特異性免疫細(xì)胞進行定量；用流式細(xì)胞儀檢測 可以快速測定大量細(xì)胞，可以同時進行其它表面染色，可以直接用外周血測 定而不需要培養(yǎng)；四

9、聚體染色不會殺傷細(xì)胞，因此染色后的細(xì)胞可以進行分 選或其它功能分析；四聚體對所有的特異性T細(xì)胞都能夠結(jié)合，而不僅僅是 對有功能的細(xì)胞進行檢測。 u不同廠家的MHC四聚體產(chǎn)品不太一樣：貝克曼庫爾特公司創(chuàng)造性地 構(gòu)建和表達(dá)了MHC分子3鏈的區(qū)域突變的蛋白（iTAg），能降低 其與非特異性T細(xì)胞結(jié)合，大大提高了特異性。并且將MHC四聚體 直接標(biāo)記熒光，和常用的抗原多肽負(fù)載后整體商品化，也有單獨的 MHC分子（iTAg）單獨出售，極大方便了研究者 CD4CD25 Treg u調(diào)控性T細(xì)胞的主要功能是抑制機體免疫功能，太強則免 疫耐受，太弱會引起自身免疫反應(yīng) u調(diào)控性T細(xì)胞調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞對抗原的遞呈

10、u調(diào)控性T細(xì)胞的表型是CD4+CD25bright，逐漸發(fā)現(xiàn)越 來越多的其它分子可能能夠更精確限定（eg.FOX-1?) uCD25也是免疫細(xì)胞晚期活化的標(biāo)記，但表達(dá)的平均熒光 強度不足夠強 非特異性的先天免疫細(xì)胞非特異性的先天免疫細(xì)胞 u細(xì)胞:占外周血T細(xì)胞的10以下，非抗原依賴型免 疫細(xì)胞，在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加，表達(dá) CD3量較普通T細(xì)胞多 uNK細(xì)胞：占外周血淋巴細(xì)胞825，傳染病和腫瘤病 人數(shù)量偏低。NK細(xì)胞可以根據(jù)NKR的不同而分類，丙型 肝炎的發(fā)生和預(yù)后可能與NK細(xì)胞的表型相關(guān) uDC：分布與淋巴組織和外周血，為非成熟狀態(tài)，遇到相 應(yīng)的抗原后主要分泌IFN-alpha來

11、發(fā)揮左右 其它重要分子的流式分析的意義其它重要分子的流式分析的意義 u粘附分子：物種間高度保守，與細(xì)胞間通訊，干細(xì)胞 HOMING，腫瘤的發(fā)生可能有很重要的關(guān)系，如 CD11C/CD18-CD54與DC成熟和遷移有關(guān)； CD209-CD102與抗原遞呈有關(guān) uCD26:移植后造血干細(xì)胞表達(dá)可能不利于該細(xì)胞的 homing，有證據(jù)表明抑制造血干細(xì)胞有利用移植成功 流式細(xì)胞術(shù)在移植中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在移植中的應(yīng)用 u移植配型和群體反應(yīng)性抗體的檢測 u熒光示蹤標(biāo)記的移植細(xì)胞：CFSE是一個確定的熒光標(biāo) 記物，開發(fā)其它穩(wěn)定的熒光素應(yīng)該更有幫助 流式細(xì)胞儀分選流式細(xì)胞儀分選 u為達(dá)到最高的分選效率，實用

12、中最好先用磁珠分選系 統(tǒng)進行初步分選 u活細(xì)胞分選非常有用 流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究的新方向流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究的新方向 u細(xì)胞多態(tài)性分析：受體、抗原折疊、HLA等，包括 CXCR4,CCR5,DC-SIGN(與AIDS易感性有關(guān)）， NKR(中國科大研究領(lǐng)先項目） u信號傳導(dǎo)（實際主要為胞漿內(nèi)磷酸化及去磷酸化蛋白的 檢測） u新型熒光特異性探針：胞內(nèi)病原體檢測、轉(zhuǎn)錄因子檢測 、細(xì)胞器或細(xì)胞生命活動指標(biāo)的新熒光素的應(yīng)用 u利用分選的細(xì)胞進行體內(nèi)和體外功能研究 u與其它定位性的熒光設(shè)備聯(lián)合使用（如 MPE,CONFOCAL,IC100等） Cell Lab IC 100 Complete d

13、ata mining and analysis Flexible Analysis Plug-in architecture Scalable across an enterprise -2-1012345 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Log EC50 FLIN u流式細(xì)胞儀是一個高通量的開發(fā)系流式細(xì)胞儀是一個高通量的開發(fā)系 統(tǒng)，隨著新抗體和新標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和統(tǒng)，隨著新抗體和新標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和 開發(fā)，將在疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)的開發(fā)，將在疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)的 研究方面為大家發(fā)揮更大的作用研究方面為大家發(fā)揮更大的作用 T細(xì)胞分析細(xì)胞分析 u相對計數(shù)相對計數(shù)淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項目和意義

14、疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK 自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低 AIDS降低降低嚴(yán)重嚴(yán)重 降低降低 增高增高降低降低 SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低 慢性活動性肝炎、慢性活動性肝炎、 肝硬化肝硬化 降低降低正常正常 或或 增高增高 降低降低降低降低 腫瘤腫瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低 CD4細(xì)胞絕對計數(shù)細(xì)胞絕對計數(shù) u對AIDS病人的診斷、療效和預(yù)后有重要的指導(dǎo) 意義，一般認(rèn)為CUTOFF值為200/ul. u絕對計數(shù)是加入濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)微球與標(biāo)本一起 測定，流式細(xì)胞儀控制軟件在設(shè)置后能自動計算 出濃度 u對任何細(xì)胞群體都可以進行絕對計數(shù) CD4CD25 Treg u調(diào)控性T細(xì)胞的主要功能是抑制機體免疫功能，太強則免 疫耐受，太弱會引起自身免疫反應(yīng) u調(diào)控性T細(xì)胞調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞對抗原的遞呈 u調(diào)控性T細(xì)胞的表型是CD4+CD25bright，逐漸發(fā)現(xiàn)越 來越多的其它分子可能能夠更精確限定（eg.FOX-1?) uCD25也是免疫細(xì)胞晚期活化的標(biāo)記，但表達(dá)的平均熒光 強度不足夠強 其它重要分子的流式分析的意義其它重要分子的流式分析的意義 u粘附分子：物種間高度保守，與細(xì)胞間通訊，干細(xì)胞 HOMING，腫瘤的發(fā)生可能有很重要的關(guān)系，如 CD11C/CD18-