質(zhì)譜法離子源和分析器

1、質(zhì)譜法 電離源和質(zhì)量分析器 1、組成部分 燈絲：鎢、錸或錸鎢絲，發(fā)射電子，電離樣品 收集極：接收燈絲發(fā)射的電子 推斥極：推出產(chǎn)生的樣品離子 永久磁鐵：使電子做螺旋運動，增加電離幾率 2、電離效率曲線 燈絲產(chǎn)生的電子被加速到70eV,保 證電離的重現(xiàn)性。為什么？ 電離效率隨電子能量的升高而升 高，當達50eV時，基本達到最大 值，實驗上設定電子能量為70eV。 此時，產(chǎn)生的譜圖有穩(wěn)定的指紋 特征。 電離效率曲線 電子能量對質(zhì)譜圖的影響 20406080100120140 0 20 40 60 80 100 77 105 122 20 eV Relative Abundance m/z 20406

2、080100120140 0 20 40 60 80 100 122 9 eV Relative Abundance m/z 20406080100120140 0 20 40 60 80 100 39 51 77 105 122 70 eV Relative Abundance m/z 不同能量下獲得的苯甲酸的質(zhì)譜圖 利用反應氣體的離子與樣品分子相互反應， 而使樣品分子離子化，本質(zhì)是化學過程，故稱 化學電離。 離子出品的縫隙減小，使高子室內(nèi)的壓力 保持在0.5-1.0Torr。 電子轟擊化學電離氣體，不直接作用于樣 品分子。 推斥電極電壓：0V，增加源內(nèi)停留時間， 有利于離子-分子反應。 化

3、學電離試劑：甲烷、異丁烷、氨氣，氫 氣，水、甲醇、胺等。 以甲烷為例，化學電離源內(nèi)的有關離子-分子反應， CH4 + e CH4+ + CH3+ + CH2+ + CH+ + C+ + H2+ + H+ CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 CH3+ + CH4 C2H5+ + H2 CH5+ + XH XH2+ + CH4 C2H5+ + XH XH2+ + C2H4 C2H5+ + XH X+ + C2H6 化學電離離子-分子反應常見類型 q 質(zhì)子轉移反應 BH+ + M MH+ + B q 氫負離子轉移反應 BH+ + M M-H+ + BH2 q 電荷交換反應 B+ + M B

4、+ M+ q 加成反應 BH+ + M BHM+ 或 BMH+ 快原子轟擊(Fast Atom Bombardment, FAB), Ar原子 快離子轟擊(Fast Ion Bombardment, FIB) Cs離子 FAB： Ar 與被加速到20kV的Ar+進行彈性碰撞，使Ar獲得相應的動能， 射向樣品靶，產(chǎn)生轟擊作用。 FIB： Cs+由CsI加熱后放出來，然后通過電場加速到20kV，射向樣品 靶，產(chǎn)生轟擊作用。 適用于極性分子的分析，生物分子，質(zhì)量在2000以內(nèi)。 基質(zhì)的作用： 一般為強極性分子，對快原子或快離子有較強的吸收能力，可使進樣 品溶液溶解，溶劑揮發(fā)后，基質(zhì)結晶，樣品均勻分布

5、于該結晶體中，轟擊 時一起蒸發(fā)。 基質(zhì)分子量沸點C背景離子應用 甘油92182/20mmMH+, MH+nM+普通基質(zhì) 硫甘油108118/5mmM-H2O+, MH+nM+肽、抗生素 間硝基芐醇153175/3mmMH+, MH+nM+肽、蛋白質(zhì) 二乙醇胺105217/150mmMH+, MH+nM+多糖 三乙醇胺149190/5mmMH+, MH+nM+多糖 硫代二甘醇94-M-H2O+, MH+nM+金屬有機物 二硫蘇糖醇 二硫赤糖醇(5:1) 120-M-H2S-H2+,MH+nM+金屬有機物,肽 四亞甲基砜120285MH+, 2M+H+肽 聚乙二醇 62+n(4 4) -(CH2C

6、H2O)H+, MH+多糖 FAB/FIB常用基質(zhì) 試樣溶解或懸浮于基質(zhì)中，激光 束輻射到基質(zhì)和試樣分子上。 基質(zhì)吸收激光束能量后汽化，部 分試樣分子伴隨基質(zhì)的汽化而解 吸。 基質(zhì)吸收大部分激光能量，減少 了試樣分子被激光能量破壞及過 度電離成碎片離子。 激光：固體氮激光，紫外光 波長： 337nm 功率：106108W/cm2 脈沖時間：10-610-9秒 關于基質(zhì)： 極性化合物 溶解樣品 芳環(huán) 吸收激光 易結晶 均勻分散樣品分子 MALDI常用基質(zhì) 基質(zhì)性狀適用波長應用 煙酸固體266nm, 2.94m,10.6m 蛋白質(zhì) 2,5-二羥基苯甲酸固體266nm, 2.94m,10.6m蛋白質(zhì)

7、 芥子酸固體266nm, 337nm,355nm, 2.94m蛋白質(zhì) -氰基-4-羥基肉桂酸固體337nm,355nm蛋白質(zhì) 3-羥基吡啶甲酸固體337nm,355nm核酸、配糖體 2-(4-羥基苯偶氮)苯甲酸固體266nm, 337nm蛋白質(zhì)、配糖體 琥珀酸固體2.94m,10.6m蛋白質(zhì)、核酸 間硝基芐醇液體266nm蛋白質(zhì) 甘油液體2.94m,10.6m蛋白質(zhì) 鄰硝苯基辛基醚液體266nm, 337nm, 355nm合成高分子 蛋白質(zhì)組分析。 優(yōu)優(yōu) 點點 ： 質(zhì)量范圍可達50萬Da。 高靈敏度，可測至10-1210-15摩爾。 軟電離，沒有或很少有碎片離子，可用于分析混合物。 可容納毫摩

8、爾級的鹽。 缺缺 點點 ： 基質(zhì)背景易干擾質(zhì)量數(shù)1000Da以內(nèi)的物質(zhì)分析。 激光解析電離可能導致被分析物分解。 毛細管 直徑0.10.2mm。 噴霧電壓：毛細管尖端與離子引入口之間，38kV。 殼氣(Sheath gas), 從毛細管端與噴霧反向加熱后流出。 離子通過取樣錐(Skimmer)和毛細管(Capillary)傳送至光學聚焦系統(tǒng)。 電噴霧電離的基本過程 電場下的噴霧 帶電霧滴 殼氣的作用下 溶劑的蒸發(fā) 電荷的庫侖作用 帶電霧滴的解體 Rayleigh 極限 表面張力和庫侖斥力的平衡點 Reproduced from Kebarle, P. J. Mass Spectrom. 200

9、0, 35, 804-817. 電噴霧電離產(chǎn)生多電荷離子： 可以用質(zhì)譜儀的小的質(zhì)量范圍測定大的生物分子， 相當于將質(zhì)譜儀的質(zhì)量范圍放大的n倍。 q 例 肌紅蛋白電噴霧質(zhì)譜圖 帶1030個電荷的系列分子離子 毛細管樣品送入加熱管中，該管可以達到300C以上。 在加熱管中溶劑揮發(fā)。 加熱管出口處放置電暈(Corona )放電裝置, 使揮發(fā)出來的溶劑分子 電離，形成等離子體。 等離子體與樣品分子反應，生成MH+或MH準分子離子。 APCI特點 軟的電離方式，樣品直接從液從中拉出來的，不是蒸發(fā)，基本 不產(chǎn)生分解，電離過程屬于離子-分子反應，與CI原理相似。 快速地適合高低含量水溶液的流動相，可作梯度分

10、析。 單電荷峰，實現(xiàn)源內(nèi)CID。 Molecular Weight Non-PolarPolar EI/CI Electrospray APCI 100,000 1000 Which Ionisation Mode? 儀器的加速電壓V：使離子具有高的動能，快速通過磁場、電場和無場區(qū)。 某一離子：質(zhì)量為m，電荷價態(tài)為z，從加速電場獲取的電能為zeV。 該離子的動能為1/2mv2 v為離子的運動速度，兩個能量是相等的。 即： 4.1.4 質(zhì)量分析器 種類繁多，磁場、電場、射頻場對電荷離子的控制作用。 離子在扇形磁場中的運動 zeVmv 2 2 1 1、離子在扇形磁場中的運動 e 2 r r mv

11、zeE 將離子動能 mv2/2=zeV 代入上式，則得： r e 2 E V r 半徑為re圓弧上，電場強度為： 其中E為靜電場的電壓。 若Er固定，則離子運動半徑隨加速電壓的 改變而改變，因此靜電場是能量分析器。 離子在扇形電場中的運動 2、離子在扇形電場中的運動 Er 為離子運動軌道上的電場強度 re 為離子在電場中作圓周運動的半徑，即 電場的半徑。 21 e r /ln 21 rr E r E 代入 re = 2V/Er中得：E = V lnr1/r2, r1和r2是固定的。 所以，在雙聚焦質(zhì)譜儀中，靜電場電壓與加速電壓維持著一定的比例關系。 2、雙聚焦質(zhì)譜儀基本原理 扇形磁場 質(zhì)量色散

12、，分析離子原因，實際上是動量分析器。 方向聚焦，相同質(zhì)量和相同速度的離子，從同一點以不同角度入 射到磁場中，在磁場中所走軌跡不同，但在磁場后可 集中于某一點，與方向無關。 靜電分析器 能量分析器 方向聚集，同磁場。 離子源中引出的離子： 運動方向不平行。（角色散） 存在能量色散，初始的溫度分 布和電子轟擊時所產(chǎn)生的附加動能。 雙聚集 ESA使由離子源發(fā)散出來的離子束按動能聚焦成一系列的點，再經(jīng)磁場將具有 相同質(zhì)核比分開的離子束再聚焦到一點。 兩組四極桿分別加上 +(u+Vcost) 和 (u+Vcost)， 其中u直流電壓部分，Vcost為射頻電壓部分 = 2f, f為頻率。 理想的四極場為雙

13、曲線型，但加工的困難，用四根桿代替。 在四極場中任一點的電場為： 2 0 22 )cos()( r yx tVuxyt 在場的中心和兩條對角線 上的任何一點電位為零。 離子在射入四極場后，其運動方程 ma = eE a為離子加速度，E電場強度 電場強度為電位的導數(shù)。則上式在直角坐標系展開為：在四極場中任一點 的電場為： z e dt zd m y e dt yd m x e dt xd m 2 2 2 2 2 2 代入上式得： 0 cos2 cos2 2 2 2 0 2 2 2 0 2 2 dt zd m y r t)Ve(u dt yd m x r t)Ve(u dt xd m 令： 2 4

14、 8 22 0 22 0 t mr eV q mr eu a 合并上 幾式得： 02cos2 02cos2 2 2 2 2 y)q(a d xd m x)q(a d xd m Mathieu 方程 Mathieu方程解，復雜，與邊界條件密切相關。 以a, q為坐標，方程的解作圖，三個區(qū)：穩(wěn)定區(qū)，x不穩(wěn)定區(qū)，y不 穩(wěn)定區(qū)。 a, q都是交直流電壓幅值、頻率和時間的函數(shù)，可由儀器設定和調(diào) 節(jié)，r0 是儀器中心到四極桿的徑向距離，其值是確定的。 掃描線：與穩(wěn)定區(qū)相截并且 通過原點的直線。在這條直線上， 各處的a/q比值都為常數(shù)，即 u/V = a/q 亦為常數(shù)。 同質(zhì)荷比的離子對應有不同的a, q值

15、，對于具有使 u/V = a/q為常數(shù)的 離子來說，其a和q值均在掃描線上。如果其值恰好處于掃描線和穩(wěn)定區(qū)的 兩個邊界交點(A，A)之間，則該離子落在穩(wěn)定區(qū)之內(nèi)。 改變u/V 的比值，掃描線斜率變化，增加，AA長度減小，即能夠穩(wěn) 定的離子減小，分辨率增加。AA長度僅與u/V比值有關。 固定u/V比值(即保持AA長度不變，也就是分辨率不變)，改變V的幅 值，可使不同質(zhì)荷比的離子先后進入穩(wěn)定區(qū)，順序通過四極桿之后被接 收，得到一組不同質(zhì)荷比的質(zhì)譜。 穩(wěn)定區(qū): 離子產(chǎn)生穩(wěn)定的振蕩， 沿z方向通過四極桿。 不穩(wěn)定區(qū): 離子振幅不斷增大， 最后飛出四極場或與z 和y電極碰撞中和。 離子阱質(zhì)譜由四極桿質(zhì)譜

16、儀發(fā)展而來。 四極桿變?yōu)榄h(huán)極，四極桿兩端加端帽。 端帽和環(huán)極上均加有直流電壓U，射頻電壓 (振幅為V，角頻率) 。 離子的運動仍由Mathieu方程描述。 較理想的離子阱質(zhì)量分析器：r02 = 2z02 Mathieu方程的解：藍色區(qū)為穩(wěn)定區(qū)，其它為不穩(wěn)定區(qū)，空間分布， 這里僅是一個截面。 捕集時(Trapping)，設定U, V 和 ，使各種離子在藍色區(qū)域的最式邊。 掃描時(Scanning)，給定U, V 和 ，使掃描線按 qz=0 的由左到右進行， 離子從小質(zhì)荷比到大的質(zhì)荷比依次排出到檢測器。 離子阱中引入10-3 Torr 氦 氣，使離子運動受到阻尼，提 高離子軌跡的穩(wěn)定性，進而提 高

17、儀器的分辨率和靈敏度。 離子源中的離子經(jīng)加速電壓獲得的速度為： 其中 ze為電荷，V為加速電壓，m為質(zhì)量。 m zeV v 2 飛行管長度L，到達檢測器的時間為： 質(zhì)量越大，飛行時間越長，實現(xiàn)分離。zeV m L v L t 2 m1和m2兩個離子： zeV mmL t 2 )( 21 用已知樣品進行校 正，得到未知離子 的質(zhì)量。 t t m m 2 儀器的分辨率近似為： 提高加速電壓，增長飛行管長度，都可提高分辨率。 但導致分辨率較低的主要原因是離子源得到離子的能量色散作用，即分 子的熱運動的影響，使得離子的被始速度不一致。 解決離子熱運動，提高分辨率的方法： 兩級加速法：先用一級加速，離柵

18、極較遠的離子獲得更多的動能，提高 速度，追趕上離柵極近者，然后再經(jīng)柵極加速后，一起進入飛行管。 Delay Extract技術：在激光脈沖開啟的瞬間，沒有加速電壓存在，離子 處于一種無場運動，不同速度的離子向柵極運動的距離不同，一定時間 過后(很短的時間)，加上加速度電壓把離子引向柵極，此時，前面具有 不同速度的離子處在不同的位置，速度快者，離柵極近，速度慢者，離 柵極遠。加上電壓后，處于不同位置的離子獲得電場能，離柵極近者， 獲得的電場能小，離柵極遠者獲得電場能大，前者本身速度快，被始動 能大，后者速度慢，初始動能小。動能小者從柵極電壓獲得相對多的電 場能，動能大者從柵極電壓獲得相對少的動能

19、，從而使兩者加速后，動 能的差異減小，即減小能量色散。從而提高分辨率。 飛行時間質(zhì)譜儀 反射式或折射式：靠電場將飛行的離子反射回來，在反射端接有檢測器。 好處： 提高分辨力和靈敏度。 對靈敏度的提高：中性分子也會在電離過程中產(chǎn)生，并飛向檢測器，但中性分子不能被 反射，不能到達反射檢測器所在位置，減小本底噪音，提高靈敏度。 對分辨率的提高：速度快的離子動能相對較大，克服電場阻力的能力大，打入到反射電 場的深度大，反之，速度慢的離子打入反射電場的深度小，前者因打 入電場深度大，多運動一段距離，后者因小運動的了段距離?？煺叨?走路程，慢者少走路程，最終兩者幾乎同時到達檢測器，提高了分辨 力。 折射式

20、原理同反射式，只是多反射了幾次，提高分辨力，但可能減小靈敏度。 離子沿平行于磁場方向進入ICR-Cell，加在垂直于磁場的捕集電極上的低直流電壓形 成一個靜電場將離子拘禁于室中。在磁場作用下，離子在垂直于磁場的圓形軌道上作 回旋運動，其回旋頻率 僅于磁場強度 B 和離子的質(zhì)荷比m/z有關： m zB 7 10537. 1 式中 為赫茲(Hz), B為特斯拉(T), m為原子質(zhì)量單位(u) 一組不同空間位置上m/z值相同而速度不同的離子將以同一頻率運動，離子 的速度只影響其軌道半徑。 m zB 7 10537. 1 式中 為赫茲(Hz), B為特斯拉(T), m為原子質(zhì)量單位(u) 一組不同空間

21、位置上m/z值相同而速度不同的離子將以同一頻率運動，離子 的速度只影響其軌道半徑。 通過發(fā)射電極向離子加一個射頻電場；若射頻電壓的頻率正好與離子回旋的 頻率相同，離子將共振吸收能量，使其運動軌道半徑和運動速度逐漸穩(wěn)步增大， 但頻率仍然不變。當一組離子達到同步回旋之后，在接收電極上產(chǎn)生鏡像電流。 根據(jù)鏡像電流的頻率可以計算出離子的質(zhì)量。 在實際測量中，多種離子同時產(chǎn)生，在回旋池中加一個頻率范圍覆蓋了所有 感興趣離子的脈沖射頻。脈沖結束后，所有受激離子誘導的鏡像電流在接收電路 上形成各自的閾衰減信號；這個復合的時閾誤減信號經(jīng)傅里葉變換為與質(zhì)量相關 的頻閾譜圖。 對鏡像電流取樣的時間越長，質(zhì)量分辨率

22、越高。但碰撞阻尼破壞離子的同步 回刻運動，從而使鏡像電流衰減加快。 高真空有利于提高分辨率，同時還可改善信噪比。 幾種常見商用質(zhì)譜儀 Finnigan MAT-900XP High resolution, double focusing mass spectrometer. Acceleration voltage Full acceleration voltage for all ionization modes Mass range 5,000 Da at full acceleration potential Resolution better than 60,000 Mass accuracy better than 2 ppm Finnigan TSQ Quantum Mass Rang