組織搗碎及細(xì)胞破碎

1、1.2.2 組織搗碎及細(xì)胞破碎 （一）細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)（一）細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn) （二）細(xì)胞破碎機(jī)理（二）細(xì)胞破碎機(jī)理 （三）細(xì)胞破碎方法（三）細(xì)胞破碎方法 教育技術(shù)中心教育技術(shù)中心 1.植物細(xì)胞 2.微生物細(xì)胞 G+細(xì)菌和G 酵母細(xì)胞 真菌菌絲細(xì)胞壁 （一）細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)（一）細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn) 成 分 G+ G - 肽聚糖 磷壁酸 類脂質(zhì) 蛋白質(zhì) 含量很高（3095） 含量較高（50） 一般無（2） 0 含量很低（520） 0 含量較高（020） 含量較高 革蘭氏陽性細(xì)菌的和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)造 革蘭氏陽性細(xì)菌與陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分革蘭氏陽性細(xì)菌與陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分(占細(xì)胞壁干重

2、的占細(xì)胞壁干重的%) （二）細(xì)胞破碎的機(jī)理（二）細(xì)胞破碎的機(jī)理 壓縮力和剪切力 改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大目標(biāo)產(chǎn)物的溶出率 完全溶解細(xì)胞的保護(hù)屏障細(xì)胞壁 （三（三 ）細(xì)胞破碎的方法）細(xì)胞破碎的方法 1.1.物理破碎物理破碎 （1 1）高壓勻漿器）高壓勻漿器 （1 1）高壓勻漿法）高壓勻漿法 工作原理：剪切，碰撞 影響高壓勻漿器破碎效果的因素 壓力：通常采用的壓力為5570Mpa 溫度： 通過勻漿器的次數(shù)：12 閥與閥座間距 高壓勻漿器原理利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由 于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂,從低壓環(huán)境 釋放出來。 （1 1）高壓勻漿法）高壓勻漿法 注意： 易造成堵塞

3、的團(tuán)狀或絲狀真菌； 較小的革蘭氏陽性菌； 含有包含體的基因工程菌 。 珠磨機(jī) 工作筒 （2 2）珠磨法）珠磨法 攪攪拌器拌器 原理：在膜腔中裝入小玻璃球或小鋼球，在攪 拌漿的作用下，它將使細(xì)胞懸浮液與細(xì)胞懸浮 液，細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁 一起發(fā)生碰撞、剪切，使細(xì)胞在某種程度上破 碎，再由液珠分離器分開、排出。（這些裝置 的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高， 通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。） 構(gòu)件：微珠、冷卻裝置、攪拌漿、液珠分離器、 物料進(jìn)出口。見圖 高速珠磨機(jī)高速珠磨機(jī) 工作原理：剪切，碰撞工作原理：剪切，碰撞 （2 2）珠磨法）珠磨法 影響因素珠磨效率的因素 珠

4、體的大?。簩?shí)驗(yàn)室規(guī)模，珠徑為0.2mm較好， 工業(yè)規(guī)模，不得0.4mm 珠體在磨室中的裝量：控制在80%90%； 攪拌速度： 操作溫度：操作溫度在540范圍內(nèi) 被處理細(xì)胞的特性： （3 3）超聲波破碎法）超聲波破碎法 工作原理工作原理 空穴現(xiàn)象引起工作液局部區(qū)域壓力差 ，從而產(chǎn)生一 個極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在 介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液 體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。 影響因素影響因素 儀器的功率 介質(zhì)的離子強(qiáng)度 pH值 菌體的種類和濃度 電聲超聲波發(fā)生器電聲超聲波發(fā)生器 （4 4）滲透壓沖擊法）滲透壓沖擊法 細(xì)胞 高滲溶液 脫水 低滲溶液 吸水破裂 p反

5、復(fù)凍融法 p干燥法 pX-press法（凍結(jié)-撞擊法） 2.2.化學(xué)法化學(xué)法 （1）酶法 l 原理： l 外加酶法 細(xì)菌類：溶菌酶 ， G+需配合EDTA 放線菌：溶菌酶 外加酶法外加酶法 酵母和真菌：蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等 植物細(xì)胞壁：纖維素酶，果膠酶； 外加酶法外加酶法 M注意事項 Z 需要選擇適宜的酶、酶系統(tǒng)和特定的反應(yīng)條件； Z 在選擇酶系統(tǒng)時，須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來選 擇； Z 常結(jié)合其他方法預(yù)先處理； 外加酶法外加酶法 M外加酶法的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物；條件溫和；核酸泄出量 少；細(xì)胞外形完整。 不足 溶酶價格高 通用性差 產(chǎn)物抑制的存在；如甘露糖對蛋白酶有抑制作用，

6、 葡聚糖抑制葡聚糖酶。 酶自溶法酶自溶法 （2）酶自溶法 常采用加熱法或干燥法 比如谷氨酸產(chǎn)生菌，加入0.028mol/L Na2CO3和 0.018mol/L NaHCO3配成pH10.0的緩沖液，使成3%的懸浮 液加熱至70，保溫攪拌20min，菌體即自溶。又如： 酵母自溶需在4550下保溫1224h。 化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法 （3）化學(xué)試劑破碎法化學(xué)試劑破碎法 表面活性物質(zhì) EDTA螯合劑 有機(jī)溶劑 變性劑 五、選擇破碎方法的依據(jù)五、選擇破碎方法的依據(jù) 1處理量的大小； 2細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)； 3目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性； 4破碎后固液分離的難易程度； 5.選擇性地釋放目標(biāo)產(chǎn)物。 選擇性地釋放目標(biāo)產(chǎn)物選擇性地釋放目標(biāo)產(chǎn)物 僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍 細(xì)胞膜附近，采用溫和的破碎方法如酶溶法、滲透壓沖擊法、 凍融法； 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，機(jī)械破碎 選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物 當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物與膜或壁結(jié)合時，調(diào)整溶液pH值、離子強(qiáng)度、添 加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如螯合劑、表面活性劑等，使目 標(biāo)產(chǎn)