《羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》編制說(shuō)明

1、海南省地方標(biāo)準(zhǔn)羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程的制定任務(wù)是根據(jù)海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局“瓊質(zhì)技監(jiān)標(biāo)【2013】71號(hào)”文件精神內(nèi)容，由海南省水產(chǎn)研究所負(fù)責(zé)羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程的編制工作。二、標(biāo)準(zhǔn)制定背景與意義羅非魚(yú)是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，海南省羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)經(jīng)多年的發(fā)展現(xiàn)已形成了集遺傳育種、種苗生產(chǎn)、成魚(yú)養(yǎng)殖、飼料、加工、運(yùn)銷(xiāo)和配套服務(wù)為一體的完整的產(chǎn)業(yè)鏈。 2011年止全省共有羅非魚(yú)種苗場(chǎng)60多家，其中規(guī)模較大的14家，年產(chǎn)魚(yú)苗108億尾；獲得haccp認(rèn)證的羅非魚(yú)加工廠34家，歐盟注冊(cè)的有22家，年加工能力80多萬(wàn)噸；養(yǎng)殖面積約3萬(wàn)

2、公頃，年實(shí)際產(chǎn)量約31萬(wàn)噸，出口量10.3萬(wàn)噸，位居全國(guó)第一，羅非魚(yú)養(yǎng)殖已成為我省出口創(chuàng)匯和漁民增收的重要途徑。我省羅非魚(yú)養(yǎng)殖模式以池塘養(yǎng)殖為主，但隨著羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，羅非魚(yú)主產(chǎn)區(qū)等地不斷爆發(fā)鏈球菌疾病，死亡率最高到達(dá)40%，羅非魚(yú)鏈球菌病已成為我省羅非魚(yú)養(yǎng)殖的重大危害之一。為準(zhǔn)確檢測(cè)羅非魚(yú)鏈球菌病，規(guī)范羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)，科學(xué)的引導(dǎo)對(duì)羅非魚(yú)鏈球菌病的防治，杜絕盲目用藥，促進(jìn)我省羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，制定羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程具有極其重要的意義。海南省水產(chǎn)研究所科研人員多年來(lái)對(duì)羅非魚(yú)鏈球菌病防治做過(guò)較多研究，本標(biāo)準(zhǔn)編制組的成員是上述研究工作的主要技術(shù)力量，

3、積累了較完整的技術(shù)資料，為羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程的制定奠定了相當(dāng)?shù)难芯抗ぷ骰A(chǔ)。三、制訂本標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程準(zhǔn)備階段：標(biāo)準(zhǔn)制定小組在接到制標(biāo)任務(wù)后，由項(xiàng)目負(fù)責(zé)人牽頭開(kāi)展對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)資料的查閱、實(shí)驗(yàn)耗材和試劑的準(zhǔn)備；并及時(shí)與參與單位進(jìn)行交流，為項(xiàng)目的順利完成做好充分的準(zhǔn)備工作；分工情況：本制標(biāo)任務(wù)由海南省水產(chǎn)研究所負(fù)責(zé)，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所協(xié)助完成。具體分工為海南省水產(chǎn)研究所負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立，包括臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷，初步建立完整的羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所對(duì)所建立的診斷方法進(jìn)行完善，并從實(shí)際應(yīng)用方面進(jìn)行了驗(yàn)證。標(biāo)準(zhǔn)草案編寫(xiě)情況：本標(biāo)準(zhǔn)草案經(jīng)過(guò)準(zhǔn)備、設(shè)計(jì)

4、、建立、優(yōu)化和驗(yàn)證等幾個(gè)階段，結(jié)果證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)中所制定的方法，內(nèi)容完整，可操作性和實(shí)用性強(qiáng)，能夠滿足羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)需求，而后根據(jù)gb/t 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第一部份：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)和海南地方標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)草案的編寫(xiě)工作，完全按照規(guī)范術(shù)語(yǔ)編寫(xiě)，達(dá)到使用者簡(jiǎn)單易懂、方法結(jié)果能夠溯源的目的。四、主要起草人及其承擔(dān)的任務(wù)： 王德強(qiáng) 標(biāo)準(zhǔn)編制組主持人。負(fù)責(zé)項(xiàng)目組織實(shí)施，制定方案，執(zhí)筆“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”，撰寫(xiě)編制說(shuō)明。 可小麗 標(biāo)準(zhǔn)編制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。 劉志剛 標(biāo)準(zhǔn)編制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。 佟延南 標(biāo)準(zhǔn)編

5、制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。李芳遠(yuǎn) 標(biāo)準(zhǔn)編制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。盧邁新 標(biāo)準(zhǔn)編制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。高鳳英 標(biāo)準(zhǔn)編制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。朱華平 標(biāo)準(zhǔn)編制組成員 參與“羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)規(guī)程”工作。五、標(biāo)準(zhǔn)制定的原則和依據(jù)制定原則：1、本標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)規(guī)則遵循gb/t1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編號(hào)規(guī)則及gb/t1.2-2002標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第二部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法。2、標(biāo)準(zhǔn)必須實(shí)用，其所函蓋的內(nèi)容應(yīng)適合我省的實(shí)際情況，編寫(xiě)內(nèi)容上簡(jiǎn)明、準(zhǔn)確、通

6、俗、易懂，真正能指導(dǎo)生產(chǎn)。3、本標(biāo)準(zhǔn)在總結(jié)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，多次組織有關(guān)病害專家進(jìn)行研討，進(jìn)行綜合分析確定了本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)數(shù)據(jù)。制定依據(jù)：本標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照gb/t 1.12009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則的技術(shù)要求進(jìn)行編制起草。六、本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容說(shuō)明1、羅非魚(yú)鏈球菌?。?）病原體無(wú)乳鏈球菌（streptococcus agalactiae）、海豚鏈球菌（streptococcus iniae）。（2）流行情況在我國(guó)南方羅非魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)，一年四季均有流行，尤其是510月高溫期，水溫30以上時(shí)為爆發(fā)高峰期，對(duì)各種規(guī)格羅非魚(yú)均可造成危害。2、設(shè)備、藥品選擇參照gb/t 4789.28 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色

7、法、培養(yǎng)基和試劑和sc/t 7201.1 魚(yú)類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程 第1部分：通用技術(shù)選擇設(shè)備和藥品。3、采集樣品依據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范，對(duì)患病的羅非魚(yú)進(jìn)行樣品采集。4、臨床診斷對(duì)樣品的活動(dòng)情況、體表、及其內(nèi)臟進(jìn)行觀察、檢測(cè)。病魚(yú)一般活動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，食欲減退，獨(dú)游，嚴(yán)重時(shí)，常以螺旋狀游于水面。體表發(fā)黑，角膜發(fā)白渾濁、眼球腫大突出，虹膜充血，嚴(yán)重的可見(jiàn)眼球脫落；下頜、鰓蓋邊緣、鰭條基部不同程度的充血、出血，伴有肛門(mén)紅腫、外突的現(xiàn)象。解剖內(nèi)臟，肝臟充血、腫大，顏色不均，呈花肝狀，質(zhì)地脆弱；腦部組織軟化；膽囊充盈、充滿藍(lán)黑色的膽汁；部分患病魚(yú)體表現(xiàn)為腹水，腸道有輕度

8、的充血和炎癥，腸腔內(nèi)有少量黃色的粘液。5、實(shí)驗(yàn)室診斷（1）、病原菌分離、培養(yǎng)采集病魚(yú)的眼、鰓絲、肝臟、脾臟、腎臟、血液和腦組織等器官的組織液接種于血瓊脂平板，在28 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h48 h。最后，挑去單菌落，接種于一新的血瓊脂平板上，在28 條件下倒置培養(yǎng)24 h。 （2）、生理生化檢驗(yàn) 按照常規(guī)方法對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、生長(zhǎng)試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和馬尿酸鈉水解試驗(yàn)。依照gb/t 4789.28 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑的要求接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、v-p試驗(yàn)和糖類分解試驗(yàn)（3）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）監(jiān)測(cè)參照廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的分離鑒定

9、與特性分析(1)（2010年，盧邁新等）和雙重pcr快速鑒別無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌（2010，黎炯等）等研究報(bào)告及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)分離的樣品進(jìn)行pcr檢測(cè)。4、細(xì)菌致病性實(shí)驗(yàn) 首先，若培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落類型清楚，選擇其優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行培養(yǎng)；若不清楚，應(yīng)選擇不同類型分別培養(yǎng)。然后選擇與被檢樣品同齡、同規(guī)格，同時(shí)血清為陰性的健康羅非魚(yú)采用肌肉（或腹腔）注射（或涂抹、浸泡）方式對(duì)魚(yú)體進(jìn)行人工感染，并觀察實(shí)驗(yàn)魚(yú)24 h168 h的反應(yīng)。最后若出現(xiàn)于自然鏈球菌病發(fā)病癥狀相同的菌落，為致病菌落。5、 綜合判定依據(jù)的建立通過(guò)運(yùn)用本標(biāo)準(zhǔn)所建立的針對(duì)羅非魚(yú)海豚鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的細(xì)菌分離鑒定方法，從臨床癥狀、病原分離培養(yǎng)

10、、菌體染色、生化實(shí)驗(yàn)到分子生物學(xué)鑒定方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床羅非魚(yú)樣品相對(duì)系統(tǒng)和完整的病原分析和鑒定過(guò)程。根據(jù)海豚鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的病原特性，在標(biāo)準(zhǔn)中，還給出了羅非魚(yú)海豚鏈球菌病和無(wú)乳鏈球菌病的綜合判斷依據(jù)。七、與現(xiàn)行法律、法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)的編制依據(jù)與現(xiàn)行的法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定相一致。八、標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議本標(biāo)準(zhǔn)的制定旨在規(guī)范我省羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)技術(shù)，提高羅非魚(yú)鏈球菌病檢測(cè)速度和準(zhǔn)確度。標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)施過(guò)程中根據(jù)海南省級(jí)相關(guān)法規(guī)與強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的繼續(xù)完善，相關(guān)指標(biāo)、內(nèi)容可根據(jù)國(guó)內(nèi)外魚(yú)類細(xì)菌性疾病檢測(cè)技術(shù)研究的進(jìn)展適時(shí)予以重新界定。九、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)

11、布后，應(yīng)廣泛組織宣傳和貫徹，建議在有關(guān)水產(chǎn)刊物上發(fā)布，同時(shí)在我省羅非魚(yú)養(yǎng)殖行業(yè)中執(zhí)行本標(biāo)準(zhǔn)，尤其進(jìn)行羅非魚(yú)病害檢測(cè)的有關(guān)單位和個(gè)人，在病害檢測(cè)過(guò)程中，必須嚴(yán)格按本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范進(jìn)行。參考文獻(xiàn)譚晶晶,陳昌福,高宇等.奧尼羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的鑒定、致病性及藥物敏感性研究j.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2010,29(6)745-751張俊,周素明,李安興.廣東省養(yǎng)殖羅非魚(yú)、海鱸、尖吻鱸海豚鏈球菌感染調(diào)查j.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué).2012,19(1)盧邁新,黎炯，葉星等.廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的分離、鑒定與特性分析(1)j.微生物學(xué)報(bào).2010,37(5)鄧顯文,謝芝勛,謝志勤等.廣西羅非魚(yú)海豚鏈球菌的分離鑒定j.

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