大豆皮中過氧化物酶的提取

1、摘要 2關(guān)鍵詞 2abstract 3key words 3前言 41 材料與方法 51.1 試驗(yàn)材料 51.1.1 主要儀器及耗材 51.1.2 主要試劑 51.1.3 原材料 51.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 51.2.1 過氧化物酶的提取工藝流程 51.2.2 酶活測定 51.2.3 放置時(shí)間對酶活影響 61.2.4 單因素試驗(yàn) 61.2.5 正交試驗(yàn) 72 結(jié)果與分析 72.1 酶活測定 72.2 放置時(shí)間對酶活影響 92.3 單因素試驗(yàn) 92.3.1 液料比對酶活的影響 92.3.2 提取時(shí)間對酶活的影響 102.3.3 提取液濃度對酶活的影響 112.3.4 提取溫度對酶活的影響 112.3.5

2、 提取次數(shù)對酶活的影響 123 討論 143.1 關(guān)于酶活測定方法的思考 143.2 關(guān)于酶液稀釋方法的思考 143.3 關(guān)于單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化的思考 143.4 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 153.5 本實(shí)驗(yàn)的存在的問題及改進(jìn) 15參考文獻(xiàn) 15致謝 16大豆皮中過氧化物酶的提取摘要過氧化物酶peroxidase, pod ， ecl.11.1.7(x) 是一類以血紅素為輔基的酶，在生物中廣泛存在， 具有多種不同的生物功能， 主要催化h2o2 和有機(jī)過氧化物對多種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化作用。它在蛋白質(zhì)、多肽、激素、病毒、寄生蟲、 生物降解及神經(jīng)系統(tǒng)等方面都有應(yīng)用，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本課

3、題以大豆皮為原料，對大豆皮中提取過氧化物酶的工藝進(jìn)行研究。通過單因素試驗(yàn)考察不同液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、提取液體積等對酶活的影響，并選取單因素試驗(yàn)中影響最明顯的 3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果顯示， 液料比、提取時(shí)間、提取溫度這三個(gè)因素對提取效果明顯。然后對此三因素進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：液料比 20ml/g ，提取時(shí)間 5h ，提取溫度 40下，提取效果很好。雖然正交驗(yàn)證試驗(yàn)不是最好的一組，但考慮到誤差存在，可視為最適組合。關(guān)鍵詞大豆皮，過氧化物酶，提取extraction of peroxidase in soybean hullsabstractperoxidase pod ,

4、 ecl.11.1.7(x)is a kind of redox enzyme vi with hemoglobin as prostheric group, which widely exists in organism and has many different biological fimctions . it mainly catalyzes the oxidation of hydrogen peroxide and organic peroxide with many inorganic and organic substances. for the high specifici

5、ty and sensitivity , it is widely applied in protein , polypepfide , hormone, virus , parasite, lignification , biology degradation andneuro-system etc . the soybean hulls as raw materials, to study the extraction process of peroxidase in soybean skin . effects of different ratio of liquid to materi

6、al, extraction time, extraction temperature, extraction times, extraction volume effects on enzyme activity through the single factor experiment, and select the 3 most significant factors in the orthogonal test of single factor test . the results show, solid-liquid ratio, extraction time, extraction

7、 of these three factors on the extraction effect of temperature obviously . then the three factors of the orthogonal experiment results showed: liquid ratio 20ml/g, extraction time 5h, extraction temperature 40 c, extraction, the effect is very good . although the orthogonal results is not the best

8、one group, but considering the error exists, can be regarded as the most suitable combination .key wordssoybean hull , peroxidase, extraction刖百過氧化物酶peroxidase， pod， ecl ， 11 1 7(x) 是一類廣泛存在于各種植物、動物和微生物體內(nèi)的氧化還原酶，催化過氧化氫和有機(jī)過氧化物對各種有機(jī) 物和無機(jī)物的氧化作用。其分子量范圍為 35000 100000，其中含鐵過氧化物酶是一類結(jié)構(gòu)相似、功能相同的酶。迄今被研究最深入的應(yīng)首推辣根過氧

9、化物酶(horseradish peroxidase, hrp)。早在1940年,thorell 即用電泳方法從部分春花的辣根組織中區(qū)分出 2 種不同的 hrp， 之后此酶在植物正常和應(yīng)激反應(yīng)代谫 中發(fā)揮重要作用而受到廣泛關(guān)注， 并對此酶進(jìn)行了大量研究， 涉及酶的種類、等電點(diǎn)、氨基酸組成和序列、生理功能，以及基因表達(dá)和調(diào)控的分子機(jī)制等，迄今此酶作為一種商品化試劑也廣泛用于免疫組織化學(xué)、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)反應(yīng)和免疫印跡等生物學(xué)研究，并成為重要的滲斷試劑。現(xiàn)在，科學(xué)家已然對大豆皮過氧化物酶開始重視了，也做過相應(yīng)的性質(zhì)研究。大豆皮是大豆制油工藝的副產(chǎn)品，占整個(gè)大豆體積的10 ，占整個(gè)大豆重量的8 。大豆

10、皮主要是大豆外層包被的物質(zhì)，顏色為米黃色或淺黃色，由油脂加工熱法脫皮或壓碎篩理兩種加工方法所得，主要成分是細(xì)胞壁和植物纖維，粗纖維含量為 38，粗蛋白12 2，氧化鈣0 53，磷 0 18，木質(zhì)素含量低于2(nrc 1996) 。從大豆皮組成可知，大豆皮富含纖維素等非淀粉多糖，是一種天然膳食纖維源。據(jù)資料介紹，作為膳食纖維豆皮有其獨(dú)特的生理活性，且其中所含的鐵不但含量高，并以二價(jià)鐵離子形式穩(wěn)定存在不被氧化，因此大豆皮也是人類膳食鐵的一個(gè)重要來源。基于此，國內(nèi)外對大豆皮開發(fā)重點(diǎn)也在于飼料和膳食纖維的加工利用上。我國是大豆生產(chǎn)國，年產(chǎn)量1500 萬噸以上，隨著我國大豆榨油工業(yè)的發(fā)展和對豆粕需要量的

11、增加，我國每年要進(jìn)口大量的大豆，估計(jì)產(chǎn)生大豆皮240 萬噸，隨著全國大豆產(chǎn)量和加工能力不斷提高，作為副產(chǎn)品的大豆皮產(chǎn)量是非?？捎^的。因此如何進(jìn)行大豆皮綜合利用和開發(fā)，以提高大豆加工的效益，生產(chǎn)出高附加值的產(chǎn)品正日益受到人們的重視。大豆皮過氧化物酶(soybean hull peroxidase ， shp， ecl 11 1 7)是從大豆加工副產(chǎn)品豆皮或豆莢中提取的一類具有很高活性的酸性同工酶。自九十年代中期開始，人們對大豆皮過氧化物酶的研究逐漸重視起來。目前，國內(nèi)對大豆皮過氧化物酶的研究還局限在提取分離方面，對酶的固定化和應(yīng)用方面研究甚少。而國外的研究已經(jīng)深入到酶的基因改造和分子修飾方面，對

12、應(yīng)用方面的研究也較多，主要在工業(yè)“三廢”處理方面22 。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 主要儀器及耗材722s 分光光度計(jì)hh-s 6 數(shù)顯恒溫水浴鍋fa2104b 電子天平150ml 三角瓶， 100ml 量筒， 1l 量筒， 50ml 三角瓶， 10ml 移液管，試劑瓶，試管等。1.1.2 主要試劑愈創(chuàng)木酚99%過氧化氫30%na2hpo4 12h2onah2po4 2h2o95% 乙醇1.1.3 原材料黃豆（市售）1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.2.1 過氧化物酶的提取工藝流程磷酸緩沖液5000 r/min分光光度法j jj粉碎- 過篩（60目）-稱量浸取-離心-收集-測定酶活1.2.2

13、酶活測定酶活力的測定方法：有兩種主要方法即終止反應(yīng)法和連續(xù)反應(yīng)法。本實(shí)驗(yàn)以每min 光密度（ od470nm ）變化 0.01 為 1 個(gè)過氧化物酶活力單位，是用連續(xù)反應(yīng)法測定的。1.2.2.1 測定原理：過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實(shí)驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底物，在此酶存在下，h2o2 可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，其反應(yīng)為：愈創(chuàng)木酚+過氧化氫 -4-鄰甲氧基苯酚 +水本實(shí)驗(yàn)用紫外吸收法測定產(chǎn)物4-鄰甲氧基苯酚在470nm 光吸收增加值表示產(chǎn)物增加量，劃出光吸收-時(shí)間

14、的速度曲線，求出曲線的斜率，即酶促反應(yīng)初速度，再換算為酶活力。1.2.2.2 試劑配制：4%愈創(chuàng)木酚（現(xiàn)配）：用移液槍取6ml 愈創(chuàng)木酚原液加入到干凈試劑瓶中，之后加入14.4ml95%乙醇，用移液槍混合均勻備用。1%過氧化氫（現(xiàn)配）：用移液槍取5ml 過氧化氫原液加入到干凈試劑瓶中，之后加入14.5ml水，用移液槍混合均勻備用。0.2mol/lna2hpo4母液a的配制：稱取 na2hpo4 i2h2o 7.16g于150ml三角瓶中，先用小量蒸餾水溶解后定容至100ml 。0.2mol l- 1 nah2po4母液b的配制：稱取nah2po4 - 2h203.12g于150ml三角瓶中，先

15、用小量蒸餾水溶解后定容至100ml 。系列ph值的磷酸緩沖液（pbs）的配制方法： a液x ml + b液y ml表1-1 pbs配制表table1-1 pbs preparationxyphxyph6.593.55.755.045.06.98.092.05.861.039.07.010.090.05.967.033.07.112.387.76.072.028.07.215.085.06.177.023.07.318.581.56.281.019.07.422.577.56.384.016.07.526.573.56.487.013.07.631.568.56.589.510.57.737.5

16、62.56.691.58.57.843.556.56.793.07.07.949.051.06.894.75.38.0其余不同濃度磷酸緩沖液（pbs）皆可由0.2mol/l pbs稀釋至需要濃度。1.2.2.3測定方法：首先先將提取的酶液稀釋到合適的倍數(shù)，之后取兩支干凈的試管，加入反應(yīng)混合液（ph7.0 0.02mol/l pbs緩沖液，愈創(chuàng)木酚，過氧化氫），配方（見表1-2）：表1-2反應(yīng)物混合表table1-2 the reaction mixture號磷酸緩沖液（ml）2%過氧化氫（ml）4%愈創(chuàng)木酚溶液（ml）蒸儲水/酶液（ml）od470nmck2.91.01.00.1調(diào)零測定管2.

17、91.01.00.1?加入反應(yīng)液后，先將試管置于15c水浴鍋中預(yù)熱10min,用移液槍吸取酶液，加入到試管中計(jì)時(shí)，前45s在水浴鍋中預(yù)熱，之后將試管中液體轉(zhuǎn)移至比色皿中，立即放置于分光光度計(jì) 中，記錄1min的吸光值，此后每半分鐘幾次一次吸光值，直到吸光值的變化減弱時(shí)即可結(jié)束 實(shí)驗(yàn)。以吸光值（a）為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，即可得到酶促反應(yīng)的速度曲線，根據(jù)公 式可算得酶活。再根據(jù)換算可算出比活。過氧化物的活力od470nm d0.01 t以l g大豆皮提取的總酶活為指標(biāo)，根據(jù)換算可算出比活。比活酶活原料質(zhì)量提取液體積, 0.1為酶液的添加量。0.11.2.3 放置時(shí)間對酶活影響取同一酶液，

18、測定放置不同時(shí)間（1h6h）后的酶活，作出放置時(shí)間對酶活影響的曲線, 確定單因素試驗(yàn)中的提取方案。1.2.4 單因素試驗(yàn)以l g大豆皮提取的總酶活為指標(biāo)，選定液料比、提取溫度、提取時(shí)間、提取液濃度、提 取次數(shù)為考察因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。1.2.4.1 液料比對酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮 0.5g于50ml三角瓶中，加入濃度為0.02mol/l ph7.0緩沖液，常 溫下提取 4h ,平行一組，液料比分別為： 10ml/g、15ml/g、20ml/g、25ml/g、30ml/g ,提 取完畢后轉(zhuǎn)移至離心管中離心 10min后測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.2 提取時(shí)間對酶活的影響準(zhǔn)確稱取

19、粉碎后大豆皮 0.5g于50ml三角瓶中，加入濃度為 0.04mol/l ph7.0的pbs緩 沖液10ml,常溫下提取，平行一組，提取時(shí)間分別為3h、4h、5h、6h, 7h,提取完畢后轉(zhuǎn)移至離心管中離心 10min后測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.3 提取液濃度對酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮 0.5g于50ml三角瓶中，加入不同濃度濃度的pbs緩沖液10ml,常溫下，提取時(shí)間為5h,平行一組，緩沖液濃度：0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l ,提取完畢后轉(zhuǎn)移至離心管中離心后10min測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.

20、4 提取溫度對酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮 0.5g于50ml三角瓶中，加入濃度為0.02mol/l ph7.0緩沖液10ml,封上封口膜，作好水位線，提取5h,平行一組，提取溫度為20c、30c、40c、50c、 60c,提取完畢后，加蒸儲水至水位線，再轉(zhuǎn)移至離心管中離心10min后測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.5 提取次數(shù)對酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮 0.5g于50ml離心管中，力口入濃度為 0.04mol/l ph7.0的pbs緩 沖液10ml,常溫下提取5h,平行一組，采取不同的提取次數(shù)，如 1、2、3、4、5等。提取 完畢后離心10min測定其酶活，作圖研究曲線。1.2

21、.5 正交試驗(yàn)1.2.5.1 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提取溫度、提取液濃度、3個(gè)因素，分另記為 a、b、c, l9（33）安排試驗(yàn)。為了減少誤差對本試驗(yàn)進(jìn)行分析，影響提取效果的因素很多，例如液料比、 提取時(shí)間、提取時(shí)間等。從中選取單因素試驗(yàn)中影響最明顯的 進(jìn)行三因素正交試驗(yàn)，每個(gè)因素均取三個(gè)水平。利用正交表 干擾，9組試驗(yàn)全部平行一組。其它條件為單因素最佳條件。1.2.5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證本試驗(yàn)為3因素3水平的試驗(yàn)，按試驗(yàn)要求，須進(jìn)行33=27種組合的試驗(yàn)。而按l9（3 3）正交表按排試驗(yàn)，只需作9次試驗(yàn)。為了保證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，從 9個(gè)正交試驗(yàn)組合中，選取提取效果最好的試驗(yàn)（記為試驗(yàn)a）與

22、正交試驗(yàn)所得出的理論最優(yōu)水平組合（記為試驗(yàn)b）,然后將兩者的優(yōu)劣進(jìn)行對比，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果是否可靠。2結(jié)果與分析2.1酶活測定酶液稀釋合適的倍數(shù)（25倍），加入反應(yīng)液中，置于吸光光度計(jì)中，記錄數(shù)據(jù)。表2-1吸光度隨時(shí)間的變化table 2-1 the change in absorbance with time011.522.533.544.5500.070.1230.1820.2440.3070.3630.4150.4640.5085.566.577.588.599.5100.5490.5820.6140.6430.6660.6890.7070.7220.7330.743圖2-1-1酶促反應(yīng)

23、的速度曲線fig 2-1-1 velocity curve of enzymatic reaction時(shí)間(t)圖2-1-1每分鐘下酶液顏色的變化fig .2-1-1 each minute of enzyme solution color change根據(jù)酶催化反應(yīng)速度曲線，能夠真正代表酶活性大小的是線性期的酶促反應(yīng)速度，即酶促反 應(yīng)初速度。 酶活性測定時(shí)首先要確定線性期，在此期測定反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確代表酶活性。酶 剛開始參加反應(yīng)時(shí)，速度比較慢，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，速度加快，一般在底物濃度足夠的條件 下，酶在催化反應(yīng)中會達(dá)到最大反應(yīng)速度，保持一定時(shí)間后，速度又會慢慢變小，其原因主 要為底物減少和酶

24、在反應(yīng)過程中自身失活，最大反應(yīng)速度持續(xù)時(shí)間的多少與酶本身的特性有 關(guān)。由此可見，線性期應(yīng)選擇1.5min 3min,以此區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)，作出直線，進(jìn)而求得斜率,就可以得到酶活及比活。圖2-1-2線性期的反應(yīng)曲線5 2 5 2 0/0 o o)0光吸05o6fig 2-1-2 the linear phase response curve由圖可知，此圖線的 r2為0.9998;當(dāng)r2 0.99時(shí)，則可以認(rèn)為這些點(diǎn)位于一條直線上。斜率為0.1228,進(jìn)而可以計(jì)算出酶活和比活。酶活=0.1228*25/0.01=307 u比活=（307*10） / （0.5*0.1 ） =61400 u/g2.2 放置

25、時(shí)間對酶活影響選取某次實(shí)驗(yàn)剩余酶液，稀釋合適的倍數(shù)（20倍），測定同一酶液在常溫下放置不同時(shí)間段下 的酶活。表2-2放置時(shí)間對比活影響table 2-2 the place time effect on enzyme activity時(shí)間（h）01246比活（u/g4496042800400003520031040圖2-2放置時(shí)間對比活影響fig 2-2 the place time effect on enzyme activity由圖可知。比活隨時(shí)間的變化大致成線性關(guān)系，且每小時(shí)下降2300左右各單位。因此，后續(xù)的提取工作，均需要錯(cuò)開時(shí)間段進(jìn)行提取，時(shí)間間隔為半小時(shí)。2.3 單因素試驗(yàn)2.

26、3.1液料比對酶活的影響表2-3-1液料比對酶活的影響table 2-3-1 liquid ratio of enzyme activity液料比（ml/g）1015202530比活（u/g5468459475652405476038115圖2-3-1液料比對酶活的影響fig 2-3-1 liquid ratio of enzyme activity由圖可知，隨著液料比的增大，提取酶的活力是增大的，當(dāng)液料比達(dá)到 20ml/g時(shí)，酶的活力達(dá)到最大，隨著液料比的繼續(xù)增加，酶的活力反而有所下降。因此，采用液料比為20ml /g較適宜。2.3.2 提取時(shí)間對酶活的影響表2-3-2提取時(shí)間對酶活的影響t

27、able 2-3-2 effect of extraction time on enzyme activity時(shí)間（h）34567比活（u/g5025056850580005380046950圖2-3-2提取時(shí)間對酶活的影響fig 2-3-2 effect of extraction time on enzyme activity時(shí)間（h）由圖可知，隨著提取時(shí)間的增長，酶的活力升高，5h時(shí)達(dá)到最大，5h后酶活反而下降。其原因可能是酶溶解的量隨著時(shí)間的增加而增加，5h時(shí)溶解量達(dá)到最大，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加酶可能會失活或者分解，此時(shí)溶出量小于失活或分解的量，所以酶的活力下降。因此，采用提取時(shí)間5h較

28、為適宜。2.3.3 提取液濃度對酶活的影響表2-3-3提取液濃度對酶活的影響table 2-3-3 effect of extract concentration on enzyme activity提取液濃度（mol/l） 0.010.020.030.040.05比活（u/g）5560056850591006365057175圖2-3-3提取液濃度對酶活的影響650006400063000）62000 gu 61000（60000審 5900058000570005600055000fig 2-3-3 effect of extract concentration on enzyme act

29、ivity提取液濃度(mol/l)由圖可知，隨著提取液濃度的升高酶活力增加，在0.04mol/l時(shí)達(dá)到最大，隨著濃度的繼續(xù)升高，酶活力下降。因此，采用提取液濃度為0.04mol/l比較為適宜。表2-3-4提取溫度對酶活的影響table 2-3-4 effect of extraction temperature on enzyme activity溫度（c）2030405060比活（u/g）6315076860642605505048150圖2-3-4提取溫度對酶活的影響2.3.4 提取溫度對酶活的影響fig 2-3-4 effect of extraction temperature on

30、enzyme activity溫度（）由圖可知，隨著溫度的升高酶的活力不斷增加。當(dāng)提取溫度達(dá)到30c以后，酶活力驟降。其原因可能是隨著溫度升高酶的溶解性升高，但是超過30c以后，高溫使得酶失活，所以酶的活力驟降。因此，采用 30 c為提取適宜溫度。2.3.5 提取次數(shù)對酶活的影響表2-3-5提取次數(shù)對酶活的影響table 2-3-5 effect of extracting times on enzyme activity提取次數(shù) 12345比活（u/g）447202968058722784956圖2-3-5提取次數(shù)對酶活的影響fig 2-3-5 effect of extracting ti

31、mes on enzyme activity由圖可知，提取第 2次后，還有3萬左右的比活，到第 3次卻只有6千比活，因此最適提取 次數(shù)應(yīng)取2次；但是提取次數(shù)增加勢必會延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間，增加實(shí)驗(yàn)量，在本實(shí)驗(yàn)中不適用， 故提取次數(shù)仍用1次。2.4 正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果分析：本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯窟^氧化物酶的最適提取條件，以提高酶的提取率，是以酶 活作為檢測指標(biāo)的。根據(jù)單因素結(jié)果可知，液料比、提取溫度、提取時(shí)間對提取效果影響較 大，因此選用這 3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其他因素皆選用最適條件：提取液 濃度(0.04mol/l)、提取次數(shù)(1次)。正交試驗(yàn)完畢后，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析， 確定最優(yōu)組合

32、。表2-4正交試驗(yàn)極差分析表table 2-4試驗(yàn)號溫度a(c)液料比b (ml/g)提取時(shí)間c(h)比活11 (20)1 (15)1 (4)4968021 (20)2 (20)2 (5)5350031 (20)3 (25)3 (6)5100042 (30)1 (15)2 (5)7527652 (30)2 (20)3 (6)5628062 (30)3 (25)1 (4)5406373 (40)1 (15)3 (6)6949883 (40)2 (20)1 (4)6408093 (40)3 (25)2 (5)63500k1154180194454167823k2185619173860192276

33、k3197078168563176778k151393.364818.055940.8k261872.857953.364092.0k365692.756187.558926.0極差r14299.38630.58151.2主次順序abc優(yōu)水平a3b1c2優(yōu)組合a3b1c2驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：從9個(gè)正交試驗(yàn)組合中，選取提取效果最好的4號試驗(yàn)（試驗(yàn)a）的發(fā)酵條件與正交試驗(yàn)所得出的理論最優(yōu)水平組合（試驗(yàn)b）進(jìn)行試驗(yàn)，對比兩者的優(yōu)劣，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果是否可靠。驗(yàn)證試驗(yàn)：a3b1c240011.522.533.5400.0820.1360.1970.2570.3170.370.42比活72600a3b1c24

34、0倍011.522.533.5400.0820.1430.2080.2720.3320.3960.451比活75600相對誤差0.039比活（平均）74100通過對比發(fā)現(xiàn)試驗(yàn) b略小于實(shí)驗(yàn)a，考慮到正交試驗(yàn)有一定的遺漏性以及誤差的存在（實(shí)驗(yàn)誤差小于10%皆可認(rèn)為是合理的，數(shù)據(jù)直接取平均值），可以認(rèn)為正交試驗(yàn)結(jié)果基本是可靠。因此最適組合應(yīng)為：提取溫度 40 c,液料比15 ml/g,提取時(shí)間5h,提取液濃度0.04 mol/l , 提取次數(shù)1次。3討論3.1 關(guān)于酶活測定方法的思考酶活的測定方法有很多，常見的有比色法，還原糖法，免疫學(xué)法，比濁法等。本實(shí)驗(yàn)是 用愈創(chuàng)木酚與過氧化物酶的顯色反應(yīng)來進(jìn)行

35、檢測的，屬于比色法。比色法又根據(jù)對酶促反應(yīng) 時(shí)間的選擇不同分為固定時(shí)間法和連續(xù)監(jiān)測法。這兩種方法又有各自的適用條件以及優(yōu)缺點(diǎn)。固定時(shí)間法，操作簡單但是難以確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。連續(xù)監(jiān)測法，能 動態(tài)觀測酶促反應(yīng)進(jìn)程，可以明顯地找到反應(yīng)的線性期，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少， 可在較短時(shí)間內(nèi)完成測定。本實(shí)驗(yàn)初期，采用的是固定時(shí)間法，實(shí)驗(yàn)過程中卻發(fā)現(xiàn)一個(gè)嚴(yán)重 的問題一一反應(yīng)液的顏色變化無法停止，反應(yīng)開始時(shí)，反應(yīng)液顏色逐漸加深，反應(yīng)結(jié)束時(shí)， 反應(yīng)液顏色又在逐漸褪去，最終變?yōu)闊o色。經(jīng)過反復(fù)思考以及詢問導(dǎo)師的幫助，出現(xiàn)此問題 的原因可能是酶促反應(yīng)的產(chǎn)物不穩(wěn)定，極易分解轉(zhuǎn)而又生成反應(yīng)物，使

36、得反應(yīng)液褪色。此外， 固定時(shí)間法要確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期才可以使用，通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)，才發(fā)現(xiàn) 本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)曲線前期不處于線性期，因此也應(yīng)該將測定方法改為連續(xù)監(jiān)測法。通過這個(gè)問題 也可以看出，并不是所有酶促反應(yīng)都可以用固定時(shí)間法進(jìn)行測定，要在詳細(xì)了解反應(yīng)過程的 前提下，選擇合適的測定方法。3.2 關(guān)于酶液稀釋方法的思考本實(shí)驗(yàn)初期采用蒸儲水一步稀釋法，即從原酶液一步稀釋到所需倍數(shù)。但是，測定酶活時(shí)， 發(fā)現(xiàn)平行試驗(yàn)誤差能達(dá)到 30%后經(jīng)老師指導(dǎo)，平行試驗(yàn)誤差大的原因可能有兩點(diǎn)：一、蒸儲 水的ph偏酸性，可能影響稀釋后的酶活。二、稀釋方法不當(dāng)，用來稀釋的原酶液不具有代表 性。根據(jù)以上兩點(diǎn)，對稀

37、釋方法進(jìn)行改進(jìn)。其一，酶液稀釋改用ph7.0 pbs緩沖液；其二，采用兩步稀釋法，即將要所稀釋的倍數(shù)改用該倍數(shù)的因數(shù)，分兩次進(jìn)行稀釋，如需要稀釋20倍，則先稀釋5倍，再稀釋4倍。3.3 關(guān)于單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化的思考本課題是研究過氧化物酶的提取，影響提取效果的因素很多，如不同液料比、提取時(shí)間、 提取溫度、提取次數(shù)、提取液體積等。試驗(yàn)中對各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。從單因素試驗(yàn)結(jié)果 可以看出，液料比、提取時(shí)間、提取溫度這三個(gè)因素對酶活的影響最為顯著。相對而言，提取次數(shù)，提取液濃度對提取的效果影響不大。因此，最終液料比、提取時(shí)間、提取溫度為本試驗(yàn)的試驗(yàn)因素，分別記作a 、 b 、 c ，進(jìn)行正交試驗(yàn)

38、，各因素均取三個(gè)最優(yōu)水平。通過單因素試驗(yàn)，從若干單因素中找對提取效果影響最明顯的三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，縮小了試驗(yàn)范圍，提高了優(yōu)化效率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)就是安排多因素試驗(yàn)，用部分試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn)，通過對部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，了解全面試驗(yàn)的情況，尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。即在單因素測定出的最適初始條件下，分別將單因素的控制量在一定的范圍內(nèi)進(jìn)行重新設(shè)定組合。本試驗(yàn)為 3 因素 3水平的試驗(yàn)，按試驗(yàn)要求，須進(jìn)行33=27種組合的試驗(yàn)。按l9(3 3)正交表按排試驗(yàn)，只需作9次試驗(yàn)，顯然大大減少了工作量，提供了效率，而且對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析(見表2-4 ) ，可以得到各因素的對本試驗(yàn)的

39、影響大小，找到各因素的優(yōu)水平組合。試驗(yàn)中將優(yōu)水平組合與9組正交試驗(yàn)中的最優(yōu)組進(jìn)行比較，驗(yàn)證了優(yōu)水平組合的可靠性。3.4 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)原料選取：原料應(yīng)選擇顆粒較大且飽滿無雜色的黃豆，以便降低因原料差異而對實(shí)驗(yàn)造成的誤差。此外，大豆皮粉碎后，應(yīng)放置低溫保藏，以減少環(huán)境對過氧化物酶的影響。浸取操作：稱量好的大豆皮粉轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入 pbs 緩沖液后，三角瓶內(nèi)會留有氣泡，影響酶的提取。所以，加入緩沖液后，要輕輕搖晃三角瓶，待瓶中氣泡消除后，即可放置浸取。稀釋操作：酶液稀釋過程中，一定要用槍頭混合均勻，而且取液和混合要分別使用槍頭，不可混合使用，因?yàn)槊?xì)現(xiàn)象，會導(dǎo)致用于混合的槍頭會存有少許液體，進(jìn)而產(chǎn)生誤差。3.5 本實(shí)驗(yàn)的存在的問題及改進(jìn)原料：本次實(shí)驗(yàn)的原料獲取皆為手工勞作，工作量大，產(chǎn)率低，以致于之后實(shí)驗(yàn)都才用0.5g 原料提取，容易產(chǎn)生較大的誤差。 因此，原料生產(chǎn)應(yīng)該盡量采用機(jī)械化生產(chǎn)，提高產(chǎn)率，提高酶液提取率，降低因原料之間的差異所造成的誤差。提取：提取后所獲得的酶液成分復(fù)雜，理應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步純化，但是考慮到初始原料少，純化