番茄青枯病抗性兩個(gè)相關(guān)基因功能的初步鑒定

1、園 藝 學(xué) 報(bào) 2014，41（6）：10961104 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140123；修回日期：20140512 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171957）；廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（s2011030001410）；廣東省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（kbl11008） * 對(duì)本文同等貢獻(xiàn)者 * 通信作者 author for correspondence（e-mail：yhzhao15-503；tel 番茄青枯病抗性兩個(gè)相

2、關(guān)基因功能的初步鑒定 汪國(guó)平1,*，褚 夢(mèng)2,*，孔 杰2，陳馥瑩2，陳 煜2，趙亞華2,* （1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣州 510642；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642） 摘 要：對(duì)抗性番茄材料hawaii 7996分別接種強(qiáng)致病力青枯菌（rsh）和中等致病力青枯菌（rsm）后，利用雙向電泳技術(shù)找到了兩個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶l3和remorin 1蛋白。在利用攜帶八氫番茄紅素脫氫酶基因pds的trv重組病毒載體通過(guò)葉片浸潤(rùn)法證明vigs體系可行后，進(jìn)一步利用該技術(shù)沉默上述兩個(gè)蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)基因gst-l3和rem-1，并用半定量rt-pcr檢測(cè)沉默效果。結(jié)果表明，分別

3、沉默gst-l3和rem-1的番茄植株抗性減弱，在接種中等致病力青枯菌（rsm）后青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)都明顯高于對(duì)照植株，說(shuō)明基因gst-l3和rem-1與番茄對(duì)青枯病的抗性相關(guān)。 關(guān)鍵詞：番茄；青枯?。豢共⌒?；雙向電泳；vigs 中圖分類(lèi)號(hào)：s 641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a 文章編號(hào)：0513-353x（2014）06-1096-09 studies of two genes related to bacterial wilt resistance in tomato wang guo-ping1,*，chu meng2,*，kong jie2，chen fu-ying2，chen yu2，

4、and zhao ya-hua2,* （1college of horticulture，south china agricultural university，guangzhou 510642，china；2college of life sciences，south china agricultural university，guangzhou 510642，china） abstract：two-dimensional electrophoresis（2-de）was employed to analyze the comparative proteome from stems of r

5、esistant tomatohawaii 7996plants inoculated with medium virulent strain rsm and high virulent strain rsh. two differentially expressed proteins were identified to be glutathione s-transferase l3 and remorin 1 and the function of corresponding genes，gst-l3 and rem-1，were further studied. after confir

6、ming the effectiveness of vigs system with trv carrying the phytoene desaturase gene（pds），two targeted genes were individually silenced in hawaii 7996 using vigs method and their expression levels were checked by semi-quantitative rt-pcr. the results showed that the average disease incidence and dis

7、ease index of bacterial wilt on gst-l3 or rem-1 silenced plants increased significantly when challenging with rsm strain，indicating that these two genes are involved in the resistance of tomato to bacterial wilt disease. key words：tomato；bacterial wilt；resistance；two-dimensional electrophoresis；vigs

8、 番茄青枯?。╞acterial wilt）是番茄生產(chǎn)上的一種重要病害，其病原菌為青枯雷爾氏菌（ralstonia solanacearum）。番茄植株受到青枯菌侵染后，首先可觀測(cè)到植株出現(xiàn)萎蔫，然后整株植物會(huì)迅速枯 6期 汪國(guó)平等：番茄青枯病抗性兩個(gè)相關(guān)基因功能的初步鑒定 1097 萎死亡（allen，2007）。青枯病在世界各地均有發(fā)生，以熱帶、亞熱帶地區(qū)更為嚴(yán)重，中國(guó)長(zhǎng)江以南尤其是華南地區(qū)發(fā)生較為普遍，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致番茄等相關(guān)作物絕產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為番茄生產(chǎn)的制約因素（汪國(guó)平 等，2004）。明確寄主的抗病機(jī)理對(duì)病害防治、抗病育種具有重要的指導(dǎo)意義。 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（vir

9、us-induced gene silencing，vigs）是一種快速檢測(cè)基因功能的技術(shù)，即通過(guò)構(gòu)建攜帶目標(biāo)基因的重組病毒載體，沉默內(nèi)源基因的表達(dá)（lu et al.，2003）。該方法具有無(wú)需全長(zhǎng)的基因序列、無(wú)需轉(zhuǎn)基因植株、獲取表型快等諸多優(yōu)點(diǎn)，可高效、高通量地分析基因功能，已被廣泛應(yīng)用于植物基因功能的研究，在煙草、番茄、辣椒和豆類(lèi)等植物中均已成功建立了vigs體系（徐幼平 等，2008）。目前，基于煙草脆裂病毒（trv）的vigs載體已經(jīng)在番茄的葉片（ekengren et al.，2003）、花（fu et al.，2006）和果實(shí)（fu et al.，2005）中獲得良好的沉默效果。

10、 本研究中首先通過(guò)雙向電泳技術(shù)分離和分析了抗性番茄材料hawaii 7996在接種強(qiáng)致病力的青枯菌（rsh）和中致病力青枯菌（rsm）后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，再利用基于trv病毒的vigs體系，沉默在雙向電泳分析中得到的差異蛋白所對(duì)應(yīng)的基因，觀察番茄植株的青枯病抗性是否發(fā)生變化，驗(yàn)證這些基因是否為番茄青枯病抗性相關(guān)基因。 1 材料與方法 1.1 材料 番茄抗性材料hawaii 7996種植于光照培養(yǎng)室（溫度25 28 ，每日光照12 h）。vigs載體trv1（liu et al，2002）和trv2-lic（dong et al.，2007）來(lái)自于arabidopsis biological r

11、esource center，由美國(guó)耶魯大學(xué)dinesh-kumar s p惠贈(zèng)。中等致病力青枯菌（rsm）和強(qiáng)致病力青枯菌（rsh）保藏于本實(shí)驗(yàn)室，最初從廣東省番茄產(chǎn)區(qū)病株分離，農(nóng)桿菌gv3101由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王國(guó)英教授惠贈(zèng)。 1.2 方法 1.2.1 雙向電泳 取青枯菌rsh或rsm侵染24 h后的抗性番茄hawaii 7996的莖段，用苯酚法提取全蛋白（thiellement，2013）。為增加蛋白量，視植株大小取10 12株混合，將800 g的蛋白樣品溶入450 l水化上樣液（7 mol l-1尿素，2 mol l-1硫脲，質(zhì)量體積百分比為4%的chaps，40 mmol l-1 dt

12、t，質(zhì)量體積百分比為0.002%的溴酚藍(lán)），使用ge 21cm ipg 3-11非線性膠條在ge ettan ipgphor 3（ge healthcare）上進(jìn)行第一向等電聚焦。 然后將膠條在buffer a（0.1 mol l-1 tris-hcl，2% sds，6 mol l-1尿素，30% 甘油，0.1 mol l-1 dtt，ph 8.8）中平衡15 min，在buffer b（0.1 mol l-1 tris-hcl，2% sds，6 mol l-1尿素，30% 甘油，0.25 mol l-1碘乙酰胺，ph 8.8）中平衡15 min（gorg et al.，2000），之后進(jìn)行1

13、2.5% sds-page第二向電泳。用0.066%考馬斯亮藍(lán)g-250染色過(guò)夜，用水脫色至蛋白點(diǎn)清晰。 完成染色的雙向電泳凝膠經(jīng)過(guò)掃描保存圖像，圖像分析采用pdquest（version 8.0，bio-rad）軟件進(jìn)行，選擇差異倍數(shù)大于2.0的蛋白點(diǎn)，委托上海博苑生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。 1.2.2 vigs重組載體的構(gòu)建 用植物總rna提取試劑盒提取番茄葉片的總rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna，根據(jù)ncbi中提供的序列信息在pds基因和目的基因（x）的中間部位設(shè)計(jì)特異性引物（表1），在上、下游引物的5端分別加上與trv2-lic相對(duì)應(yīng)的lic（ligation-independent c

14、loning）接頭序列（dong et al.，2007）。1098 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 pcr擴(kuò)增體系（總20 l）：2 l 10 pcr buffer，2 l dntp（10 mmol l-1），0.1 l taq dna聚合酶（5 u l-1），1 l cdna，兩條引物（10 mol l-1）各1 l，12.9 l ddh2o。30個(gè)pcr循環(huán)。 擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物電泳后用凝膠回收試劑盒純化。用t4 dna聚合酶處理回收產(chǎn)物，反應(yīng)體系：6 l回收產(chǎn)物，0.5 l datp（100 mmol l-1），1 l 0.1% bsa，1 l 10 buffer，0.5 l t4 dna聚

15、合酶（5 u l-1），1 l ddh2o。反應(yīng)條件：22 35 min，70 20 min。同樣用t4 dna聚合酶處理被pst酶切后的trv2-lic載體，反應(yīng)體系：6 l回收產(chǎn)物，0.5 l dttp（100 mmol l-1），1 l 0.1% bsa，1 l 10 buffer，0.5 l t4 dna聚合酶（5 u l-1），1 l ddh2o。反應(yīng)條件：22 35 min，70 20 min（dong et al.，2007）。再將兩者進(jìn)行連接，1 l質(zhì)粒，6 l目的片段，65 2 min，22 10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5，用質(zhì)粒pcr及測(cè)序進(jìn)行鑒定。挑取陽(yáng)性克隆

16、，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，質(zhì)粒pcr鑒定。 載體trv2-lic-pds表示攜帶pds基因的重組載體，trv2-lic-x表示攜帶目的基因片段的重組載體。 表1 vigs引物序列 table 1 the primer sequences used for vigs tests 基因 gene genbank 登錄號(hào) genbank no. 引物序列（53） primer sequences 產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp fragment length f：cgacgacaagacccttttagatggtaatcctcctg pds m88683.1 r：gaggagaagagccctaccaatt

17、ccaacatagactg 453 f：cgacgacaagacccttccgtttcttctacctgatg gst-l3 xm_004249461.1 r：gaggagaagagccctcatagaatgcttataccaag 478 rem-1 nm_001247302.1 f：cgacgacaagaccctagctcctaaagaagtggtgg 591 r：gaggagaagagccctacaaaatgcaactcccaatc 注：下劃線的序列是lic接頭序列。 note：the nucleotides underlined are lic sequences. 1.2.3 農(nóng)桿菌接

18、種 將含有trv1、trv2-lic、trv2-lic-pds和trv2-lic-x的農(nóng)桿菌gv3101分別接種入lb液體培養(yǎng)基中，28 、200 r min-1過(guò)夜培養(yǎng)。取50 ml菌液于4 、5 000 r min-1離心10 min，收集菌體，加入一定體積的滲透液（10 mmol l-1 mes，10 mmol l-1 mgcl2，200 mmol l-1乙酰丁香酮），調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌懸浮液的od600 = 0.5 0.6。將含有trv1和trv2-lic（或重組載體）的農(nóng)桿菌懸浮液按11比例混勻，室溫放置3 h用于葉片浸潤(rùn)（li et al.，2013）。 取生長(zhǎng)3周的番茄苗，每組24株，設(shè)

19、置3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行trv病毒侵染：用2 ml去針頭的注射器吸取混合的農(nóng)桿菌懸浮液，從葉片背面將菌液壓注到葉片中，之后將幼苗置于暗處20 22 培養(yǎng)24 h，再于20 22 下光照培養(yǎng)。 1.2.4 青枯菌接種 在農(nóng)桿菌侵染15 d后，對(duì)番茄植株進(jìn)行青枯菌接種。對(duì)照組：trv1和trv2-lic空載體混合菌液浸潤(rùn)過(guò)的番茄植株；試驗(yàn)組：trv1和trv2-lic-x混合菌液浸潤(rùn)過(guò)的番茄植株。將青枯菌接種到tzc固體培養(yǎng)基葡萄糖5.0 g l-1，蛋白胨10 g l-1，酸水解酪蛋白1 g l-1，ttc（2,3,5氯化三苯基四氮唑）0.05 g l-1，瓊脂粉17 g l-1，ph 7.0上30 培

20、養(yǎng)2 d，挑取有致病力的單菌落接種到cpg液體培養(yǎng)基（葡萄糖5.0 g l-1，蛋白胨10 g l-1，水解酪蛋白1 g l-1，ph 7.0）中，于30 、180 r min-1培養(yǎng)2 d（劉丹 等，2011）。取菌液在4 、6 000 r min-1離心10 min，收集菌體，用無(wú)菌水重懸，并調(diào)節(jié)菌液至od600 = 0.3，采用傷根侵染法接種（lin et al.，2008）。接種5 d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病程度（0級(jí)：健全；1級(jí)：1 2葉片萎蔫；2級(jí)：3 5 葉片萎蔫；3級(jí)：大部分葉片萎蔫；4級(jí)：整株萎凋或主干萎蔫，即將枯死），分別在5、7和10 d調(diào)查統(tǒng)計(jì)，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)（李海濤 等，

21、2001）。 6期 汪國(guó)平等：番茄青枯病抗性兩個(gè)相關(guān)基因功能的初步鑒定 1099 1.2.5 半定量rt-pcr檢測(cè)沉默效果 農(nóng)桿菌侵染15 d后，取番茄植株上部葉片，提取總rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。對(duì)沉默的基因重新設(shè)計(jì)引物，保證每對(duì)引物中至少有一條引物在vigs目的片段之外（表2），進(jìn)行半定量rt-pcr，以番茄的actin基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè)目的基因與對(duì)照組相比是否表達(dá)量減少。為避免pcr產(chǎn)物量到達(dá)平臺(tái)期造成干擾，試驗(yàn)還分析了不同循環(huán)數(shù)pcr的產(chǎn)物量（chen et al.，2009）。 表2 半定量rt-pcr的引物序列 table 2 the primer sequences us

22、ed for semi-quantitative rt-pcr 基因 gene genbank 登錄號(hào) genbank no. 引物序列（53） primer sequences 產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp fragment length f：tgctggtcacaaaccgatac pds m88683.1 r：gaacacctcatctgtcaccct 447 f：atgcccttttgcacagcgtc gst-l3 xm_004249461.1 r：caacgaagggagcatacacg 442 f：ctcgaaagcactagttgt rem-1 nm_001247302.1 r：cacaca

23、aatgtaatctaac 546 actin u60480.1 f：ggtattgtgttggactctggtgatg 435 r：gtaccaccactgagcacaatgtttc 2 結(jié)果與分析 2.1 雙向電泳 圖1和圖2分別為rsm（致病力中等）、rsh（致病力強(qiáng)）侵染后的雙向電泳結(jié)果。 完成圖像采集和軟件分析后，切割差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示存在多個(gè)差異蛋白質(zhì)，圖1和圖2中方框a和b所示的2個(gè)差異點(diǎn)分別為remorin 1蛋白和谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶l3（glutathione s-transferase l3，gst-l3），hawaii 7996番茄植株中的表達(dá)量在rsm侵染

24、后明顯高于rsh侵染后。圖3為兩張雙向電泳圖的局部結(jié)果對(duì)比。因大量文獻(xiàn)報(bào)道它們與植物的抗病性密切相關(guān)，本試驗(yàn)中選定這兩個(gè)基因進(jìn)一步深入研究。 圖1 中等致病力青枯菌（rsm）侵染后番茄植株的蛋白質(zhì)雙向電泳圖 a：remorin 1；b：谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶l3。 fig. 1 the 2-de map of tomato plants inoculated with r. solanacearum strain rsm a：remorin 1；b：glutathione s-transferase l3. 1100 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 圖2 強(qiáng)致病力青枯菌（rsh）侵染后番茄植株的蛋白質(zhì)雙向電

25、泳圖 a：remorin 1；b：谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶l3。 fig. 2 the 2-de map of tomato plants inoculated with r. solanacearum strain rsh a：remorin 1；b：glutathione s-transferase l3. 圖3 不同致病力青枯菌侵染后番茄植株的雙向電泳圖的局部比較 fig. 3 the local contrast of 2-de map of tomato plants inoculated with two strains of r. solanacearum 2.2 重組載體的構(gòu)建 八氫番

26、茄紅素脫氫酶基因pds（phytoene desaturase）、雙向電泳結(jié)果中兩個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的目的基因glutathione s-transferase l3（gst-l3）和remorin 1（rem-1）經(jīng)pcr擴(kuò)增出的特異片段，用t4 dna聚合酶處理后連接到trv2-lic載體上，經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒pcr鑒定得到與目的基因的特異片段大小相符的條帶，再經(jīng)測(cè)序，結(jié)果證明trv2-lic-pds、trv2-lic-gst-l3和trv2-lic-rem-1重組載體構(gòu)建成功。 6期 汪國(guó)平等：番茄青枯病抗性兩個(gè)相關(guān)基因功能的初步鑒定 1101 2.3 vigs體系的建立 pds是類(lèi)胡蘿卜素生成過(guò)程

27、中的關(guān)鍵酶，類(lèi)胡蘿卜素在植物中的生理作用是吸收光能和猝滅多余的光能，當(dāng)植物體內(nèi)缺少類(lèi)胡蘿卜素時(shí)，植株將出現(xiàn)光漂白樣癥狀，此表型很容易分辨，因此選用此基因來(lái)構(gòu)建和評(píng)價(jià)vigs體系。 番茄植株在浸潤(rùn)trv1和trv2-lic-pds農(nóng)桿菌11混合菌液15 d后頂部葉片開(kāi)始顯現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，20 d后vigs體系番茄植株上部葉片都出現(xiàn)了光漂白現(xiàn)象（圖4），確認(rèn)為pds基因沉默后的表型，說(shuō)明vigs體系已經(jīng)成功建立。 圖4 浸潤(rùn)含trv2-lic-pds農(nóng)桿菌的番茄植株20 d后的表型 fig. 4 the phenotype of tomato plant at 20 days after infil

28、trated with agrobacterium tumefaciens strain gv3101 containing trv2-lic-pds 2.4 接種青枯菌后的表型觀察 設(shè)置的3組番茄苗：vigs-ck、vigs-gst-l3和vigs-rem-1，在接種青枯菌rsm 3 d后出現(xiàn)青枯病癥狀。最初是子葉萎蔫，然后整株逐漸萎蔫。由圖5可見(jiàn)，gst-l3、rem-1基因沉默的番茄植株在青枯病發(fā)病程度上明顯高于對(duì)照組。 圖5 接種青枯菌（rsm）5 d后基因沉默及對(duì)照番茄植株的表型 fig. 5 the phenotypes of gene-silenced and control t

29、omato plants at 5 days after inoculated with r. solanacearum strain rsm 本試驗(yàn)中選用的rsm是中等致病力的青枯菌，hawaii 7996番茄對(duì)其有很強(qiáng)的抗性，平均發(fā)病率為11.11%，病情指數(shù)僅為3.82；而沉默基因gst-l3和rem-1的番茄植株發(fā)病率分別為61.11%和66.67%，病情指數(shù)分別為33.68和36.11，發(fā)病等級(jí)多為2級(jí)，有整株死亡的情況出現(xiàn)（表3）。 1102 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 表3 接種青枯菌（rsm）10 d后基因沉默及對(duì)照番茄植株的發(fā)病情況 table 3 the incidence o

30、f gene-silenced and control tomato plants at 10 days after inoculated with r. solanacearum strain rsm 發(fā)病等級(jí)分布 distribution of disease scales 被沉默的基因 silenced gene 發(fā)病植株/接種總植株 wilting plant/total plant 1 2 3 4 平均發(fā)病率/% average disease incidence 病情指數(shù) average disease index vigs-ck 8/72 5 3 0 0 11.11 3.82 g

31、st-l3 44/72 6 26 9 3 61.11 33.68 rem-1 48/72 8 29 6 5 66.67 36.11 2.5 vigs沉默效果的半定量rt-pcr鑒定 病毒誘導(dǎo)基因沉默能夠引起目的基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，導(dǎo)致被沉默的基因在轉(zhuǎn)錄后其mrna降解。為了鑒定vigs處理后的番茄植株中相應(yīng)的目的基因是否被沉默，分別提取試驗(yàn)組、對(duì)照組總rna用半定量rt-pcr進(jìn)行比較，循環(huán)數(shù)為22、25、28、30，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)對(duì)照組與vigs處理的植株actin基因擴(kuò)增量一致時(shí)，vigs處理的植株相應(yīng)目的基因pds、gst-l3、rem-1的擴(kuò)增量明顯減少，驗(yàn)證了vigs沉默目的基因的

32、有效性。 圖6 基因沉默的半定量rt-pcr檢測(cè) m：marker；22、25、28、30為pcr循環(huán)數(shù)。 fig. 6 vigs-mediated degradation of specific transcripts in tomato m：marker；22，25，28，30：pcr cycle number. 3 討論 hawaii 7996番茄是目前研究中廣泛使用的抗病材料，對(duì)中等致病力的青枯菌rsm有很強(qiáng)的抗性，但對(duì)強(qiáng)致病力菌株rsh表現(xiàn)為感病，所以在被兩種不同致病力的青枯菌侵染后的植株中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，可能與番茄對(duì)青枯菌的抗性相關(guān)。在雙向電泳的結(jié)果中，青枯菌株rsm侵染的haw

33、aii 7996番茄植株中谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶l3和remorin 1蛋白表達(dá)量上調(diào)，表明其對(duì)應(yīng)基因gst-l3和rem-1可能參與寄主對(duì)青枯病的防御反應(yīng)；分別沉默基因gst-l3和rem-1后，hawaii 7996植株對(duì)青枯病的抗性明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了這一推斷。 谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（gst）是一種多功能的氧化還原酶（ec8），其顯著功能是它能在細(xì)胞中排出外源性有毒物質(zhì)和參與氧化應(yīng)激反應(yīng)（marrs，1996）。gst通過(guò)催化某些內(nèi)源性或外來(lái)有害物質(zhì)與還原型谷胱甘肽發(fā)生親電取代反應(yīng)，增加這些物質(zhì)的疏水性，使其易于穿越細(xì)胞膜，通過(guò)選擇性的abc 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)出去，達(dá)到去毒作用（dix

34、on et al.，2010）。在植物細(xì)胞中，gst的表達(dá)主要發(fā)生在植物的發(fā)育期（細(xì)胞分裂等）以及在細(xì)胞受到外界病源體入侵、外界環(huán)境的改變和噴6期 汪國(guó)平等：番茄青枯病抗性兩個(gè)相關(guān)基因功能的初步鑒定 1103 灑化學(xué)物質(zhì)等情況下。wisser等（2011）研究發(fā)現(xiàn)gst基因?qū)疑~斑病、玉米大斑病和小斑病這3種由真菌引起的玉米病害都有適度的抗性。在本研究中，用vigs的方法沉默gst-l3基因?qū)е耯awaii 7996番茄植株的青枯病抗性明顯減弱，表明gst不僅在植物對(duì)真菌的抗性中起作用，在番茄對(duì)細(xì)菌性青枯病的抗性中也起了作用。 remorin蛋白是一種植物專(zhuān)一性的蛋白，僅在細(xì)胞膜的脂筏上發(fā)現(xiàn)

35、，但其結(jié)構(gòu)中不含跨膜域。單體remorin可形成纖維結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞骨架和膜骨架中發(fā)揮作用。它的另一個(gè)重要功能是參與植物抗性與發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)途徑（raffaele et al.，2007）。研究發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中remorin蛋白能與寡聚半乳糖醛酸（oga）結(jié)合，在用多聚半乳糖醛酸處理過(guò)的馬鈴薯葉片上，remorin蛋白能與質(zhì)膜結(jié)合并被磷酸化，而oga是一種胞外信號(hào)，是植物抗性基因的調(diào)節(jié)物并參與植物的發(fā)育及形態(tài)建成，說(shuō)明remorin蛋白很可能作用于細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和植物防御。lefebvre等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，remorin蛋白能吸附在圍繞著病菌的宿主質(zhì)膜上，從而控制根瘤菌的感染并阻止它釋放到宿

36、主細(xì)胞質(zhì)中。perraki等（2012）進(jìn)一步通過(guò)結(jié)構(gòu)功能法研究發(fā)現(xiàn)，remorin蛋白的一個(gè)短的c末端脂錨鉤可以直接綁定到馬鈴薯細(xì)胞的質(zhì)膜上，從而限制馬鈴薯病毒x在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)。結(jié)合本研究中rem-1的vigs沉默后番茄植株發(fā)病率明顯增加這一結(jié)果，表明remorin蛋白很可能是通過(guò)阻礙青枯菌在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)方式，從而在番茄抗青枯病感染中起到一定的作用。 綜上所述，本研究中的這兩個(gè)基因gst-3和rem-1都屬于番茄青枯病抗性相關(guān)基因，參與了番茄植株對(duì)青枯病的防御反應(yīng)，但它們?cè)诜烙磻?yīng)中具體的分子作用還有待進(jìn)一步研究。 references allen c. 2007. strategies f

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