[畢業(yè)設(shè)計(jì)精品]鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中微小RNA29c表達(dá)的研究

1、2008級研究生學(xué)位論文 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中微小rna29c表達(dá)的研究學(xué)位類別：學(xué)術(shù)型畢業(yè)時間：2011年6月所學(xué)專業(yè)：腫瘤學(xué)研究方向：鼻咽癌的綜合治療學(xué)位論文：鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中微小rna29c表達(dá)研究論文編號：目 錄論文鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中微小rna29c表達(dá)的研究摘要中文摘要1英文摘要3前言6材料與方法.9結(jié)果.20討論.26小結(jié).34參考文獻(xiàn).35附表41綜述微小rna與鼻咽癌.44致謝59攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章.60鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中微小rna29c表達(dá)的研究摘 要目的 檢測鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中微小rna29c（mir29c

2、）的表達(dá)量，探討mir29c與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 24例鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者和24例健康人分為鼻咽癌組和正常組，收集兩組的血清，用q-pcr方法檢測血清中mir29c的表達(dá)量。結(jié)果 （1）鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量明顯低于健康人血清中mir29c的表達(dá)量（p0.05）；（2）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量（p0.05）；（3）鼻咽癌2008分期期的鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量明顯低于-期的鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞

3、癌患者血清中mir29c的表達(dá)量（p0.05）；（5）不同年齡的鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量無明顯差異（p0.05）。結(jié)論 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c表達(dá)量明顯降低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期晚的患者，mir29c的表達(dá)量更低。mir29c可能具有抑制鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量可反映鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的情況。關(guān)鍵詞 micror29c，鼻咽癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期the research about the expression leveal of microrn

4、a29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinomaabstractobjective to detect the expression level of micror29c(mir29c) in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma. and to explore the relationship between mir

5、29c and the occurrence、progression、invasion and metastasis of nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma.methods 24 patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma were divided into the group of nasopharyngeal carcinoma (npc) , and 24 healthy people were

6、divided into the normal group. collect serum from the tow groups, and detected the expression level of mir29c in the serum.result (1) the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma was obviously lower than the expression leve

7、l of mir29c in the serum of healthy people (p0.05); (2) the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma who had lymph node metastasis was obviously lower than the expression level of mir29c in the serum of patients with nasoph

8、aryngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma who had not lymph node metastasis (p0.05); (3)the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma whose stages were nasopharyngeal carcinoma 2008 stage - was obviously lower t

9、han the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma whose stages were nasopharyngeal carcinoma 2008 stage (p0.05); (5) among the patients with nose pharynx poorly differentiated squamous cell carcinoma whose age were diferent,

10、 the expression level of mir29c in their serum of had no difference(p0.05).conclusion the expression level of mir29c in the serum of patients with nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma was obviously reduced, and the expression level of mir29c was more lower in the serum of pat

11、ients who had lymph node metastasis, and whose clinical stage was more later. mir29c may have the effection of suppressing the occurrence, development, invasion and metastasis of nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma.the expression level of mir29c in the serum of patients with

12、 nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma could reflect the states about the occurrence, development, invasion and metastasis of nasopharyngeal poorly differentiated squamous cell carcinoma.key words mir29c, nasopharyngeal carcinoma, lymph node metastasis，clinical stage前 言鼻咽癌的發(fā)病具

13、有明顯的地域聚集性，我國鼻咽癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)最高。鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移是多因素、多階段的過程，由基因、生物與環(huán)境等因素協(xié)同作用產(chǎn)生，基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移方面起到重要的作用，尋找與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因是目前研究鼻咽癌的熱點(diǎn)1。鼻咽部復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，以及我國97的鼻咽癌組織病理學(xué)類型為低分化鱗狀細(xì)胞（2005 who組織病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)中的非角化性癌），使我國的鼻咽癌有早期侵襲轉(zhuǎn)移的傾向，治療效果和預(yù)后比較差2。因此，研究鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，在提高鼻咽癌治療效果和改善患者預(yù)后等方面具有重要的意義。微小rna(microrna，

14、mirna)是長度僅有1825核苷酸（nt）的一類內(nèi)源性非編碼小rna3。從1993年lee rc等4在線蟲體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)mirna到2010年9月，已經(jīng)在生物體中找到15172種mirna5，其中至少有721種在人體中表達(dá)。mirna能編碼人類30%的基因，調(diào)控50%的蛋白質(zhì) 6。mirna進(jìn)化高度保守，不直接編碼蛋白質(zhì)，而是通過與靶mrna的特異性堿基互補(bǔ)配對，促使靶mrna降解或抑制靶mrna轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)，影響細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡，調(diào)節(jié)生物的多種功能7。mirna在生物中的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在腫瘤組織中這種特異性尤為突出，可反映腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲

15、轉(zhuǎn)移情況，用于腫瘤的診斷和預(yù)后判斷。體液中表達(dá)的mirna被稱為循環(huán)mirna，此概念由研究者的在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的推論【】中提出：在腫瘤患者的體液中可以檢測到循環(huán)dna和rna8，在福爾馬林固定的腫瘤組織有穩(wěn)定而特異性表達(dá)的mirna9，那么在腫瘤組織中穩(wěn)定而特異性表達(dá)的mirna可能在腫瘤患者體液中穩(wěn)定而特異性表達(dá)，循環(huán)mirna可能是理想的腫瘤標(biāo)志物，可用于腫瘤的診斷和預(yù)后判斷10。之后，研究者發(fā)現(xiàn)mirna可通過超微小泡和外來體穿過腫瘤細(xì)胞膜到達(dá)體液中，或在核磷蛋白（rna結(jié)合蛋白，npm1）作用下穿過腫瘤細(xì)胞膜到達(dá)體液中，在體液中核磷酸蛋白保護(hù)mirna不被核酸酶降解而穩(wěn)定表達(dá)11,12

16、。近年來研究者在非霍奇金淋巴瘤13、乳腺癌14和胃癌15等多種腫瘤患者體液中檢測到穩(wěn)定而特異性表達(dá)的循環(huán)mirna，這些循環(huán)mirna與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。檢測循環(huán)mirna在鼻咽癌患者血清中的表達(dá)量，研究循環(huán)mirna在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用，可能對鼻咽癌的診斷、治療和預(yù)后判斷等方面具有重要作用。大量研究表明mirna29c在惡性腫瘤組織中表達(dá)量降低，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)16-18。mir29c在鼻咽癌組織中表達(dá)量也明顯降低，可通過調(diào)節(jié)鼻咽癌組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（extracellular matrix，ecm）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular e

17、ndothelial growth factor，vegf）信號通路中的多種蛋白生成和功能表達(dá)，抑制鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移19,20。目前，在鼻咽癌患者血清中mir29c是否有表達(dá)，未見報(bào)道。本研究采用q-pcr技術(shù)檢測鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量，分析mir29c與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期的關(guān)系，進(jìn)一步探討mir29c與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。材料和方法1 研究對象鼻咽癌組24例鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者。鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者為2009年6月-2010年3月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院首診住院的患者。入組條件所有患者

18、均在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科經(jīng)鼻咽部腫瘤組織病理學(xué)檢查，確診為鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌；所有患者治療前均在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科行頭頸部mri檢查，以明確臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；所有患者一般情況良好（用kps評分標(biāo)準(zhǔn)判定，詳見附錄1），器官功能正常；所有患者除患本病外無其它合并癥和既往特殊疾病史，無家族重大疾病史和腫瘤病史；所有患者經(jīng)超聲、胸部x線、ect等檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。亞組（1） 按患者性別分：男性亞組（13例），女性亞組（11例）；（2）按患者年齡分：45歲亞組（11例），45歲亞組（13例），年齡在1456歲間，平均年齡43歲；（3）按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組（14

19、例），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組（10例）；（4）按臨床分期分：-期亞組（13例），期亞組（11例）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)影像學(xué)淋巴結(jié)診斷標(biāo)準(zhǔn)（詳見附錄2）診斷，臨床分期根據(jù)鼻咽癌2008分期（詳見附錄3）確定，鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床資料詳見表1-1。正常組24例健康人。健康人為2009年11月-2010年3月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢的人。入組條件 所有人一般情況良好（用kps評分標(biāo)準(zhǔn)判定），器官功能正常；所有人未患全身性疾病，無既往特殊疾病史，無家族重大疾病史和腫瘤病史；所有人與鼻咽癌組年齡相近（經(jīng)t檢驗(yàn)，p0.05，證實(shí)兩組年齡有可比性，詳見表1-2）；健康人與鼻咽癌組的

20、性別比例相同。表1-1 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者臨床資料編號患者年齡（歲）性別淋巴結(jié)情況鼻咽癌2008分期1npc145男-t3n0m02npc234男-t2n0m03npc335男+t3n2m04npc452女+t4n2m05npc548男-t4n0m06npc623男+t4n1m07npc747女+t4n2m08npc846男-t3n0m0編號患者年齡（歲）性別淋巴結(jié)情況鼻咽癌2008分期9npc943男+t3n2m010npc1040男+t4n1m011npc1152男+t4n2m012npc1252女+t3n3m013npc1351男-t3n0m014npc1439女+t3n1m015

21、npc1541女+t3n2m016npc1643女-t3n0m017npc1742女-t3n0m018npc1850男-t3n0m019npc1948男-t2n0m020npc2050男+t3n1m021npc2145女+t4n2m022npc2242女+t4n3m023npc2356女-t2n0m024npc2414女+t4n3m0注：“-”指無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，“+”指有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。表1-2 鼻咽癌組與正常組年齡的比較分組例數(shù)年齡tp鼻咽癌組2443.259.490.1760.862正常組2443.1710.022 材料2.1 主要試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒廣州復(fù)能基因有限公司q-pcr試劑盒廣州復(fù)能基因

22、有限公司trizol-a+北京天根生化技術(shù)有限公司dna mark北京天根生化科技有限公司depc處理水北京天根生化科技有限公司無水乙醇天津四有生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司三氯甲烷上海振興化工一廠5tris-硼酸(tbe)北京鼎國公司溴化乙錠(eb)美國sigma公司異丙醇衡陽有機(jī)化學(xué)試劑廠瓊脂糖(apoose)spanish2.2 主要儀器7500型實(shí)時熒光定量pcr儀美國abi公司凝膠成像分析系統(tǒng)美國bio-rad公司凝膠成像掃描儀美國bio-rad公司紫外分光光度計(jì)美國pe公司-80低溫冰箱日本三洋公司4、-20冰箱美的公司ab240-e分析天平瑞士海特勒-托利多公司高速低溫離心機(jī)德國eppen

23、ndorf公司多通道pcr擴(kuò)增儀美國mj公司電泳儀美國bio-rad公司顆粒制冰機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠高壓滅菌消毒鍋日本tomy公司烤箱上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠所有儀器由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。3 方法3.1 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織病理檢查所有鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者均在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科經(jīng)電子纖維鼻咽鏡檢，取鼻咽部腫瘤組織，在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科行組織病理學(xué)檢查，經(jīng)常規(guī)he染色，病理科醫(yī)生在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)閱片診斷，確診為鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌。3.2 鼻咽組和正常組血清中mir29c的檢測3.2.1 標(biāo)本采集經(jīng)鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者和健康人同意，分別在入院后治療前或體檢

24、當(dāng)天，清晨空腹條件下，抽取外周靜脈全血5ml于無菌無rna酶和無抗凝劑的10ml干燥試管中，室溫凝固后離心（3000 rmp 10min），提取2.5ml血清于10ml離心管中，放入-80超低溫冰箱保存，待用。3.2.2 總rna提取3.2.2.1 方法采用trizol法提取鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者和健康人血清中的總rna。3.2.2.2 步驟（1） 標(biāo)本處理取出-80下保存的血清，在冰上自然解凍，常溫下加入2.5ml 裂解液trizol-a+，劇烈震蕩5min，室溫靜置10min，重復(fù)一次。（2） 相分離在經(jīng)裂解液trizol-a+裂解處理后的混合液中加入1.5ml氯仿，劇烈震蕩1min，室

25、溫靜置5min，4離心12000 rmp 15min，小心取出離心管。觀察發(fā)現(xiàn)離心管中液體分為三層，無色透明的上層液中含總rna，稀薄的中間層液中含dna，固體狀的下層物質(zhì)中含蛋白質(zhì)。小心轉(zhuǎn)移上層液5ml于10ml離心管中，避免接觸中間層或管壁。用同樣方法進(jìn)行第二次相分離，以保證總rna純凈，即加入1.5ml氯仿，劇烈震蕩1min，室溫靜置5min，4離心12000 rmp 15min，轉(zhuǎn)移上層液4ml于10ml離心管中。（3） 總rna沉淀在上層液中加入4ml異丙醇，小心震蕩混勻1min，冰上靜置10min，4離心 12000 rmp 10min，使總rna貼于離心管底壁，小心傾倒，去掉液體

26、。（4）總rna洗滌在管底貼有總rna的離心管中加入2ml 75%乙醇（用depc處理水配制，保存于4冰箱中）漂浮沉淀，4離心12000 rmp 5min，小心傾倒，去掉液體。再用2ml 75%乙醇洗滌一次，4離心12000 rmp 5min，小心傾倒，去掉液體，倒置離心管，室溫干燥20min。（5）總rna溶解在管底貼有總rna的離心管中加入25ul depc處理水，溶解總rna，制成總rna溶液。（6）總rna濃度測定取1ul總rna樣品加入99ul depc處理水中，稀釋至100ul，用depc處理水作空白對照，校正調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)下測總rna的光吸收值a260，計(jì)算總rna的濃度

27、，公式如下：rna濃度（ug/ul）=40a260稀釋倍數(shù)/1000（7）總rna純度測定取1ul總rna樣品加入99ul depc處理水中，稀釋至100ul，用depc水作空白對照，校正調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)下測定總rna的光吸收值的比值a260/a280，a260/a280低于1.8或高于2.0表明總rna被污染或降解。（8）總rna完整性測定1瓊脂糖凝膠制備：用ab240-e分析天平稱取0.4g瓊脂糖粉末，加入40ml 1tbe電泳緩沖液中（0.4/401/100），混勻，加熱使瓊脂糖完全溶解，稍冷卻后加入2ul溴化乙錠（eb），充分混勻，倒入裝好寬口梳子的膠槽中，室溫下冷卻凝固，得到1

28、瓊脂糖凝膠，水平放置待用。總rna樣品制備：取3l總rna 樣品，加入18l depc處理水中，65變性10min后立即冷卻，加入2l 10rna上樣液，得到總rna樣品?？俽na電泳：取出制備好的1瓊脂糖凝膠，平放入盛有1tbe電泳緩沖液的電泳槽中，使緩沖液沒過凝膠表面1mm，在直流恒定電壓100v下電泳5min。將總rna樣品點(diǎn)樣在凝膠孔中，100v電壓下電泳至溴酚藍(lán)至膠的1/3 處。rna完整性檢測：立即在凝膠電泳成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行凝膠掃描，觀察電泳結(jié)果并拍照。觀察條帶，若在瓊脂糖凝膠上28s、18s、5s三條帶清晰，28s帶的亮度約是18s條帶亮度的兩倍，說明總rna完整。若某條帶無顯

29、示或模糊，說明總rna有降解。3.2.3 cdna合成（1）試劑準(zhǔn)備將試劑盒all-in-onetm mir29c q-pcr detection kit中反轉(zhuǎn)錄所需的試劑（2.5u/l polya polymerase，rtase mix，5reaction buffer）放在冰上融解，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。同時在冰上預(yù)冷無rna酶的反應(yīng)管。（2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制按表1-3要求，在冰上依次向反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄所需的試劑和總rna。表1-3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制試劑成分體積total rna18ul2.5u/l polya polymerase1ulrtase mix1ul5r

30、eaction buffer5ulfinal volume25ul（3）反轉(zhuǎn)錄將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液充分混勻，短暫離心，使反應(yīng)液位于管底，37反應(yīng) 60min，85滅活 5min。得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna，立即用于q-pcr反應(yīng)或-20保存待用。3.2.4 q-pcr反應(yīng)3.2.4.1 q-pcr方法的原理在q-pcr反應(yīng)體系中加入sybr green，sybr green在cdna的指數(shù)擴(kuò)增期與雙鏈dna結(jié)合，發(fā)出熒光信號，利用熒光信號積累實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測整個pcr反應(yīng)過程，對cdna的初始模板mirna進(jìn)行定量分析。本研究所用的q-pcr反應(yīng)試劑盒（all-in-one tm mir29c q-pcr

31、 detection kit）采用國際上公認(rèn)的核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)對mir29c進(jìn)行檢測，特異性強(qiáng)、靈敏度高。all-in-one tm mir29c q-pcr detection kit 采用在多聚腺苷酸聚合酶（poly a polyase）作用下對mir29c的3端加多聚腺苷酸（poly a），用反轉(zhuǎn)錄酶m-mlv rtase及獨(dú)特的反轉(zhuǎn)錄引物oligo dt adaptor對加上poly a的mir29c進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用含有sybr green的pcr反應(yīng)試劑混合物（all-in-one tm q-pcr mix）和mir29c的特異性引物對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行基因擴(kuò)增和溶解曲線分析（圖2-1，引用于

32、mir29c q-pcr detection kit的產(chǎn)品說明書）。圖1-1 實(shí)驗(yàn)原理及步驟fig1-1 experimental principle and procedure3.2.4.2 步驟（1）試劑準(zhǔn)備冰上融解all-in-one tm mir29c q-pcr detection kit中的2all-in-onetm q-pcr mix、通用引物universal adaptor pcr primer, 特異性引物all-in-one tm mirna q-pcr primer）和單鏈cdna，上下輕微顛倒混勻，短暫離心，放置冰上待用。同時在冰上預(yù)冷q-pcr反應(yīng)管，（2）q-pc

33、r反應(yīng)液配制按表1-4要求依次加入以下試劑（所用反應(yīng)液配制兩份，同時用于q-pcr反應(yīng)，并用depc處理水代替cdna做陰性對照，檢測反應(yīng)體系是否有污染），mir29c和u6的反應(yīng)液分管配制。充分混勻反應(yīng)液，使混合液位于反應(yīng)管底部。表1-4 q-pcr反應(yīng)液配制組成成分體積2all-in-onetm q-pcr mix10ulall-in-one tm mirna q-pcr primer (2um)2uluniversal adaptor pcr primer (2um)2ul1st strand cdna 6ulfinal volume20ul（3）q-pcr擴(kuò)增 使用abi 7500型實(shí)

34、時熒光定量pcr儀兩步法進(jìn)行q-pcr擴(kuò)增。 95預(yù)變性10min，循環(huán)1次；95變性20sec、60退火30sec、72延伸30sec，循環(huán)40次（表1-5）。在延伸時收集熒光信號。表1-5 q-pcr反應(yīng)要求循環(huán)數(shù)步驟溫度（）時間檢測1預(yù)變性9510min否40變性9520sec否退火6030sec否延伸7230sec是（4）q-pcr溶解曲線分析 按abi 7500型實(shí)時熒光定量pcr儀中軟件要求進(jìn)行溶解曲線分析?；€設(shè)定為反應(yīng)的前315個循環(huán)時收集到的熒光信號。閾值由abi 7500型實(shí)時熒光定量pcr儀自動設(shè)置，為基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。熒光值達(dá)到閾值時的pcr循環(huán)數(shù)為ct值，調(diào)整總

35、rna的濃度，使ct值在1535之間。按abi 7500型實(shí)時熒光定量pcr儀自定的反應(yīng)程序進(jìn)行溶解曲線分析。用2-ct方法36統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者mir29cct均值鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者mir29c ct均值同一鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者u6 ct均值，健康人mir29cct均值健康人mir29c ct均值同一健康人u6 ct均值，均值是平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)時，同一樣本在兩個反應(yīng)管中反應(yīng)所得的基因的ct值的均值，目的是為了消除加樣量誤差，u6為陽性內(nèi)對照基因，用來校正q-pcr所擴(kuò)增的基因的拷貝數(shù)。ct均值 = 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者mir29cct均值健康人mir29cct均

36、值，2-ct表示相對于健康人，鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的相對表達(dá)量。3.2.4.3 q-pcr產(chǎn)物凝膠電泳驗(yàn)證（1）3瓊脂糖凝膠制作將1.2g瓊脂糖粉末加入1tbe電泳緩沖液40ml，混勻，加熱使瓊脂糖完全溶解，稍冷卻，加入2ul eb，充分混勻，倒入裝好梳子的膠槽中，室溫下冷卻凝固，得到3瓊脂糖凝膠，水平放置待用。（2） rna電泳取出制備好的3瓊脂糖凝膠，平放于盛有1tbe電泳緩沖液的電泳槽中，使緩沖液沒過凝膠表面上1mm，在直流恒定電壓100v下電泳5min，將q-pcr產(chǎn)物加入凝膠孔中，100v電壓下電泳至溴酚藍(lán)至膠的1/3 處。4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(

37、 x+s)表示，采用spss 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果1 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者的病理檢查結(jié)果在壞死細(xì)胞和細(xì)胞碎屑的背景中可見到大量體積增大，形狀多樣的腫瘤細(xì)胞，呈癌巢分布；癌巢內(nèi)細(xì)胞分層不明顯，細(xì)胞大小、形態(tài)不一，呈卵圓形、多角形、梭形或不規(guī)則形；胞漿豐富，境界清楚，細(xì)胞間無細(xì)胞間橋，無細(xì)胞角化或角化珠存在；細(xì)胞核大、深染，部分細(xì)胞核有一個或多個核仁（圖2-1，圖2-2）。 圖2-1 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌病理(he400)圖2-2 鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌病理(he400)fig2-1 the pathological figu

38、re of nasopharyn- geal poorly differentiated squamous cell carcinoma（he100）fig2-1 the pathological figure of nasopharyn- geal poorly differentiated squamous cell carcinoma（he100）注：箭頭所指為癌巢2 總rna的濃度和純度檢測結(jié)果鼻咽癌組血清中總rna的濃度最大值為0.168ug/ul，最小值為0.04ug/ul，正常組血清中總rna的濃度最大值為0.204ug/ul，最小值為0.04ug/ul，所有總rna的濃度均在1

39、ng5g之間，滿足實(shí)驗(yàn)要求。鼻咽癌組血清中總rna的a260/a280比值最大值為1.983，最小值為1.801；正常組血清中總rna的a260/a280比值最大值為1.990，最小值為1.821。1.80a260/a280 0.99，擴(kuò)增效率在90110之間， 5倍稀釋間隔的ct值約為2.5，說明擴(kuò)增有效（圖2-8， 2-10）。 圖2-7 u6的擴(kuò)增曲線圖2-9 u6的標(biāo)準(zhǔn)曲線fig2-7 the amplication curve of u6fig2-9 the standard curve of u6 圖2-8 mir29c的擴(kuò)增曲線圖2-10 mir29c的標(biāo)準(zhǔn)曲線fig2-8 th

40、e amplication curve of mir29cfig2-10 the standard curve of mir29c6 鼻咽癌組與正常組血清中mir29c表達(dá)量的差異性分析結(jié)果相對于正常組，鼻咽癌組血清中mir29c的表達(dá)量為0.3310.167，t=19.595，p0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者與健康人血清中mir29c的表達(dá)量有明顯差異，鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量明顯低于健康人血清中mir29c的表達(dá)量（表2-6，圖2-11）。mir29c的相對表達(dá)量表2-2 鼻咽癌患者與健康人血清中mir29c表達(dá)量差異性分析結(jié)果分組例數(shù)mir

41、29c的相對表達(dá)量p正常組2410.00鼻咽癌組240.3310.167注：用xs表示7 鼻咽癌組的各亞組間mir29c表達(dá)量差異性分析結(jié)果（1）男性亞組血清中mir29c相對表達(dá)量為0.3440.178，女性亞組血清中mir29c相對表達(dá)量為0.3150.161，t=0.426，p0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者中，男性患者和女患者血清中mir29c的表達(dá)量無明顯差異（表2-7）；（2）45歲亞組血清中mir29c相對表達(dá)量為0.2900.144，45亞組血清中mir29c相對表達(dá)量為0.3650.183，t=-1.108，p0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明年齡45歲

42、和45歲的鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c表達(dá)量的無明顯差異（表2-7）；（3）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組血清中mir29c相對表達(dá)量為0.2320.064，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組血清中mir29c相對表達(dá)量為0.4690.171，t=-4.749，p0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明-期與期鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞患者血清中mir29c的表達(dá)量有明顯差異，期鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞患者血清中mir29c的表達(dá)量明顯低于-期鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞患者血清中mir29c的表達(dá)量（表2-7）。表2-7亞組間mir29c表達(dá)量差異性分析臨床特征亞組例數(shù)相對表達(dá)量tp性別男130.3440.1780.4260.000女110

43、.3150.161年齡45130.2900.144-1.1080.00045110.3650.183淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有140.2320.064-4.7490.000無100.4690.171臨床分期分期-期130.4230.1733.6370.000期110.2220.064注：用xs表示圖2-11 mir29c在各組中相對表達(dá)量的比較fig2-15 the comparison between every two groups about the relative exnpression of mir29c討 論一、研究鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的重要性鼻咽癌的發(fā)病具有明顯的地域、種

44、族差異和家族高發(fā)傾向，who資料顯示1978/1983-2002年期間世界鼻咽癌新發(fā)病例64,796人，其中我國約占43.2，近十年來我國鼻咽癌的發(fā)病率未見減少，且發(fā)病機(jī)制不清楚22。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特性，絕大多數(shù)腫瘤患者致死的主要因素。早期具有侵襲轉(zhuǎn)移的傾向是我國鼻咽癌的顯著特征，這與鼻咽部復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)和我國鼻咽癌特有的組織病理學(xué)特點(diǎn)有關(guān)。鼻咽部周圍有豐富的血管、神經(jīng)、淋巴管和許多孔隙，以及骨、腦、脊髓、眼球等重要器官，鼻咽癌細(xì)胞很容易向周圍侵襲和區(qū)域、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。我國90的鼻咽癌組織病理類型為低分化鱗狀細(xì)胞癌，此類分化差、異形性明顯、惡性程度高，極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移23。通過病例

45、收集及臨床工作中觀察，發(fā)現(xiàn)目前絕大多數(shù)的鼻咽癌患者的組織病理類型為低分化鱗狀細(xì)胞癌，在首診入院時腫瘤已發(fā)生明顯的鄰近組織器官侵襲，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者的治療效果不理想，預(yù)后較差。因此，研究鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制十分重要。本研究通過檢測鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者血清中mir29c的表達(dá)量，分析mir29c與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mir29c可能具有抑制鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。二、mirna的基本生物學(xué)特性及其檢測方法mirna是近二十幾年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小rna，長約1825核苷酸（nt），廣泛存在于真核生物中，

46、具有高度保守性、時序性和組織特異性。目前在生物體中已發(fā)現(xiàn)15172種mirna，其中至少有721種存在于人體中24。mirna主要由位于基因內(nèi)含子區(qū)域的核苷酸編碼產(chǎn)生，在細(xì)胞漿中與argonaute蛋白結(jié)合，形成rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（rna-induced silencing comple，risc）后穩(wěn)定表達(dá)于生物中 25。mirna主要通過與靶mrna堿基互補(bǔ)配對，降解靶mrna或抑制靶mrna翻譯，阻止蛋白質(zhì)生成和功能表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，調(diào)控疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸26。從1993年發(fā)現(xiàn)mirna以來，檢測mirna的方法主要有：mirna微陣列芯片檢測技術(shù)（microarry

47、），高通量基因測序技術(shù)，northern blot分子雜交技術(shù)和q-pcr技術(shù)。其中mirna微陣列芯片檢測技術(shù)的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和靈敏性比較差，只能用于mirna初篩和檢測已知mirna，不適合臨床應(yīng)用研究；高通量基因測序技術(shù)在無需任何基因序列信息的前提下可測出mirna的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)并鑒定出新的mirna，但價格昂貴，不適合推廣應(yīng)用；northern blot分子雜交技術(shù)檢測步驟繁瑣、樣本量需求大，靈敏度較低，存在放射性元素對健康的影響，不適用于大樣本檢測；q-pcr技術(shù)是目前最有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的檢測方法，操作時間不長、步驟簡便、效率高，敏感性和特異性也高，實(shí)際應(yīng)用最多27。目前用于檢測mi

48、rna的q-pcr技術(shù)主要有兩種：基于莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的q-pcr方法，基于poly a加尾的q-pcr方法。這兩種方法均可用taqman探針和sybr green染料進(jìn)行檢測，其中taqman探針法特異性更高，而sybr green染料法更經(jīng)濟(jì)、實(shí)用28。本研究首次采用基于polya加尾的q-pcr技術(shù)sybr green染料法檢測鼻咽低分化鱗癌患者血清中mir29c的表達(dá)量，分析鼻咽低分化鱗癌患者與健康人血清中mir29c的表達(dá)量的差異，以及鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞患者血清中mir29c的表達(dá)量與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期的關(guān)系，探討鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中mir29c

49、的作用，發(fā)現(xiàn)mir29c可能具有抑制鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。三、惡性腫瘤中mirna表達(dá)量改變的意義mirna在惡性腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性，可能是一類理想的腫瘤標(biāo)志物。mirna在惡性腫瘤中表達(dá)量的改變與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，在惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷等方面具有重要的作用。hussein k29研究發(fā)現(xiàn)mir10a在費(fèi)城染色體陰性的骨髓增生性腫瘤患者的巨核細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而在正常巨核細(xì)胞中明顯表達(dá)，mir10a能抑制費(fèi)城染色體陰性的骨髓增生性腫瘤發(fā)生，通過檢測巨核細(xì)胞中mir10a的表達(dá)量可協(xié)助診斷費(fèi)城染色體陰性的骨髓增生性腫瘤。yu j等30研究發(fā)現(xiàn)侵襲性鱗狀細(xì)胞癌中mir205表達(dá)量明顯升高，抑癌基因ship2表達(dá)量明顯降低，通過抑制癌細(xì)胞中mir205的表達(dá)可以增加侵襲性鱗狀細(xì)胞癌中抑癌基因ship2的表達(dá)量，抑制腫瘤發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，mir205在侵襲性鱗狀細(xì)胞癌的治療方面具有重要作用。chang kw31研究發(fā)現(xiàn)口腔癌組織中mir2