分子生物學(xué)朱玉賢筆記

1、分子生物學(xué)朱玉賢筆記第二章 染色體與DNA染色體（chromosome）是細(xì)胞在有絲分裂時(shí)遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密包裝的結(jié)果。真核生物的染色體在細(xì)胞生活周期的大部分時(shí)間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位核小體(nucleosome)成串排列而成的。原核生物(prokaryote) ：DNA形成一系列的環(huán)狀附著在非組蛋白上形成類核。染色體由DNA和蛋白質(zhì)組成。蛋白質(zhì)由非組蛋白和組蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4）DNA和組蛋白構(gòu)成核小體。組蛋白的一般特性：P24進(jìn)化上的保守性無(wú)組織特異性肽鏈氨基

2、酸分布的不對(duì)稱性：堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。組蛋白的可修飾性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 H5組蛋白的特殊性：富含賴氨酸（24%）(鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5)組蛋白的可修飾性 在細(xì)胞周期特定時(shí)間可發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙?；饔谩1有磷酸化作用。所有這些修飾作用都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，直接影響轉(zhuǎn)錄活性；二是核小體表面發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。2、DNA1) DNA的變性和復(fù)性

3、變性（Denaturation) DNA雙鏈的氫鍵斷裂，最后完全變成單鏈的過(guò)程稱為變性。 增色效應(yīng)(Hyperchromatic effect)在變性過(guò)程中，260nm紫外線吸收值先緩慢上升，當(dāng)達(dá)到某一溫度時(shí)驟然上升，稱為增色效應(yīng)。融解溫度（Melting temperature ，Tm ) 變性過(guò)程紫外線吸收值增加的中點(diǎn)稱為融解溫度。 生理?xiàng)l件下為85-95影響因素：G+C含量，pH值，離子強(qiáng)度，尿素，甲酰胺等復(fù)性（Renaturation)熱變性的DNA緩慢冷卻，單鏈恢復(fù)成雙鏈。 減色效應(yīng)（Hypochromatic effect) 隨著DNA的復(fù)性，260nm紫外線吸收值降低的現(xiàn)象。 2

4、) C值反?，F(xiàn)象（C-value paradox) C值是一種生物的單倍體基因組DNA的總量。 真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反?，F(xiàn)象”。 （四）核小體(nucleosome)：用于包裝染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，是由DNA鏈纏繞一個(gè)組蛋白核（H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚體】構(gòu)成的。 1、原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 基因組很小，大多只有一條染色體 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)煉 存在轉(zhuǎn)錄單元(trnascriptional operon)多順反子(polycistron)重疊基因由基因內(nèi)基因、部分重疊基因、一個(gè)堿基重疊組成。2

5、、真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)真核基因組結(jié)構(gòu)龐大 3109bp、染色質(zhì)、核膜單順反子基因不連續(xù)性 斷裂基因（interrupted gene）、內(nèi)含子(intron)、 外顯子(exon)非編碼區(qū)較多 多于編碼序列(9:1) 含有大量重復(fù)序列 不重復(fù)序列/單一序列：在基因組中有一個(gè)或幾個(gè)拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等 功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。 中度重復(fù)序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101104。如：rRNA、tRNA 一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達(dá)中起重要作用 高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)達(dá)到幾百個(gè)到幾百萬(wàn)個(gè)。衛(wèi)星DNA：AT 含量很高的簡(jiǎn)單高度重復(fù)序列。1

6、、 DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)：指4種脫氧核苷酸的連接及其排列順序， DNA序列是這一概念的簡(jiǎn)稱。堿基序列2）特征：雙鏈反向平行配對(duì)而成脫氧核糖和磷酸交替連接，構(gòu)成DNA骨架，堿基排在內(nèi)側(cè)內(nèi)側(cè)堿基通過(guò)氫鍵互補(bǔ)形成堿基對(duì)（A：T，C：G）。2、DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 2）分類：右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA3、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)：指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。是一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。2）主要形式：超螺旋結(jié)構(gòu)（正超螺旋和負(fù)超螺旋）（一）DNA的半保留復(fù)制（semi-nservative replication）1

7、、定義：由親代DNA生成子代DNA時(shí)，每個(gè)新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。3、DNA半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。5、 DN

8、A聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)反應(yīng)需要有3-OH存在DNA鏈的合成方向?yàn)? 3 性質(zhì) 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性+5 3 外切活性+- 5 3聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+聚合酶主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時(shí)切除RNA引物并填補(bǔ)其留下的空隙。聚合酶修復(fù)紫外光引起的DNA損傷聚合酶 DNA 復(fù)制的主要聚合酶，還具有35外切酶的校對(duì)功能，提高DNA復(fù)制的保真性6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

9、但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來(lái) DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用7、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topisomerase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶8、DNA 解螺旋酶 /解鏈酶（DNA helicase)：通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開雙鏈DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3 5移動(dòng)，而

10、解螺旋酶I、II、III沿5 3移動(dòng)。9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。（三）DNA的復(fù)制過(guò)程（大腸桿菌為例）n 雙鏈的解開n RNA引物的合成n DNA鏈的延伸n 切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段1、雙鏈的解開- ftju制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。 ori(或o）、富含A、T的區(qū)段。從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子復(fù)制時(shí)，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復(fù)制點(diǎn)，這個(gè)復(fù)制點(diǎn)的形狀象一個(gè)叉子，故稱為復(fù)制叉雙鏈解開、復(fù)制起始P44大約20個(gè)Dn

11、aA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個(gè)9bp保守序列相結(jié)合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個(gè)13bp直接重復(fù)序列變性,形成開鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開DNA雙鏈2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至10個(gè)核苷酸，3、DNA鏈的延伸DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuous replication)：DNA復(fù)制時(shí)其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導(dǎo)鏈；合成方向與

12、復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。 在DNA復(fù)制過(guò)程中，前導(dǎo)鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成53 的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。4、切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段（復(fù)制終止）當(dāng)復(fù)制叉遇到約22個(gè)堿基的重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus蛋白復(fù)合物能使DnaB不再將DNA解鏈，阻擋復(fù)制叉繼續(xù)前移。P47在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填補(bǔ)上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈（四）復(fù)制的幾種主要方式 P421、雙鏈環(huán)狀、型復(fù)制、雙向等速2、滾環(huán)型：（1

13、）模板鏈和新合成的鏈分開;（2）不需RNA引物，在正鏈3OH上延伸（3）只有一個(gè)復(fù)制叉;3、D環(huán)復(fù)制-單向復(fù)制的特殊方式如：動(dòng)物線粒體DNA（五）真核生物中DNA的復(fù)制特點(diǎn)1、真核生物每條染色體上有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，多復(fù)制子（約150bp左右）；2、復(fù)制叉移動(dòng)的速度較慢（約50bp秒），僅為原核生物的110。3、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前,各個(gè)起始點(diǎn)不再重新開始DNA復(fù)制；真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。4、真核生物有多種DNA聚合酶。5、真核生物DNA復(fù)制過(guò)程中的引物及岡崎片段的長(zhǎng)度均小于原核生物。（真核岡崎片段長(zhǎng)約100-200bp，原核岡崎片段長(zhǎng)約1000-2000bp。）（

14、六）原核和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)比較 復(fù)制起點(diǎn)（ori）：原核一個(gè)，真核多個(gè)； 復(fù)制子 ：原核一個(gè)，真核多個(gè)； 復(fù)制子長(zhǎng)度：原核長(zhǎng)；真核短； 復(fù)制叉：原核多個(gè)；真核多個(gè)； 復(fù)制移動(dòng)速度：原核較快；真核較慢； 真核生物染色體在全部完成復(fù)制前，各起始點(diǎn)的DNA 復(fù)制不能再開始。而在 快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)制起點(diǎn)上可以連續(xù)開始新的DNA復(fù)制。 原核生物染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂同步，可以多次復(fù)制；真核生物染色體的復(fù)制發(fā)生在S期，是細(xì)胞分類的特定時(shí)期，而且僅此一次。四、DNA的修復(fù)DNA修復(fù)系統(tǒng)功能錯(cuò)配修復(fù)恢復(fù)錯(cuò)配堿基切除修復(fù)切除突變的堿基核甘酸切除修復(fù)修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù)SOS系統(tǒng)修復(fù)嘧

15、啶二體或甲基化DNADNA的修復(fù)，導(dǎo)致變異1、錯(cuò)配修復(fù) （mismatch repair）Dam甲基化酶使母鏈位于5GATC序列中腺甘酸甲基化甲基化緊隨在DNA復(fù)制之后進(jìn)行（幾秒種后至幾分鐘內(nèi)）根據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯(cuò)配堿基2、堿基切除修復(fù) excision repair 所有細(xì)胞中都帶有不同類型、能識(shí)別受損核苷酸位點(diǎn)的糖苷水解酶，它能特意切除受損核苷酸上的N-糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點(diǎn)，統(tǒng)稱為AP位點(diǎn)。一些堿基在自發(fā)或誘變下會(huì)發(fā)生脫酰胺，然后改變配對(duì)性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變* 腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)* 鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)* 胞嘧

16、啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對(duì)3、核苷酸切除修復(fù)1）通過(guò)特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位2）由酶的復(fù)合物在損傷的兩邊切除幾個(gè)核苷酸3） DNA 聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈4）DNA連接酶將切口補(bǔ)平4 、DNA的直接修復(fù)在DNA光解酶的作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對(duì)SOS反應(yīng) (SOS response)：是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，細(xì)胞為求生存而產(chǎn)生的 一種應(yīng)急措施。* 包括誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等。細(xì)胞癌變也與SOS反應(yīng)有關(guān)。兩個(gè)作用（1）DNA

17、的修復(fù)；（2）產(chǎn)生變異五、 DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposable element) 介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座子（transposon Tn）：存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)“轉(zhuǎn)座”這一命名并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座過(guò)程中，可移位因子的一個(gè)拷貝常常留在原來(lái)位置上，在新位點(diǎn)上出現(xiàn)的僅僅是它的拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA復(fù)制。原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1、插入序列(IS)IS是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子，不含有任何宿主基因，它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。 2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子(composite

18、transposon) 復(fù)合轉(zhuǎn)座子是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列 3、TnA家族n TnA家族沒有IS序列、體積龐大 (5000bp以上)、帶有3個(gè)基因，其中一個(gè)編碼-內(nèi)酰胺酶(AmpR)，另兩個(gè)則是轉(zhuǎn)座作用所必須的。(三）轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制n 轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用的普遍特征，是受體分子中有一段很短的(3l2bp)、被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。n 對(duì)于一個(gè)特定的轉(zhuǎn)座子來(lái)說(shuō)，它所復(fù)制的靶序列長(zhǎng)度是一樣的，如IS1兩翼總有9個(gè)堿基對(duì)的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。n 靶序列的復(fù)制可能起源于

19、特定內(nèi)切酶所造成的黏性DNA末端。（三）轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng) p63（1）轉(zhuǎn)座引起插入突變（2）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因（3）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變（4）轉(zhuǎn)座引起的 生物進(jìn)化反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）：指通過(guò)RNA為中介，反轉(zhuǎn)錄成DNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可動(dòng)元件。第三章 生物信息的傳遞（上） 從DNA到RNA轉(zhuǎn)錄(transcription) ：生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程 。參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA酶: RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子RNA合成方向：5 到 3轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為

20、轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性。與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。轉(zhuǎn)錄單元（transcription unit）一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件（一） RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶（大腸桿菌為例）-全酶=核心酶+ 因子亞基基因相對(duì)分子量亞基數(shù)組分功能rpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動(dòng)子識(shí)別rpoB1510001核心酶和共同形成RNA合成的活性中心rpoC1550001核心酶？11000（需查）1核心酶？rpoD700001因

21、子存在多種因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶特征比較酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)-鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶核質(zhì)hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8105dol小，1.09105dol引物無(wú)有產(chǎn)物較短，游離較長(zhǎng)，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行外切酶活性無(wú)5 3，3 5校對(duì)合成能力無(wú)有修復(fù)能力無(wú)有（二） 啟動(dòng)子(promoter)啟動(dòng)子定義：指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。 TA

22、TA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開） TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識(shí)別的信號(hào) 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-與新生RNA鏈第一個(gè)核甘酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基。真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)核心啟動(dòng)子（core promoter）定義：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游TATA區(qū)作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始2、上游啟動(dòng)子元件包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。（三） 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物-二元閉合復(fù)合物、二元開鏈復(fù)合物、三元復(fù)合物。（原核）三、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程1、起始位點(diǎn)的識(shí)別：RNA聚合酶與

23、啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。 RNA聚合酶全酶(a2bbs)與模板結(jié)合 2、轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶全酶(a2sbb)與模板結(jié)合 DNA雙鏈解開 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物: RNApol (a2sbb) - DNA - pppGpN- OH 33、RNA鏈的延伸 s亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。注意：9個(gè)核苷酸以前還在啟動(dòng)子區(qū)，容易脫落，一旦形成9個(gè)以上的核苷酸并

24、離開啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄正式進(jìn)入眼神階段。4、轉(zhuǎn)錄終止 終止子（terminator）：位于基因的末端，在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段回文序列（反向重復(fù)序列）約6-20bp。 真核生物終止: 由一段特定序列5AATAAA3和回文序列（反向重復(fù)序列）組成。 分為兩類： 強(qiáng)終止子內(nèi)部終止子：不依賴Rho ()因子的終止。 弱終止子 需要因子（rho factor），又稱為依賴性終止子（ Rho-dependent terminator）不依賴r因子的終止當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模

25、板上釋放出來(lái)，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，RNA的3端為寡聚U發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來(lái)。依賴r因子的終止r因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。（二）、真核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程1. 轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過(guò)程比原核生物復(fù)雜。（1）. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段 順式作用元件(cis-acting element)：影響自身基因表達(dá)活性的非

26、編碼DNA序列。 例： 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、弱化子等 增強(qiáng)子：在啟動(dòng)區(qū)存在的能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始的DNA序列。但不是啟動(dòng)子的一部分。特點(diǎn)：1.遠(yuǎn)距離效應(yīng)；2.無(wú)方向性；3.順式調(diào)節(jié)；4.無(wú)物種和基因的特異性；5.具有組織特異性；6.有相位性；7.有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。（2）. 轉(zhuǎn)錄因子：能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors, TF)。 參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的TF -TFD、 TFA

27、、TFB、TFF、TFE、TFH（3）轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。 （4）模板理論(piecing theory) 一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性、有專一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。 2. 轉(zhuǎn)錄延伸真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。 3. 轉(zhuǎn)錄終止 和轉(zhuǎn)錄后修飾密

28、切相關(guān)。四、轉(zhuǎn)錄后加工5端加帽、3端加尾、RNA的剪接、RNA的編輯1、在5端加帽 5端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。帽子結(jié)構(gòu)功能： 能被核糖體小亞基識(shí)別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合； m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA 5末端，以保護(hù)mRNA免受5核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。2、3端加尾-多聚腺苷酸尾巴-AAUAAA：準(zhǔn)確切割。加poly（A）多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。3、RNA的剪接生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型：U-AG、AU-AC、類內(nèi)含子、類內(nèi)含子類內(nèi)含子參與RNA剪接的物質(zhì)： snR

29、NA（核內(nèi)小分子RNA）、snRNP（與snRNA結(jié)合的核蛋白） 、核內(nèi)RNA（U1、U2、 U4、U5、U6）4、RNA的編輯* 編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。五、原核生物與真核生物mRNA的特征比較1、原核生物mRNA的特征 半衰期短 多以多順反子的形式存在 單順反子mRNA：只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。多順反子mRNA：編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。Z： -半乳糖苷酶Y： 透過(guò)酶A：乙酰基轉(zhuǎn)移酶ZYA為結(jié)構(gòu)基因 5 端無(wú)“帽子”結(jié)構(gòu)， 3 端沒有或只有較短的poly（A ）結(jié)構(gòu)。 SD序列：原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一

30、被稱為SD序列的保守區(qū)。mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。P85 2、真核生物mRNA的特征“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。 5 端存在“帽子”結(jié)構(gòu)多數(shù)mRNA 3 端具有poly（A ）尾巴（組蛋白除外）以單順反子的形式存在六、RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)相同點(diǎn)：1、都以DNA鏈作為模板2、合成的方向均為53 3、聚合反應(yīng)均是通過(guò)核苷酸之間形成的3,5-磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長(zhǎng)。不同點(diǎn)：復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩條鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）mRNA， tRNA， rRNA

31、配對(duì)A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物RNA引物無(wú)第四章 生物信息的傳遞（下） 從mRNA到蛋白質(zhì)翻譯：指將mRNA鏈上的核甘酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開始，按每三個(gè)核甘酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過(guò)程。蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所是核糖體。蛋白質(zhì)合成的模板是mRNA模板與氨基酸之間的接合體是tRNA蛋白質(zhì)合成的原料是20種氨基酸一、遺傳密碼三聯(lián)子（一）三聯(lián)子密碼：mRNA鏈上每三個(gè)核甘酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核甘酸就稱為密碼子或三聯(lián)子密碼(triplet coden) 。至1966年，20種氨基酸對(duì)應(yīng)的61個(gè)密碼子和三個(gè)終止密碼子全部被查清。（三）遺傳密碼的性質(zhì)1、

32、連續(xù)性編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無(wú)間斷也無(wú)交叉。 基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導(dǎo)致框移突變(frameshift mutation)。 從mRNA 5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(open reading frame, ORF)。 2、簡(jiǎn)并性 由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）。3、通用性與特殊性蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。

33、已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。4、擺動(dòng)性轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA上的反密碼子需要通過(guò)堿基互補(bǔ)與mRNA上的遺傳密碼子反向配對(duì)結(jié)合，在密碼子與反密碼子的配對(duì)中，前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則，第三對(duì)堿基有一定的自由度，可以“擺動(dòng)”，這種現(xiàn)象稱為密碼子的擺動(dòng)性。 二、tRNA的結(jié)構(gòu)、功能與種類（一） tRNA的結(jié)構(gòu) 1、二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形2、三級(jí)結(jié)構(gòu)： “L”形（二） tRNA的功能1、解讀mRNA的遺傳信息2、運(yùn)輸?shù)墓ぞ?，運(yùn)載氨基酸t(yī)RNA有兩個(gè)關(guān)鍵部位： 3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。 與mRNA結(jié)合部位反密碼子部位 tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA鏈上的密碼

34、子相識(shí)別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。1、起始tRNA和延伸tRNA 能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA稱起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。真核生物：起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸是Met，起始AA-tRNA為Met-tRNAMet。原核生物：起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸并不是 甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA為fMet-tRNAfMet2、同工tRNA 代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。 同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶識(shí)別（P119）。3、

35、校正tRNA無(wú)義突變校正tRNA：可以通過(guò)改變反密碼子區(qū)校正無(wú)義突變錯(cuò)義突變校正tRNA：通過(guò)反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。 無(wú)義突變：在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無(wú)功能的或無(wú)意義的多肽，這種突變就稱為無(wú)義突變。 錯(cuò)義突變：由于結(jié)構(gòu)基因中某個(gè)核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變?yōu)榱硪环N氨基酸的密碼子，這種基因突變叫錯(cuò)義突變。 GGA（甘氨酸） AGA（精氨酸）四、氨酰-tRNA合成酶 AA- tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，它既能識(shí)別tR

36、NA，又能識(shí)別氨基酸，對(duì)兩者都具有高度的專一性。三、核糖體的結(jié)構(gòu)與功能 核糖體是由rRNA（ribosomal ribonucleic acid）和多種蛋白質(zhì)結(jié)合而成的一種大的核糖核蛋白顆粒，蛋白質(zhì)肽鍵的合成就是在這種核糖體上進(jìn)行的。細(xì)菌是70s50s30s 哺乳動(dòng)物是80s60s40s（二）核糖體的功能：合成蛋白質(zhì)在單個(gè)核糖體上，可化分多個(gè)功能活性中心，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中各有專一的識(shí)別作用和功能。mRNA結(jié)合部位小亞基結(jié)合或接受AA-tRNA部位（A位）大亞基結(jié)合或接受肽基tRNA的部位大亞基肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）大亞基形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心）大亞基 四、蛋白質(zhì)合成的過(guò)程(生物學(xué)機(jī)制） 氨

37、基酸的活化 翻譯的起始 肽鏈的延伸 肽鏈的終止 蛋白質(zhì)前體的加工(一)氨基酸的活化原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸 起始AA-tRNA是：fMet-tRNAfMet真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸 起始AA-tRNA是：Met-tRNAMet(二)翻譯的起始原核生物（細(xì)菌）為例：所需成分：30S小亞基、 50S大亞基、模板mRNA、 fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻譯起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、翻譯起始(翻譯起始復(fù)合物形成)又可被分成3步： （P129）1. 核蛋白體大小亞基分離2、30S小亞基通過(guò)SD序列與mRNA模板相結(jié)合。3.在IF-2和GTP的幫助下，

38、 fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對(duì)。4、帶有tRNA、mRNA和3個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。真核生物翻譯起始的特點(diǎn)核糖體較大,為80；起始因子比較多； mRNA 5端具有m7Gppp帽子結(jié)構(gòu) Met-tRNAMet mRNA的5端帽子結(jié)構(gòu)和3端polyA都參與形成翻譯起始復(fù)合物； 真核生物翻譯起始復(fù)合物形成(區(qū)別原核生物)原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet

39、相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始復(fù)合物（P131）。(三)肽鏈的延伸肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個(gè)氨基酸就是一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位。延伸因子(elongation factor, EF) ： 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)、 EF-G真核生物：EF-1 、EF-2 1、AA-tRNA與核糖體A位點(diǎn)的結(jié)合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts兩種延伸因子2、肽鍵形成：是由轉(zhuǎn)肽酶/肽基轉(zhuǎn)移酶催化3、移位：核糖體向mRNA3端方向移動(dòng)一個(gè)密碼子。需要消耗GTP，并需E

40、F-G延伸因子A位點(diǎn)是新到來(lái)的氨酰-tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。P位點(diǎn)是肽酰- tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。E位點(diǎn)是延伸過(guò)程中釋放tRNA的位點(diǎn)，即，去氨酰-tRNA通過(guò)E位點(diǎn)脫出，釋放到核糖體外的胞質(zhì)中。（四）肽鏈的終止 RF1：識(shí)別終止密碼子UAA和UAG 終止因子 RF2：識(shí)別終止密碼子UAA和UGA RF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，協(xié)助肽鏈的釋放真核生物只有一個(gè)終止因子（eRF）(五)蛋白質(zhì)前體的加工1、N端fMet或Met的切除2、二硫鍵的形成3、特定氨基酸的修飾 磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化和羧基化4、切除新生肽鏈中非功能片段（六）蛋白質(zhì)折疊由核糖體合成的所有新生肽鏈必須

41、通過(guò)正確的折疊才能形成動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的三位構(gòu)象，從而表現(xiàn)出生物學(xué)活性或功能。新生多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)具有活性（對(duì)于寡聚蛋白需要組裝稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)才有活性。(七)蛋白質(zhì)合成抑制劑 青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)生作用，從而阻遏原核生物蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。被廣泛用于人類醫(yī)學(xué)。 氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。氯霉素有時(shí)也用于治病，但劑量和周期受到較嚴(yán)控制。五、蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制1、翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制(1)線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)(2)葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)3、核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制4

42、、蛋白質(zhì)的降解*蛋白質(zhì)的合成位點(diǎn)與功能位點(diǎn)常常被細(xì)胞內(nèi)的膜所隔開，蛋白質(zhì)需要運(yùn)轉(zhuǎn)。*核糖體是真核生物細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，任何時(shí)候都有許多蛋白質(zhì)被輸送到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各個(gè)部分，補(bǔ)充和更新細(xì)胞功能。*細(xì)胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)必須準(zhǔn)確無(wú)誤地定向運(yùn)送才能保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。 *細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成：絕大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中合成；一小部分在細(xì)胞器（葉綠體和線粒體）中合成。*定位于細(xì)胞器內(nèi)的大部分蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成，細(xì)胞器內(nèi)合成的留在細(xì)胞器內(nèi)。*蛋白質(zhì)插入或穿過(guò)生物膜的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)（protein translocation）。蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的兩種方式翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步（c

43、o-translational translocation） 是即將進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)的易位方式； 蛋白質(zhì)正合成的時(shí)候就可與運(yùn)轉(zhuǎn)裝置結(jié)合； 蛋白質(zhì)合成時(shí)，核糖體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，稱膜結(jié)合核糖體(membrane-bound ribosome）。 分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機(jī)制運(yùn)輸?shù)姆g后運(yùn)轉(zhuǎn)（post-translational translocation）蛋白質(zhì)翻譯完成后從核糖體上釋放，然合擴(kuò)散至合適的靶膜并與運(yùn)轉(zhuǎn)裝置結(jié)合。蛋白質(zhì)合成時(shí)，其核糖體不與任何細(xì)胞器相連，稱游離核糖體(free ribosome)在細(xì)胞器發(fā)育過(guò)程中，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)?。參與生物膜形成

44、的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制鑲?cè)肽?nèi)。蛋白性質(zhì) 運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制 主要類型 分泌 蛋白質(zhì)在結(jié)合核糖體上合成，并以翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制運(yùn)輸免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等細(xì)胞器發(fā)育 蛋白質(zhì)在游離核糖體上合成，以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸 核、葉綠體、線粒體、乙醛酸循環(huán)體、過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器中的蛋白質(zhì) 膜的形成 兩種機(jī)制兼有 質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、類囊體中的蛋白質(zhì) 1、翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制信號(hào)肽假說(shuō)信號(hào)肽：能啟動(dòng)蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)的任何一段多肽。（常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端氨基酸序列（有時(shí)不一定在N端）。絕大部分被運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個(gè)信號(hào)肽。信號(hào)序列特點(diǎn)：（1）一般帶有10-15個(gè)疏

45、水氨基酸；（2）在靠近該序列N-端常常有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（丙氨酸或甘氨酸）。信號(hào)肽假說(shuō)內(nèi)容：（1）蛋白質(zhì)合成起始首先合成信號(hào)肽（2）SRP（信號(hào)識(shí)別蛋白）與信號(hào)肽結(jié)合，翻譯暫停（3）SRP與SRP受體結(jié)合，核糖體與膜結(jié)合，翻譯重新開始（4）信號(hào)肽進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)（5）蛋白質(zhì)過(guò)膜，信號(hào)肽被切除，翻譯繼續(xù)進(jìn)行（6）蛋白質(zhì)完全過(guò)膜，核糖體解離信號(hào)肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系P144（1）完整信號(hào)肽是保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的必要條件；（2）僅有信號(hào)肽不足以保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生；（3）信號(hào)序列切除并不是轉(zhuǎn)運(yùn)所必

46、需；（4）并非所有運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)都有可降解的信號(hào)肽。蛋白質(zhì)翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步運(yùn)輸?shù)幕具^(guò)程 可分兩個(gè)階段：首先：帶有新生肽鏈的核糖體與膜結(jié)合；然后：新生肽鏈進(jìn)入膜通道并易位。 核糖體與膜結(jié)合需要信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle, SRP）。SRP有兩種能力：結(jié)合新合成的分泌型蛋白的信號(hào)序列；結(jié)合位于膜上的 SRP 受體。2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制前導(dǎo)肽及其特性: 翻譯后跨膜易位的蛋白質(zhì)，前體一般含前導(dǎo)肽(leader peptide)，前導(dǎo)肽在跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)中起重要作用。 過(guò)膜后，前導(dǎo)肽水解，蛋白質(zhì)變?yōu)橛泄δ艿牡鞍踪|(zhì)。前導(dǎo)肽的一般特性：（1）帶正電荷堿性氨基酸（Arg）較豐富， 分

47、散于不帶電荷的氨基酸序列之間；（2）缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；（3）羥基氨基酸（Ser）含量較高；（4）有形成兩親（親水和疏水）- 螺旋能力。線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn) Hsp70為分子伴侶 分子伴侶：結(jié)合在一些不完全裝配或不恰當(dāng)折疊蛋白上，幫助它們折疊或防止它們聚集的蛋白質(zhì)。 分子伴侶的生物學(xué)功能 (1)幫助新生蛋白質(zhì)正確折疊 (2)糾正錯(cuò)誤折疊或介導(dǎo)其降解 泛素活化酶 (ubiquitin - activating enzyme，E1) 泛素結(jié)合酶（ubiquitin - conjugating enzyme，E2) 泛素蛋白連接酶(ubiquitin -proteinligating enzy

48、me, E3)E1,E2,E3的作用： E1激活泛素分子， E2就負(fù)責(zé)把泛素分子綁在被降解蛋白質(zhì)上。 E3能識(shí)別被降解的蛋白質(zhì)。第五章 分子生物學(xué)研究法重組DNA技術(shù)-基因工程 分子雜交及相關(guān)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理和應(yīng)用DNA多態(tài)性及其檢測(cè) 基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等。 基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入新的宿主細(xì)胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達(dá)。 基因工程技術(shù)實(shí)際上是核酸操作技術(shù)的一部分。1、理論上的三大發(fā)現(xiàn) 遺傳物質(zhì)主要是DNA D

49、NA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制 遺傳密碼子的破譯2、技術(shù)上的三大發(fā)明 限制酶和連接酶體外切割和連接DNA片斷 質(zhì)粒改造成載體以攜帶DNA片斷克隆 逆轉(zhuǎn)錄酶的使用常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基載體 vectorl 自我復(fù)制l 克隆載體、表達(dá)載體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC）噬菌體（，M13）真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN載體的條件 分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位點(diǎn) 可自主復(fù)制 有足夠的copy數(shù) 帶篩選的標(biāo)

50、志1982年 - 轉(zhuǎn)基因小鼠1997年 克隆綿羊“多利”1998年- 克隆鼠2001年2月 - 人類基因組 重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技術(shù)。 重組DNA技術(shù)（Recombinant DNA Technique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。 這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。 基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變

51、和PCR擴(kuò)增等。 基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入新的宿主細(xì)胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增值能力和表達(dá)。 基因工程技術(shù)實(shí)際上是核酸操作技術(shù)的一部分?；蛘哒f(shuō)基因操作技術(shù)服務(wù)于基因工程。一、限制酶 限制性內(nèi)切核酸酶(restrictive endonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術(shù)刀”）。 發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。1、限制酶的命名 命名原則：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。如： 屬名 菌

52、株名 E co R I 種名 編號(hào) EcoRI來(lái)源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。2、限制酶的特點(diǎn)： （1）. 限制性內(nèi)切酶一般識(shí)別完全的回文結(jié)構(gòu)，它具有兩個(gè)基本特點(diǎn)： 能夠在中間劃一個(gè)對(duì)稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對(duì)稱互補(bǔ)配對(duì)； 兩條互補(bǔ)鏈的53的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180度，則兩條鏈重疊。（2）. 識(shí)別-8個(gè)相連的核苷酸組成的特定核甘酸序列。（3） 切割方式有兩種 錯(cuò)位切割，產(chǎn)生互補(bǔ)性的粘性末端。 錯(cuò)位切割所產(chǎn)生的DNA末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進(jìn)，這種末端稱為黏性末端。帶有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互補(bǔ)配對(duì)，連接成新的重組分

53、子。 沿對(duì)稱軸切割，產(chǎn)生平齊末端切割后，DNA末端的一條鏈多出一至幾個(gè)核苷酸，成為突出末端，又稱粘性末端包括3突出、5突出。切割兩條鏈時(shí)產(chǎn)生兩端平整的DNA分子，稱為平末端。（4） 具有同裂酶 來(lái)源不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別同樣的核甘酸靶序列。 如：BamH I和Bst I具有相同的識(shí)別序列GGATCC。（5） 具有同尾酶 來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也不同，但卻產(chǎn)生相同的黏性末端，故同尾酶產(chǎn)生的黏性末端可以連接起來(lái)，但一般不能再被原來(lái)的任何一種酶所切割。 如：Taq I、Cla I和Acc I為一組同尾酶，其中任何一種酶切割DNA分子都產(chǎn)生5端CG凸出的粘性末端。二、目的基因及載體（一）目的基因（一）目的基因的獲得1）化學(xué)合成法：較短的基因（60-80bp）