血球計數(shù)板計數(shù)法

1、一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?1、明確顯微鏡計數(shù)的原理。 2學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù) 的方法。 二、實驗材料二、實驗材料 酵母菌懸液，血球計數(shù)板，顯微鏡，蓋 玻片，無菌毛細管、吸水紙等。 三、實驗原理三、實驗原理 利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)， 是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點 是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液 （或孢子懸液）放在血球計數(shù)板載玻片與蓋 玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。 由于計數(shù)室的容積是一定的（0.13），所以 可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來 換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此 法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱 為總菌計數(shù)法。 血球計

2、數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上 由四條槽構(gòu)成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽 隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每 個方格網(wǎng)共分九個大方格，中間的大方格即為計數(shù) 室，微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進行。 計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個 大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25 個小方格，共400小格；另一種是一個大方格分 成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格， 總共也是400小格。所以無論是哪種規(guī)格的計數(shù) 板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的。 每一個大方格邊長為1，則每一大方格的面積 為12，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的 高度為0.1，所以計數(shù)室的容積為

3、0.13。 推導(dǎo)：推導(dǎo)：1mm1mm方格的計數(shù)方格的計數(shù) 1mm1mm表示計數(shù)室的邊長，即一個大方格的邊長。由于計 數(shù)室厚度為0.1mm，所以計數(shù)室的總體積為0.1mm3。 11625型的計數(shù)公式： 酵母細胞個數(shù)酵母細胞個數(shù)1mL=100個小方格細胞總數(shù)個小方格細胞總數(shù)/100 40010000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 22516型的計數(shù)公式： 酵母細胞個數(shù)酵母細胞個數(shù)1mL80個小方格細胞總數(shù)個小方格細胞總數(shù)/80 40010000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 假設(shè)：計數(shù)室內(nèi)酵母菌為假設(shè)：計數(shù)室內(nèi)酵母菌為a個，稀釋倍數(shù)個，稀釋倍數(shù) 為為b，則，則10mL培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)為：培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)為： a105b

4、例例4、通常用血球計數(shù)板對培養(yǎng)液中酵母菌進行計數(shù)，若、通常用血球計數(shù)板對培養(yǎng)液中酵母菌進行計數(shù)，若 計數(shù)室為計數(shù)室為1mm1mm0.1mm方格，由方格，由400個小方格組成，個小方格組成， 如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以計數(shù)，應(yīng)先如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以計數(shù)，應(yīng)先后后 再計數(shù)。若多次重復(fù)計數(shù)后，算得每個小方格中平均有再計數(shù)。若多次重復(fù)計數(shù)后，算得每個小方格中平均有5 個酵母菌，則個酵母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有個。個。 （參考答案：稀釋；（參考答案：稀釋；2108） 540010000102108。 例例6、在用血球計數(shù)板（在用血球計數(shù)板（2mm2mm

5、方格）對某一稀釋方格）對某一稀釋 50倍樣品進行計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)在一個計數(shù)室內(nèi)（蓋玻片下倍樣品進行計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)在一個計數(shù)室內(nèi)（蓋玻片下 的培養(yǎng)液厚度為的培養(yǎng)液厚度為0.1mm）酵母菌平均數(shù)為）酵母菌平均數(shù)為16個，據(jù)此估個，據(jù)此估 算算10mL培養(yǎng)液中有酵母菌培養(yǎng)液中有酵母菌 個。個。 （參考答案：（參考答案：2107） 四、操作過程四、操作過程 1稀釋 將酵母菌懸液進行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃， 可不必稀釋。 2鏡檢計數(shù)室 在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。 若有污物，則需清洗后才能進行計數(shù)。 3加樣品 將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片， 再用無菌的細口滴管將稀釋的酵母菌 液由蓋玻片邊緣滴一小滴

6、（不宜過 多），使菌液沿縫隙靠毛細滲透作用 自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充 滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置 510分鐘即可計數(shù)。 4顯微鏡計數(shù) 將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計 數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若 發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一 般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個菌體為宜。若 選用2516規(guī)格的計數(shù)板則每個計數(shù)室選5個中方格， 可選4個角和中央的中格（即80個小格），若選用 1625規(guī)格的計數(shù)板，則數(shù)四個角：左上、右上、左下、 右下的四個中方格，（即100小格）中的菌體進行計數(shù)。 位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如

7、遇酵 母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作兩個菌體 計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算 樣品的含菌量。 5.對每個樣品計數(shù)三次，取其平均值， 計算每1ml菌液中所含的酵母菌個數(shù)。 各中格中菌數(shù) A B二室平均值菌數(shù)/ml 12345 第一室 第二室 A-五個中方格的總菌數(shù) B-稀釋倍數(shù) 6清洗血球計數(shù)板 血球汁數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切 勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機吹 干，或用95的乙醇、無水乙醇、丙酮等有 機溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格 內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈， 則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。 7.注意事項 （1）實驗過程中發(fā)現(xiàn)，如何稀釋？ 如果發(fā)現(xiàn)每小格中酵母菌的個數(shù)多于10個，可按以下處理： 取1ml酵母菌培養(yǎng)液加入到盛有9ml蒸餾水的試管中，搖勻， 再計數(shù)；如發(fā)現(xiàn)酵母菌的個數(shù)仍然過大，則同樣再稀釋一次， 直至每小格中酵母菌的個數(shù)介于5-10，并作記錄。 （2）調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯 微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計 數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。 （3）因菌液在血球計數(shù)板處于不同空間，要在不同焦距下才 能看全，所以，觀察時必須不斷調(diào)細螺旋（調(diào)焦距長短），