血凝儀檢測原理及應(yīng)用解析

1、1 （一）（一） 凝血常規(guī)（常規(guī)凝血功能篩選組合）凝血常規(guī)（常規(guī)凝血功能篩選組合） 1. 凝血常規(guī)凝血常規(guī)1（6項）：項）： PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚體、二聚體、AT- 適合于：干部病房、適合于：干部病房、ICU病房、呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科、病房、呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科、 血液內(nèi)科、產(chǎn)科、腫瘤科、心內(nèi)科、腎內(nèi)科和術(shù)后出血患血液內(nèi)科、產(chǎn)科、腫瘤科、心內(nèi)科、腎內(nèi)科和術(shù)后出血患 者等，以及其它科室者等，以及其它科室60歲以上高危人群。歲以上高危人群。 2. 凝血常規(guī)凝血常規(guī)2（4項）：項）： PT、APTT、TT、Fib-C 適合于：一般手術(shù)患者。適合于：一般手術(shù)患者。 2 （二）（二）

2、DIC篩選試驗組合：篩選試驗組合： PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚體、二聚體、FDP、 AT- （三）血友病組合：（三）血友病組合： PT、APTT、TT、:C、:C、抑制物檢查抑制物檢查 （四）（四） 凝血因子全套檢查：凝血因子全套檢查： PT、APTT、TT、Fib-C、:C、:C、：C、 :C、:C、：C 3 （五）藥物性出血的監(jiān)測（五）藥物性出血的監(jiān)測 1. 口服華法林治療監(jiān)測組合：口服華法林治療監(jiān)測組合：PT 2. 普通肝素治療監(jiān)測組合：普通肝素治療監(jiān)測組合： TT、APTT、AT- 3. 溶栓藥物治療（溶栓藥物治療（SK、UK、t-PA）監(jiān)測組合：）監(jiān)測組合： PT、A

3、PTT、D-二聚體、二聚體、TT、Fib-C、FDP 4 止血血栓止血血栓 5 三個階段，兩個途徑三個階段，兩個途徑 （內(nèi)源性、外源性）（內(nèi)源性、外源性） l第一階段：凝血酶原激活物形成第一階段：凝血酶原激活物形成 l第二階段：凝血酶形成第二階段：凝血酶形成 l第三階段：纖維蛋白形成第三階段：纖維蛋白形成 6 凝子因子參與的凝血途徑 n內(nèi)源性凝血途徑：， n外源性凝血途徑：， n共同凝血途徑：， 7 8 傳統(tǒng)的凝血途徑的修改傳統(tǒng)的凝血途徑的修改 u外源性的因子在組織因子的結(jié)合下既可激活因 子，又可激活內(nèi)源性的第因子，從而打破了內(nèi)源 與外源的界限。 u因子缺乏時并不引起出血，這說明第因子并不 一

4、定只被因子激活，現(xiàn)已證明本身具有自身激 活作用。 u凝血酶（因子）也可激活因子，原來認為只有 因子才能激活因子。 uTF被激活并與因子結(jié)合后會被一種組織因子途 徑抑制物（TFPI）所抑制；后者已成為一種新型 抗凝劑。 9 n二、凝血檢驗標本收集和預(yù)處理二、凝血檢驗標本收集和預(yù)處理 10 （一）標（一）標 本本 采采 集集 1. 抽血注意事項抽血注意事項 （1）抽血管首選優(yōu)質(zhì)塑料管； （2）定量抽血完畢，立即將標本輕柔顛倒混勻5次， 避免劇烈搖動； （3）許多專家建議抽血的第一管血不用作血栓試驗， 盡量選第二管。 11 2. 抗凝劑問題抗凝劑問題 （1）世界衛(wèi)生組織/美國臨床和實驗室標準協(xié)會 （

5、WHO/CLSI）都推薦使用0.109mol/L枸櫞酸鈉（3.2% Na3C6H5O72H2O）作為凝血檢驗的抗凝劑； （2）一般選用1份抗凝劑+9份靜脈血當Hct 25%55%時； （3）若Hct 25%或55%時，抗凝劑的用量=0.00185 全血量1- Hct 100； 12 Hct異常時抗凝劑和抽血量異常時抗凝劑和抽血量 13 高高Hct的影響的影響 病例：真性紅細胞增多癥患者，Hct 0.562 （1）1：9比例抗凝結(jié)果（錯誤）： PT 19.2s，PT-INR 1.78，APTT 62.1s， Fib-C 1.67g/L，TT 22.9s，與臨床不符。 （2） 0.2 0.0018

6、5（100-56.2） 計算后應(yīng)抽血2.5ml，結(jié)果（正確）為： PT 13.9s，PT-INR 1.30，APTT36.2s， Fib-C 1.70g/L，TT 19.7s，與臨床相符。 14 （二） 離心問題離心問題 1. 血栓試驗使用的血漿為PPP； 2. 一般要求20002500g/min（3000r/min ），離 心時間為10min左右，轉(zhuǎn)速N N（轉(zhuǎn)/ /分）與“g”g”的 轉(zhuǎn)換關(guān)系：g=11.18g=11.181010-7 -7半徑（mm mm）N N（轉(zhuǎn)/ / 分）； 3. 離心溫度室溫即可，但不可超過25，4離心 條件應(yīng)該提倡。 15 （三）（三） 即時試驗標本的要求即時試

7、驗標本的要求 1. 標本盡可能在4小時內(nèi)完成； 2. 篩查試驗和一些因子測定時，應(yīng)避免將標本長時 間室溫放置； 3. 因子測定時，標本要避免冷藏。 16 （四）分離后血漿標本的處理（四）分離后血漿標本的處理 1. 建議將標本保存在-70以下條件，凝血因子至 少可穩(wěn)定6個月； 2. 短期保存可在-35條件，-20條件通常是不理 想的； 3. 冷凍血漿解凍應(yīng)放置37水浴條件，并輕輕搖動 45分鐘，分析前輕柔地顛倒混勻。室溫放置自 然解凍是不可取的，因室溫放置會有冷沉淀形成， :C和vWF會減少，并有纖維蛋白原析出。冷凍過 的血漿不能再次冷凍。 17 XII XI IX VIII 外源凝血途徑外源凝

8、血途徑 檢查檢查 PT 內(nèi)源凝血途徑內(nèi)源凝血途徑 檢查檢查 APTT 組織因子組織因子VII+ XXa II 凝血酶原凝血酶原 IIa（凝血酶）（凝血酶） I (FIB) Ia (凝塊凝塊) V 組織因子途徑組織因子途徑 TF TFPI 共同途徑途徑共同途徑途徑 檢查檢查 TT 凝血途徑示意圖 18 三、凝血酶原時間測定（三、凝血酶原時間測定（PT） 19 III IV PL III Ca , PL 2+ Ca , PL 2+ X II VII XIII I IX VIII VII V IV III II XI XII in Blood血液中 血液中 in Plasma血漿中 血漿中 PT R

9、eagent Fibrin Extrinsic System 外在系統(tǒng)外在系統(tǒng) Measure Clotting Time without Tissue Factor Calcium（ （Ca ） ） 2+ Blood Sampling withoutwithout Trisodium Citrate Normal Range 9-14 sec 37 X V I XII XIII X VII IX VIII V IV II III I Phospholipid XI XIII （一）檢（一）檢 測測 原原 理理 20 PT檢測的原理 n在受檢血漿中加入過量的組織凝血活酶和 鈣離子，使凝血酶原變

10、為凝血酶，后者使 纖維蛋白原與轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。觀察血漿 凝固所需的時間即為凝血酶原時間。 CA1500儀器法判斷終點采用光學法，即當 纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白時，經(jīng)光照后 產(chǎn)生的散射光發(fā)生變化，儀器判讀終點。 21 （二）臨（二）臨 床床 應(yīng)應(yīng) 用用 1. 延長 （1）見于先天性外源凝血因子（、 ）缺乏癥和低/無FIB血癥，凝血因子、 輕微減少，PT的延長幅度也不大，因子減少病人，其 PT經(jīng)常在正常范圍； （2）口服抗凝藥，如華法令等； （3）維生素K缺乏癥； （4）DIC及原發(fā)性纖溶癥； （5）肝臟疾病； （6）血中有抗凝物質(zhì)（狼瘡抗凝物、抗磷脂抗體、肝素、 FDP以及抗、 的抗體）。 22

11、 2 .縮短 （1）血栓前狀態(tài)和血栓性疾??； （2）見于先天性V因子增多； （3）長期口服避孕藥； （4）使用重組的因子治療時； （5）標本放置在28， 因子冷激活發(fā)生，使PT縮短。 3.口服抗凝劑的檢測 PT和PT-INR是監(jiān)測口服抗凝劑的常用指標，中國人PT- INR在1.5-2.5用藥較為安全和有效。 23 低低ISIISI試劑的優(yōu)勢試劑的優(yōu)勢 ISI=1.0 ISI=1.0試劑試劑 ISI=2.0ISI=2.0試劑試劑 MNPT 11 sec 11 sec 11 sec11 sec PT 22 sec 22 sec 15.6 sec15.6 sec PT-INR-INR (22/11)

12、 (22/11) = =2.0 2.0 (15.6/11)(15.6/11) =2.0 =2.0 當系統(tǒng)誤差是當系統(tǒng)誤差是 (21/11) (21/11) = = 1.91 1.91 (14.6/11)(14.6/11) = =1.761.76 1 1秒時的秒時的INRINR (23/11) (23/11) = = 2.092.09 (16.6/11)(16.6/11) = =2.282.28 INR INR誤差范圍誤差范圍 1.91 1.91 2.092.09 1.76 1.76 2.282.28 1 2 1 1 2 2 24 MNPT的確定方法的確定方法 標本：多份混合血漿（20份以上）

13、年齡：18-55歲 性別：男、女（非妊娠、非經(jīng)期）各半 藥物的影響： 激素、抗生素、口服避 孕藥、降壓藥、維生素 采血前的要求：勿劇烈運動空腹或只服 少量無脂類食物 25 四四、 26 PL Ca , PL 2+ Ca , PL 2+ X IX XI XII I Activator IV IV III XIII XII XI X IX VIII VII V II I XIII XII XI X IX VIII VII V IV III II I APTT檢檢 測測 原原 理理 in Blood in Plasma without Blood Sampling withoutwithout Tr

14、isodium Citrate APTT Reagent Intrinsic System Measure Clotting Time Ellagic acid Calcium（ （Ca ） ） 2+ Normal Range 20-40 sec CaCl2 Phospholipid Fibrin 37 V II VIII 27 APTT檢測的原理 n37條件下，以白陶土（激活劑）激活因子和 ，以腦磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供 凝血的催化表面，在Ca2+的參與下，觀察貧血小 板血漿凝固所需的時間即為活化部分凝血活酶時 間。CA1500儀器法判斷重點采用光學法，即當纖 維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋

15、白時，經(jīng)光照后產(chǎn)生的散 射光發(fā)生變化，儀器判讀終點。 28 臨臨 床床 應(yīng)應(yīng) 用用 1 .延長 （1）見于內(nèi)源性凝血因子（、）缺乏， 如血友病 A、血友病B及 因子缺乏癥； （2）嚴重的凝血酶原、和FIB缺乏，如肝臟疾病、阻 塞性黃疸、新生兒出血癥、腸道滅菌綜合征、吸收不良綜 合征、口服抗凝劑、應(yīng)用肝素及FIB缺乏血癥； （3）纖溶活性增強，如繼發(fā)性、原發(fā)性纖溶亢進及循環(huán)血 液中有纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）； （4）血液中有抗凝物質(zhì)，如抗因子或抗體，狼瘡抗凝 物質(zhì)等。 29 2.縮短縮短 （1）高凝狀態(tài)，如DIC的高凝期、促凝物質(zhì) 進入血液以及凝血因子的活性增高等； （2）血栓性疾病，如

16、心肌梗死、不穩(wěn)定性心 絞痛、腦血管病變、糖尿病伴血管病變、 肺梗死、深靜脈血栓形成妊以及高癥、腎 病綜合征和嚴重的灼傷等。 30 3.肝素治療的監(jiān)測 （1）肝素用于預(yù)防血栓形成時，APTT為同 時檢測的正常對照值的1.5倍； （2）肝素用于治療的安全有效范圍是APTT 為同時檢測的正常對照值的1.5-2.5倍。 31 APTT測定常見的問題測定常見的問題 1. 分析前因素分析前因素 2. APTT試劑（激活劑） 32 33 34 35 臨臨 床床 應(yīng)應(yīng) 用用 1 延長 （1）見于FIB水平或功能減低，如低FIB血 癥或異常FIB血癥； （2）應(yīng)用肝素或肝素類物質(zhì)存在（如SLE、 肝病和腎病等）

17、； （3）見于FDP增多。 36 2 縮短 見于高凝狀態(tài) 3 作為溶栓藥物，如鏈激酶（SK），尿激酶 （UK）和組織性纖溶酶原激活劑（t-PA） 等溶栓治療的監(jiān)測指標。 TT在正常對照值 的1.52.5倍 ，治療安全有效。 37 TT測定常見的問題測定常見的問題 1.分析前因素分析前因素 2.TT試劑 凝血酶試劑 :來源于牛； 對肝素和FDP高度敏感； TT試劑保存時間較短，不宜重復(fù)使用。 38 PT、APTT、TT 聯(lián)合分析一聯(lián)合分析一 39 OAT PT、APTT、TT 聯(lián)合分析二聯(lián)合分析二 40 凝血因子FVIII或IX或XI或XII缺陷 PT、APTT、TT 聯(lián)合分析三聯(lián)合分析三 41

18、 纖溶過程（纖溶系統(tǒng)）纖溶過程（纖溶系統(tǒng)） FIB （纖維蛋白原）（纖維蛋白原） 纖維蛋白纖維蛋白 (血栓）血栓） FSPs (包括包括D-D) FDPs (統(tǒng)稱統(tǒng)稱)FDP 纖溶酶原纖溶酶原 (抗纖溶酶抗纖溶酶) 激活劑激活劑 抑制物抑制物 抑制物抑制物 42 43 IIa IIa III XIII XII XI X IX VIII VII V IV II I III I XIII XII XI X IX VIII VII V IV II in Blood in Plasma without Blood Sampling withoutwithout Trisodium Citrate Fb

19、g Reagent Fibrin Measure Clotting Time Thrombin Normal Range 200-400 mg/dL Calculated for Fibrinogen concentration 37 I 44 DOD DOD1 DOD2 DOD3 250mg/dl 125mg/dl 62mg/dl DOD3 DOD2 DOD1 062125250 Mg/dlFIB 時間 DOD FIB FIB FIB DOD x FIB PT演算法的原理演算法的原理 PT測定完后纖蛋白原會轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，其形成的濁度與纖維測定完后纖蛋白原會轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，其形成的濁度與纖維

20、 蛋白質(zhì)的含量成正比，因此不需要任何試劑，即可由產(chǎn)生的濁度蛋白質(zhì)的含量成正比，因此不需要任何試劑，即可由產(chǎn)生的濁度 直接推算出纖維蛋白原的含量。直接推算出纖維蛋白原的含量。 45 檢測原理（免疫學方法）檢測原理（免疫學方法） 利用抗FIB多克隆抗體與FIB特異性結(jié)合反應(yīng)進行 測定； 方法有免疫濁度、單向免疫擴散和ELISA等。 46 臨臨 床床 應(yīng)應(yīng) 用用 1 增高 （1）動脈粥樣硬化 （2）糖尿病 （3）急性傳染病，急性感染 （4）結(jié)締組織病 （5）急性腎炎和尿毒癥 （6）妊娠晚期和妊高癥 （7）放療后，灼傷，休克，外科 大手術(shù)后，惡性 腫瘤等 47 2 減少 （1）DIC、原發(fā)型纖溶、重癥

21、肝炎，肝硬化； （2）作為蛇毒治療（抗栓酶、去纖酶）和溶栓治 療（UK、t-PA）的監(jiān)測指標。FIB在1.2 1.5g/L ，治療安全有效。 48 方法學問題方法學問題 49 編號 1.89 2.14 2.09 2.26 3.78 3.87 2.74 2.85 0.42 0.78 0.97 1.49 1.01 1.46 4.26 5.98 4.66 7.78 5.00 12.13 50 七、七、D-Dimer測定測定 51 D D D D D D D D D D D D D D D D Visible agglutination D D D D E E D D D E D E no agglu

22、tination D-Dimer D,E fragments D D D-Dimer Latex Antibody DE D, E 碎片碎片 D-Dimer乳膠凝集方法乳膠凝集方法 52 D-Dimer臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 1.D-Dimer增高提示機體內(nèi)存在血栓形成和繼發(fā) 性纖溶亢； 2.D-Dimer在血栓形成（高凝狀態(tài)）、肝臟疾病 和惡性腫瘤等疾病的鑒別診斷和治療檢測等方 面具有較好的應(yīng)用效果； 3.由于D-Dimer具有高度的敏感性和良好的陰性 預(yù)期，對于排除肺栓塞和靜脈血栓有較大的價 值； 4.手術(shù)后患者D-Dimer可顯著增高，發(fā)生靜脈血 栓和肺栓塞的風險較大，檢測D-Dimer的水平

23、 變化可預(yù)測患者的血栓風險。 53 FDP臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 1. 原發(fā)性纖溶亢進時，F(xiàn)DP含量可明顯升 高。 2. 高凝狀態(tài)、彌散性血管內(nèi)凝血、肝栓塞、 器官移植的排異反應(yīng)、妊娠高血壓綜合征、 惡性腫瘤、心、肝、腎疾病及靜脈血栓、 溶栓治療等所致的繼發(fā)性纖溶亢進時， FDP含量升高。 54 臨臨 床床 指指 標標 D-Dimer 是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降 解產(chǎn)物，是血栓形成的特異性指標； D-Dimer 是繼發(fā)性纖溶的特異性指標； 纖維蛋白原和纖維蛋白的降解產(chǎn)物統(tǒng)稱 為 FDPs。 55 D-Dimer與與FDP比較比較 D-Dimer 增高，說明血栓（纖維蛋白）形 成并被降解，可診斷 DIC

24、 ，篩查靜脈血栓， 是特異性指標； FDP 增高，說明纖維蛋白原，及（或）纖 維蛋白被降解，是非特異性指標。 56 八、抗凝血酶八、抗凝血酶-測定（測定（AT- ） 57抗抗 凝凝 機機 制制 58 檢測原理檢測原理-發(fā)色底物法發(fā)色底物法 應(yīng)用肝素使標本中抗凝血酶III轉(zhuǎn)換成抑制劑， 使凝血酶失活。殘余凝血酶采用動力學方法測 量405nm吸光度的變化，公式如下： 殘余 肝素 過量標本 凝血酶凝血酶凝血酶III-ATATIII IPAANBAOHArgoGlyTosIPAANBAArgoGlyTosPrPr 殘余凝血酶 病人標本中吸光度線性降低與抗凝血酶病人標本中吸光度線性降低與抗凝血酶III出

25、現(xiàn)呈線性關(guān)系。出現(xiàn)呈線性關(guān)系。 59 臨臨 床床 應(yīng)應(yīng) 用用 AT是組成抗凝血的主要成分，是維持凝血平衡的重要物質(zhì)。先天性是組成抗凝血的主要成分，是維持凝血平衡的重要物質(zhì)。先天性 或后天性或后天性AT缺乏可導(dǎo)致高凝血癥，臨床上表現(xiàn)為血栓形成。缺乏可導(dǎo)致高凝血癥，臨床上表現(xiàn)為血栓形成。 1.遺傳性AT缺乏常染色體顯性遺傳常染色體顯性遺傳 2.獲得性AT缺乏 AT合成降低主要見于肝硬化、重癥肝炎、肝癌晚期等，常與疾病主要見于肝硬化、重癥肝炎、肝癌晚期等，常與疾病 嚴重度相關(guān)，可伴發(fā)血栓形成；嚴重度相關(guān)，可伴發(fā)血栓形成； AT丟失增加見于腎病綜合癥；見于腎病綜合癥； AT消耗增加見于血栓前期和血栓性疾病，如心絞痛、心肌梗死、見于血栓前期和血栓性疾病，如心絞痛、心肌梗死、 腦血管疾病、腦血管疾病、DIC、外科手術(shù)后、口服避孕藥、深部靜脈血栓形成、肺、外科手術(shù)后、口服避孕藥、深部靜脈血栓形成、肺 梗死、妊高癥等。梗死、妊高癥等。 3.AT水平增高血友病血友病A、血友病、血友病B、口服抗凝藥物以及使用黃體酮類、口服抗凝藥物以