醫(yī)學(xué)高級職稱論課件

1、醫(yī)學(xué)高級職稱論1 5-Aza-CdR對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為 及TFPI-2 mRNA表達(dá)的影響 醫(yī)學(xué)高級職稱論2 5-Aza-CdR對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2 mRNA表達(dá)的表達(dá)的 影響影響 作者：杜雅冰，邵應(yīng)舉，樊青霞，孫楨，王琳，趙培榮 作者單位： (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450002) 【摘要】目的探討5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza- CdR)干預(yù)對食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706生長增殖及其組織因子途徑抑制物 2(tissue factor pathway inhibitor-2，

2、TFPI-2)基因表達(dá)的影響。方法選取 食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706，并用不同濃度的5-Aza-CdR處理該細(xì)胞株。 MTT法檢測干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化，F(xiàn)CM法檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡 率的變化，RT-PCR技術(shù)檢測干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2基因mRNA的 表達(dá)，免疫組化檢測干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-Aza-CdR處 理后，超甲基化狀態(tài)解除，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯提高 (P0.05);細(xì)胞中TFPI-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)mRNA的表達(dá)水平也較 處理前明顯提高(P0.05)

3、。結(jié)論食管癌細(xì)胞系TFPI-2基因超甲基化可抑 制其mRNA表達(dá)，當(dāng)其超甲基化解除后，細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋 亡率相應(yīng)提高。 醫(yī)學(xué)高級職稱論3 【關(guān)鍵詞】 食管癌;組織因子途徑抑制物-2;5-氮雜-2-脫氧胞苷;甲基化;免疫 組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);凋亡 ABSTRACT： ObjectiveTo explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR) intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression

4、of tissue factor pathway inhibitor-2 (TFPI-2). Methods Eca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations; MTT， flow cytometry， immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth， apoptosis， and the expression of TFPI-2 gene and its protein. ResultsEca9706 cell

5、 line had hypermethylation of TFPI-2. After demethylation by 5-Aza-CdR treatment， the proliferation of Eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner. RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered

6、significantly (P0.05). Conclusion 5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation. KEY WORDS： esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5-Aza-CdR; methylation; immunohistochemi

7、stry; RT-PCR; apoptosis 醫(yī)學(xué)高級職稱論4 組織因子途徑移植物2(tissue factor pathway inhibitor， TFPI-2)是絲氨酸蛋 白酶抑制物，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。目前，關(guān)于TFPI-2 在食管癌中的基因表達(dá)情況的分析研究尚少。本研究旨在探討TFPI-2基因的失 活機(jī)制，并尋找食管癌治療的新靶點(diǎn)。 1材料與方法 1.1材料 RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自天 津市灝洋生物制品科技有限公司;Trizol試劑購自MBI公司;RT-PCR試劑盒購自 MBI公司;5-Aza-CdR購自Sigma

8、公司;人食管癌細(xì)胞株Eca9706由鄭州大學(xué)腫瘤 生物學(xué)研究室惠贈(zèng)。 1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 人食管癌細(xì)胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每23 d消化傳代1次。 1.3MTT法檢測干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度至5104/mL接種于96孔板，按5-Aza-CdR濃 度分為6組：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每組復(fù)設(shè)5個(gè)孔。待細(xì) 胞貼壁后，分別于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后棄去上清液，每孔加 DMSO 150 L，在490 nm波長測定各孔吸光

9、度值(absorbance，A)。細(xì)胞增 殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate， CPIR)按公式計(jì)算：CPIR=(1- 實(shí)驗(yàn)組A均值/對照組A均值)100%。 醫(yī)學(xué)高級職稱論5 1.4流式細(xì)胞儀(FCM)檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5105/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后加 藥，分組如下：對照組(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR組，25.6 mol/L 5- Aza-CdR組，102.4 mol/L 5-Aza-CdR組。每組均于5-Aza-CdR作用48 h后消 化收集細(xì)胞，700 mL

10、/L冰乙醇固定，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測定。 1.5RT-PCR技術(shù)檢測TFPI-2基因mRNA的表達(dá) 分組同F(xiàn)CM，每組細(xì)胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分別 為5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3， 合成產(chǎn)物為440 bp;-actin作為內(nèi)參照，上下游引物分別為5- AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合 成產(chǎn)物為301 bp。按照試劑盒說明書，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外 分光光度計(jì)分析后，按Sigma公司RevertAi

11、d First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作。先逆轉(zhuǎn)錄制備單鏈cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用上、下游 產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件為：94 預(yù)變性3 min，然后94 變性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 延伸5 min,4 保溫。擴(kuò)增片段經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 醫(yī)學(xué)高級職稱論6 1.6免疫組化方法檢測TFPI-2蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5104/mL的密度接種于經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片上，待 細(xì)胞貼壁后加藥(分組同RT-PCR)。培養(yǎng)48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定 30 min,3

12、0 mL/L H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下10 min,100 mL/L動(dòng)物 血清封閉，室溫下10 min，滴加1 100的稀釋的TFPI-2抗體4 過夜，二抗 室溫下1 h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 孵育30 min，DAB顯色，蘇 木精復(fù)染，脫水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作為陰性對照。 結(jié)果判定：TFPI-2蛋白陽性信號均呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。光 鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè))，按陽性細(xì)胞所 占百分比進(jìn)行結(jié)果判定。陽性率=(陽性細(xì)胞數(shù)/1 000)100%。 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)

13、據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x-s) 表示，采用單因素方差分析加LSD兩兩比較法進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。 2結(jié)果 2.1干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化 經(jīng)MTT檢測，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率明顯高于未加藥組，且隨著作 用時(shí)間的延長和濃度的增加而增加(表1)。表1不同濃度的5-aza-CdR對 Eca9706細(xì)胞增殖的影響 醫(yī)學(xué)高級職稱論7 2.2干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化 流式細(xì)胞儀分析可見，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR誘導(dǎo)48 h后，Eca9706細(xì)胞 各處理組凋亡率分別為(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%， 與5-Aza-CdR誘導(dǎo)濃度成正比。與對照組(1.

14、390.27)%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(P0.05)，且各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，圖1)。以 上實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。 2.3干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞mRNA的表達(dá)情況 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，Eca9706細(xì)胞中TFPI-2 mRNA表達(dá)在 各用藥組和未用藥組之間有明顯差異，TFPI-2 mRNA在未用藥組細(xì)胞中未 見表達(dá)。經(jīng)1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR處理后可見TFPI-2 mRNA 表達(dá)，表明在一定范圍內(nèi)隨5-Aza-CdR藥物濃度的增加TFPI-2 mRNA表達(dá) 逐漸增強(qiáng)(圖2)。圖1各組流式細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖A：對照組;B：1.6 mo

15、l/L 5- Aza-CdR組;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR組;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR組。 圖25-Aza-CdR處理前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2 mRNA的表達(dá)M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：對照組;2：102.4mol/L組;3： 25.6 mol/L組;4：1.6 mol/L組;5：H2O對照組。,2.4干預(yù)前后TFPI-2蛋 白的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)5-Aza-CdR作用Eca9706細(xì)胞48 h， 醫(yī)學(xué)高級職稱論8 TFPI-2蛋白的陽性表達(dá)率增加，對照組、1.6 mol/L組

16、、25.6 mol/L組、 102.4 mol/L組TFPI-2蛋白的陽性表達(dá)率分別為(2.101.42)%、 (9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同濃度組之間以 及用藥組與對照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，圖3)。圖3各 組TFPI-2蛋白的表達(dá)情況 3討論 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22區(qū)域，全長由8164個(gè)堿基組成，其 cDNA全長為1 222 kb。其mRNA的啟動(dòng)子具有典型的管家基因特征，沒 有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域GC含量超過 80%1。TFPI-2可在體內(nèi)多種組織廣泛表達(dá)，在這

17、些組織內(nèi)一旦出現(xiàn)腫瘤， TFPI-2的表達(dá)水平也會(huì)隨之顯著下降2。有研究證實(shí)，在絨毛膜癌、乳腺 癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和胸部惡性腫瘤組織中，與腫 瘤產(chǎn)生相關(guān)的TFPI-2表達(dá)水平減少可能與其啟動(dòng)子的甲基化密切相關(guān)1,3- 5。啟動(dòng)子區(qū)cpG島高甲基化在腫瘤形成機(jī)制中的確切作用尚不清楚，然 而眾多證據(jù)表明，腫瘤抑癌基因CpG島異常的甲基化導(dǎo)致基因失活和轉(zhuǎn)錄 抑制是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一6-8。 醫(yī)學(xué)高級職稱論9 目前，有體外實(shí)驗(yàn)表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR通過去甲 基化作用可使多種含有CpG島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù) 抑癌功能9。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)

18、果顯示，TFPI-2在Eca9706細(xì)胞中無表 達(dá)，經(jīng)過不同濃度的5-Aza-CdR處理Eca9706細(xì)胞后，TFPI-2亦重新出 現(xiàn)表達(dá)，且在一定范圍內(nèi)隨藥物誘導(dǎo)濃度的增大表達(dá)逐漸增強(qiáng)。 MIZUNO等10研究表明，腫瘤細(xì)胞中DNMT的表達(dá)較正常的高412倍， 也證實(shí)DNMT上調(diào)參與腫瘤發(fā)生。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)可知，經(jīng)過5-Aza-CdR干預(yù)處理過的Eca9706細(xì)胞增殖明顯受抑制， 且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，DNA啟 動(dòng)子區(qū)去甲基化能較明顯地抑制食管癌細(xì)胞增殖，并與其誘導(dǎo)劑量呈正 相關(guān)，推測這種抑制作用與去甲基化后重新激活TFPI-2基因

19、的轉(zhuǎn)錄和表 達(dá)有著直接關(guān)系;此外可能與去甲基化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。進(jìn)而通過流 式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR干預(yù)的Eca9706的細(xì) 胞中，用藥組與對照組相比細(xì)胞凋亡率凋亡率有所增加，并且與5-Aza- CdR誘導(dǎo)劑量有依賴性關(guān)系。BENDER等11在同等條件下用5-Aza- CdR處理惡性腫瘤細(xì)胞系和正常纖維細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖均被 抑制，而纖維細(xì)胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR對Eca9706細(xì)胞增 殖的抑制及凋亡的增加不是藥物的毒性影響，可能是因?yàn)槭筎FPI-2重新 表達(dá)的結(jié)果。 醫(yī)學(xué)高級職稱論10 目前，國外以TFPI-2為藥物研究靶點(diǎn)，就TFPI-

20、2在腫瘤治療、腫瘤臨床診斷、 促進(jìn)傷口愈合和動(dòng)脈粥樣硬化治療等領(lǐng)域中的應(yīng)用，也正在進(jìn)行廣泛深入的研 究。本研究用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理人食管癌Eca9706細(xì)胞株，檢 測TFPI-2基因表達(dá)的變化及其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期尋找治療腫瘤的 新靶點(diǎn)。 【參考文獻(xiàn)】 1HUBE F， REBERDIAU P， IOCHMANN S， et al. Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line J. Thromb Res，

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