血細(xì)胞分離技術(shù)

1、真誠(chéng)為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。第十八章 血細(xì)胞分離技術(shù)（Separation technique of the blood cell）一、原理在體外進(jìn)行細(xì)胞免疫檢測(cè)時(shí)，首先必須進(jìn)行淋巴細(xì)胞的分離。分離淋巴細(xì)胞的方法很多，但不管采用哪種方法，均要求分離的淋巴細(xì)胞純度高、產(chǎn)量多，而且不喪失活性，同時(shí)也要求分離技術(shù)簡(jiǎn)單、操作方便。外周血液中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的比例在幾百甚至上千比一，兩類細(xì)胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。紅細(xì)胞的自然沉降率較快，加入高分子量的聚合物，如明膠、右旋糖酐等還可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度離心法或二者結(jié)合，可以將淋巴細(xì)胞從血液中分離出來。這種

2、分離出的淋巴細(xì)胞一般包括單核細(xì)胞。除去單核細(xì)胞，可以利用單核細(xì)胞的吸附功能，如鐵顆粒、玻璃面或尼龍網(wǎng)等，除去（或分離）單核細(xì)胞，從而提純淋巴細(xì)胞。二、采血（一）材料與試劑1抗凝劑（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其鈉鹽或鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進(jìn)而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，從而阻止血液凝固。常用的肝素溶液濃度為1 000U/ml，市售肝素多為100U126Umg。（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一種螯合劑。用生理鹽水配制成4的溶液備用。（3）阿氏液（Alsever液），配方如下： 枸櫞酸鈉（Na3C6H5O75H2O） 0.80g 枸櫞酸 0.0325g 葡萄糖 2.05

3、g 氯化鈉 0.42g H2O 加至 100.00ml混勻溶解后，114.3高壓蒸汽滅菌10min備用。阿氏液中既含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細(xì)胞生存的營(yíng)養(yǎng)，所以它既可做抗凝劑，又可做血細(xì)胞的保存液。2針頭 根據(jù)不同動(dòng)物和采血部位，采用不同型號(hào)的針頭，用前必須滅菌或消毒。3采血容器 注射器或三角瓶等。4采血?jiǎng)游?。（二）操作方?采血法 各種動(dòng)物采血方法不一。馬、牛、羊等大動(dòng)物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。2抗凝 采集血液最關(guān)鍵的問題是抗凝，采

4、用什么方法進(jìn)行抗凝，則根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求和條件而定。最常用的方法如下：（1）肝素抗凝：采血時(shí)，使每ml血液含15U20U肝素即可。計(jì)算采集的血液量，按1 000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血時(shí)，邊采血邊輕輕搖動(dòng)，使抗凝劑和血液混勻。對(duì)于采少量的血液或小動(dòng)物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。（2）EDTA抗凝：采血前，用滅菌生理鹽水將EDTA配制成4溶液，然后按預(yù)采血液的量，以每ml血液加入1mg2mg的EDTA的液體量于采血容器內(nèi)。采血，并不斷搖動(dòng)采血容器，使之混勻。（3）玻璃珠法：預(yù)先將適量的玻璃珠（根據(jù)采血量多少而定）清洗后，裝入采血容器中，滅菌后備用。采

5、血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動(dòng)，以機(jī)械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但對(duì)淋巴細(xì)胞的活性影響最小，且可減少血小板的混雜。（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以11比例采集血液，邊采邊輕輕搖動(dòng)采血瓶，使之混勻。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于紅細(xì)胞的保存。一般在4條件下，阿氏液中保存的紅細(xì)胞2周其活性和特性不變。三、紅細(xì)胞的分離技術(shù)（一）材料與試劑1肝素等抗凝劑23明膠液 取明膠3g，溶于0.9滅菌鹽水100ml中，114.3滅菌10min，冷卻后4冰箱保存。臨用時(shí)，37預(yù)熱10min。3阿氏液（二）操作方法1采血抗凝，即為紅細(xì)胞。由于紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比例相差懸殊

6、，一般白細(xì)胞混雜在其中，忽略不計(jì)。2根據(jù)紅細(xì)胞的用途，可做進(jìn)一步的處理。如計(jì)算紅細(xì)胞，可直接稀釋計(jì)數(shù)。如需做補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)，或其它溶紅細(xì)胞反應(yīng)，則需將紅細(xì)胞進(jìn)行充分的清洗，以除去附著在紅細(xì)胞膜表面的血漿。一般用等滲的稀釋液連續(xù)清洗，2 000r/min離心10min，重復(fù)34次。3如需儲(chǔ)藏備用，則以阿氏液做抗凝劑采血，混勻后置4冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。四、淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)（一）材料與試劑 1淋巴細(xì)胞分層液有兩種： （1）聚蔗糖泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成401（W/V）水溶液，也有干粉出售。應(yīng)用時(shí)，

7、用蒸餾水配制9溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3，5二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1去氧甲氨基山梨醇。含量為60或75，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應(yīng)用時(shí)，取60泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml，即為33.9泛影葡胺。1.0770.001聚蔗糖泛影葡胺的配制：9聚蔗糖液 24份33.9泛影葡胺液 10份混合即可。必要時(shí)，可測(cè)比重。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或114.3高壓滅菌15min，4保存。一般可保存3個(gè)月。如要配制不同比例的分層液，可按下列公式計(jì)算：式中dm為分層液的比重，d1和d2分別為9

8、聚蔗糖和33.9泛影葡胺的比重，V1和V2分別為它們的體積。如需配制1.077比重的聚蔗糖泛影葡胺的分層液，則9的聚蔗糖和33.9的泛影葡胺的比例應(yīng)為10046.3。（2）泛影葡胺右旋糖酐（dextran）液 34泛影葡胺液 10份 60右旋糖酐液 12.5份混合，即為比重1.071.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4冰箱保存?zhèn)溆谩? 3的明膠液 稱取明膠3g，溶于0.9的滅菌生理鹽水，終體積100ml，114.3高壓滅菌10min，冷卻后4冰箱保存，臨用時(shí)37預(yù)熱10min。3Hanks液。（二）操作方法1取抗凝血，自然沉降，如是馬屬動(dòng)物的血液，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h，取上層血漿

9、。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3明膠液，混勻后讓其自然沉降，1h后取上層血漿。22 000r/min離心10min，棄上清。3沉淀用Hanks液混懸后，再2 000r/min離心10min。4重復(fù)步驟3一次，再用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液將白細(xì)胞制成懸液。此液含有整個(gè)白細(xì)胞群，包括粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞?？晒┌准?xì)胞計(jì)數(shù)用。5取2ml細(xì)胞分層液于離心管內(nèi)，同時(shí)用毛細(xì)吸管吸取約2ml的血漿（自然沉降1h的上層血漿）輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可。6以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，最下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在血漿層與

10、分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層。7用毛細(xì)吸管插入到單個(gè)核細(xì)胞層并吸取該層，放入另一試管中。8以Hanks液洗滌、離心，最后配制成適當(dāng)?shù)陌准?xì)胞濃度。必要時(shí)可計(jì)數(shù)。（三）注意事項(xiàng)1血漿或血液加入分層液中時(shí)要小心，緩慢不要打亂液層、不要搖動(dòng)。也可以將分層液加入到血漿的上層。2保持淋巴細(xì)胞的活性是非常重要的，所以一般情況下，是現(xiàn)采血，馬上進(jìn)行分離。3經(jīng)過分層液分離的淋巴細(xì)胞層，實(shí)際上是單個(gè)核細(xì)胞層，包括單核細(xì)胞，不包括粒細(xì)胞。欲分離出純的淋巴細(xì)胞，則按下法除去單核細(xì)胞，或收獲單核細(xì)胞。五、單核細(xì)胞分離技術(shù)（一）鐵粉吸附法1材料及試劑（1）鐵粉或羰基鐵粉（Atomergic chem

11、etals）99的純度，顆粒小于60m（Goodfellow Metals）。（2）強(qiáng)磁鐵（馬蹄形）。（3）一塊小棒狀磁鐵（約1cm長(zhǎng)）。（4）毛細(xì)吸管等。2操作方法（1）稱取一定量的鐵粉，一般為10g，用100ml生理鹽水洗滌4次，去除任何可溶性有毒物質(zhì)。在倒去鹽水時(shí)，用強(qiáng)磁鐵吸住鐵粉。（2）用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后，分裝于10個(gè)瓶中，包扎瓶口，121滅菌20min，拿出后立即輕輕搖勻，防止鐵粉結(jié)塊，儲(chǔ)藏備用。（3）臨用前，倒去瓶中的生理鹽水，加入適量的單個(gè)核細(xì)胞懸液（3ml5ml，細(xì)胞總數(shù)為8107個(gè)瓶）。37溫育45min，中間不時(shí)晃動(dòng)，使鐵粉懸浮起來。（4）加入一塊小磁鐵棒于

12、瓶中，讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細(xì)胞。（5）倒出懸液，此懸液主要是淋巴細(xì)胞，離心，收集。（6）在鐵粉瓶?jī)?nèi)倒入一定量的Hanks液，用力振搖后，以強(qiáng)磁鐵吸附，幾分鐘后，倒出液體。（7）2 000r/min離心液體，管底即為單核細(xì)胞。（二）玻璃板吸附法將分離的單個(gè)核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37 30 min40min，用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細(xì)胞。用適量的Hanks液沖洗平皿，收獲即為單核細(xì)胞懸液。六、T淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)（一）原理 混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群

13、的有效方法。（二）材料及試劑1尼龍毛（Femwall Laboratories,LP1 Leukoqak leukocyte Filters）。2燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。3裝填尼龍毛柱，一次性注射器。4取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖泛影葡胺分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個(gè)核細(xì)胞層。（三）操作方法1尼龍毛的清洗與干燥（1）戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套，將尼龍毛（1包或2包，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi)，使水滴干。（3）重復(fù)（1）、（2）步驟6次。（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi)，37溫箱干燥23天后

14、，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。2裝尼龍毛柱（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。（2）將尼龍毛梳理，并適當(dāng)折疊，以適應(yīng)注射器的直徑，填入注射器內(nèi)，約20ml的體積。（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。3細(xì)胞分離（1）將注射器固定在支架上，倒入37的細(xì)胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門一定時(shí)間，然后打開閥門，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門。（2）將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛龋s5.00107個(gè)細(xì)胞ml。（3）將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37溫育45min至1h。（4）打開下口，緩慢放流（1滴min），收集于離心管中。（5）離