Westernblot實驗步驟及注意事項

1、Westernblot實驗步驟及注意事項Westernblot實驗步驟1. 組織塊稱重2. 利用液氮、研休粉碎組織塊3. 加入RIPA緩沖液（每克組織3mlRIPA）. PMSF （每克組織30 u h 10mg/mlPMSF）,利用Polytron進 一步勻漿（15.000轉(zhuǎn)/分J分鐘）維持4C4. 加入PMSF （每克組織30 ul, lOmg/mlPMSF）,冰上孵育30分鐘5. 移入離心管4C約20,000 g （約15.000轉(zhuǎn)）15分鐘&上清液為細胞裂解液可分裝2（TC保存7. 進行Bradford比色法測定貴白質(zhì)濃度8. 取相同質(zhì)雖的細胞裂解液（體積綽茨白質(zhì)濃度人并加等體枳的2X

2、電泳加樣緩沖液9. 沸水浴中3分鐘10. 上樣11. 電泳（濃縮膠20mA.分離膠35mA）12電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA40分鐘）13膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色14. Westernblot試劑盒顯色15. 分析比較記錄western blot的實驗步驟及注總:爭項的資料1把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜.將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上用5ml移液管在凝膠上來回滾動去 除所有的氣泡。2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕）將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡 薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝宜中.凝膠而向陰極。/凝膠/

3、）將此濾紙34）將上述裝宜放入緩沖液槽中.并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。6）轉(zhuǎn)移結束后.収出薄膜和凝膠棄去凝膠。2.3. 用100ml水洗滌纖維素膜.必要時可用脫色緩沖液。4. 膜置印跡緩沖液中于37C保溫1小時。5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。&用対口機將薄膜対入塑料袋中.盡可能不留空氣。7. 袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。8. 混合：NGS（100微升）.卬跡緩沖液中的抗休（10亳升人加在裝薄膜的袋中.于室溫下?lián)u動2小時（或 4C過夜）9用總體積300inl PBS-Tween緩沖液分4次在一淺盤中洗滌薄膜.每次75ml：10

4、.將連接生物素的羊抗兔IgG （40微升溶于10狂升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u 動1小時。11按步驟9洗滌。12加入抗生素貳白HRP （40微升溶于10亳升印跡緩沖液/100微升NGS）.于室溫下?lián)u動。注總:爭項：western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的貴白處于變性狀態(tài).空間結構改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于 western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物素化.再用的標 記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶于釦Western實驗步驟Western.也稱Western blot. Western b

5、lottings Western印跡，是用抗休檢測蛋白的重要方法之一。Western 可以參考如下步腺進行操作1.收集蛋白樣品（Protein san甲 le preparation）0可以使用適十的裂解液.例如碧云天生產(chǎn)的Western及IP細胞裂解液，裂解貼壁細胞.懸浮細胞或組織 樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白.例如細胞核蛋白、紐I胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋 白，也可以使用試劑盒進行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒0收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣址一致.需要測定每個貴白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使 用的裂解液的不同.需要采

6、用適十的茨白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容 性差別 很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒。2電泳(Electrophoresis)SDS-PAGE凝膠配制0 SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制幹種濃度SDS-PAGE的配方。(2)樣品處理0在收集的蛋白樣品中加入適址濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上 樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣

7、緩沖液可以減小上樣體積，在相同休積的上樣孔內(nèi)可以上樣更女的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋 白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制.也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。 0 100C或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。(3)上樣與電泳0冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。0為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷貴白分子址大小.最好使用預染貳白質(zhì)分子量標準0電泳時通常推薦在上層膠時使用低電斥恒斥電泳，而在渙酚藍進入下層膠時使用島電斥恒斥電泳。對于 Bio-Rad的標準電泳裝宜或類似電泳裝宜，低電斥可以設習在80-100V,商電壓可以設

8、宜在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的 電泳儀就可以滿足要求.也可以采用碧云天的女功能電泳儀(帶定時)。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒圧的 方式，通常把電斥設迓在100V,然后設定定時時間為90-120分鐘。設宜定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。0通常電泳時瀆酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預染蛋白質(zhì)分子雖標準的電泳情況, 預計目的蛋白已經(jīng)被適肖分離后即可停止電泳。3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)也可以使用，但硝酸纖維素)(NC膜我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜O膜比較脆，在操作過程中特別是用鍛子 夾取等過程中容易裂開。膜

9、的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步 驟。轉(zhuǎn)膜時間為300400mABioRad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝宜.可以設定轉(zhuǎn)膜電流為0通常如果使用轉(zhuǎn)膜過 3060分鐘。也可以在1520mA。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小帶定時)夜。轉(zhuǎn)膜時也可以使用碧 云天的多功能電泳儀(而定.目的貴白的分子址越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長.目的蛋白的分子雖越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。0轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質(zhì)分子雖標準.通常分子雖最大的12條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。 轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進行染色以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE 膠進行染色.以觀察蛋白的殘留情況。4.

10、 封閉(Blocking)0轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放宜到預先準備好的Ubsiem洗滌液中，鴻洗12分鐘.以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜 液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注總膜的保濕，避免膜的T悚.否則極易產(chǎn)生較商的背景。0用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘。對于一些 背景較高的抗體，可以在4C封閉過夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天生產(chǎn)的側(cè)擺搖床.側(cè)向擺動速度比校緩慢，而 且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。5. 一抗孵育(Pnmary antibody incubation)O參考一抗的說明書，按照適十比例用Western抗稀釋液稀釋一抗。O用

11、微型臺式真空泵吸盡封閉液立即加入稀釋好的一抗，室溫或4C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時 如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在VC緩慢搖動孵育過夜。O回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后.再加入洗滌液. 洗滌510分鐘。共洗滌次。如果結果背景較商可以適、“I延長洗滌時間并増加洗滌次數(shù)。3.6. 二抗孵育(Secondary antibody mucubation)0參考二抗的說明書，按照適為比例用Western二抗稀釋液稀禪辣根過氧化物酹(HRP)標記的二抗。0用微型臺式真空泵吸盡洗滌液立即加入稀釋好的二抗，室溫或49在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時0回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘c吸盡洗滌液后，再加入洗滌液, 洗滌510分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較商可以適十延長洗滌時間并増加洗滌次數(shù)。7. 蛋白檢測(Detection of prot