微流控細(xì)胞學(xué)應(yīng)用

1、 1 匯報人： 李軍 時 間： 2016.11.01 微流控芯片上基于免疫磁珠細(xì)胞 分選及基于水凝膠微陣列藥物作 用分析 目 錄 一、研究背景 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 三、基于水凝膠微陣列藥物作用分析 四、結(jié)果與討論 常規(guī)的細(xì)胞研究方法存在以下幾個難點(diǎn)： 細(xì)胞的尺寸微小,難于操縱 細(xì)胞內(nèi)成份復(fù)雜且含量微小,并包含有大量的生物學(xué)信 息,需要高通量的分析和高靈敏度的檢測手段 傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法無法提供復(fù)雜、微尺度的生長環(huán) 境。 一、研究背景 微流控芯片細(xì)胞學(xué)研究優(yōu)點(diǎn)： 通道尺寸（10100微米）與單個細(xì)胞直徑（1020微米） 相近，便與操控 多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更接近生理狀態(tài)下細(xì)胞的生存環(huán)境 可滿足高通

2、量細(xì)胞分析需要，可同時獲取大量生物學(xué)信息 多操作單元靈活組合，進(jìn)樣，培養(yǎng)，捕獲，裂解，分離檢 測集成于一塊兒芯片上 平板幾何構(gòu)型，方便觀察 傳熱傳質(zhì)快 一、研究背景 一、研究背景 HIV進(jìn)入人體后會特異性的攻擊破壞陽性淋巴細(xì)胞并 進(jìn)行大量復(fù)制和繁殖,引起淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少,導(dǎo)致人 體免疫功能不斷下降并潛伏幾年之后因各種機(jī)會性感 染而發(fā)病。 因此,臨床上將曠淋巴細(xì)胞的數(shù)量作為監(jiān)測疾病進(jìn)展 以及評估臨床治療療效的重要指標(biāo),當(dāng)每微升體液中淋 巴細(xì)胞絕對數(shù)量小于200個時被認(rèn)為患有艾滋病。 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 磁活性激活細(xì)胞分選磁活性激活細(xì)胞分選利用抗原抗體的免疫反應(yīng)捕獲 全血中的淋巴細(xì)胞,包被

3、有抗體的磁珠具有高的比表 面積,并且能在外加磁場或電場的作用下對磁珠進(jìn)行 操縱。在微流控芯片上,利用磁性微珠進(jìn)行細(xì)胞分選 法與在微通道表面修飾抗體進(jìn)行細(xì)胞分選的方法相 比,細(xì)胞捕獲效率有了很大的提高 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 以PDMS為材料的聚合物微流控芯片與其它硬性材料的操作系統(tǒng)相比: 更易于集成化,具有良好的生物相容性, 對氣體有一定的通透性,有利于細(xì)胞培養(yǎng)過程中氣體交換 能方便制作多層微流控系統(tǒng) 但是微流控芯片也有一些不容忽視的缺點(diǎn),如: 形成的微結(jié)構(gòu)不如硬性材料穩(wěn)定 對一些非極性小分子具有吸附作用,同時還具有較強(qiáng)的疏水作用 二、基于

4、免疫磁珠細(xì)胞分選 細(xì)胞樣品的制備細(xì)胞樣品的制備實驗中所使用的淋巴細(xì)胞懸液從小鼠的 胸腺組織中提取。 無菌的條件下從小鼠中分離出胸腺組織, 清洗, 置于無 菌玻璃器皿中,用手術(shù)剪刀將其剪成小碎片,過濾得到細(xì)胞 懸液, 離心以除去死細(xì)胞和細(xì)胞殘骸,然后重懸于pH為7.4 的PBS中。 用血球計數(shù)板對細(xì)胞懸液的濃度進(jìn)行計數(shù), 細(xì)胞的存活 率用的臺盼藍(lán)進(jìn)行測試。為了保持細(xì)胞的良好活力,從小 鼠胸腺中提取出來的細(xì)胞懸液在24小時之內(nèi)使用 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 二、基于免疫磁珠細(xì)胞分選 反應(yīng)室中液體的流速減小,可以增加包被在磁珠表面上的 抗體與細(xì)胞表面抗原之間的免疫反應(yīng)時間,從而提高細(xì)胞 捕獲效率。

5、通過設(shè)計截面積較大的反應(yīng)室,并利用分散均勻的免疫磁 珠對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行捕獲能達(dá)到比較高的細(xì)胞捕獲效率。 細(xì)胞的進(jìn)樣流速比較小時,細(xì)胞可能會由于自身的重力沉 降在微通道內(nèi),而未能進(jìn)入到反應(yīng)室中與免疫磁珠結(jié)合,捕 獲效率比較低。 流速過快,細(xì)胞來不及與反應(yīng)室內(nèi)的免疫磁珠結(jié)合,從而 極大地減小了細(xì)胞的捕獲效率。 三、基于水凝膠微陣列藥物作用分析 光引發(fā)聚合水凝膠可作為細(xì)胞固定的一個非常理想的材料, 因為它具有: 較高的含水量,柔軟,并且能夠進(jìn)行物質(zhì)傳遞。 光引發(fā)聚合水凝膠的預(yù)聚物,可以將細(xì)胞固定在水凝膠微 結(jié)構(gòu)中。 細(xì)胞還可以被選擇性地固定,并且水凝膠微結(jié)構(gòu)的形狀可 以通過光掩膜上繪制的圖形來控制。

6、由于水凝膠微結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小為110nm左右,對固定在 水凝膠微結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時便于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的 輸送。 三、基于水凝膠微陣列藥物作用分析 三、基于水凝膠微陣列藥物作用分析 本研究利用人肝癌HepG2細(xì)胞和人肺上皮A549細(xì)胞為模 型進(jìn)行藥物篩選分析。由于水凝膠聚合的過程中預(yù)聚物的 組成和光照聚合的條件對細(xì)胞的活性有影響,通過實驗對這 兩個參數(shù)進(jìn)行考察優(yōu)化。然后用抗癌藥對水凝膠包裹的兩 種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥物刺激,并用兩種熒光探針2,3-萘二甲醛 ,和二氫乙錠分別對細(xì)胞內(nèi)的谷朧甘膚,和活性氧自由基舒, 進(jìn)行了定量檢測。通過與孔板上的對照實驗相比較,證實了 利用水凝膠固定細(xì)胞用于藥物篩選分析

7、,具有簡單、可靠和 高通量的分析能力。 三、基于水凝膠微陣列藥物作用分析 研究中, 我們利用熒光顯微鏡控制紫外光的方法,能非常方便的在微通道中加 工出水凝膠微結(jié)構(gòu),并且水凝膠微結(jié)構(gòu)的形貌和位置都可控。 通過對水凝膠加工過程中紫外曝光時間、聚合物單體和引發(fā)劑濃度的 控制,能使細(xì)胞的存活率保持在大約。 對包裹的細(xì)胞進(jìn)行長時間的培養(yǎng),細(xì)胞也能保持良好的生理活性。這 說明這一操控技術(shù)能夠應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)的分析。 這些操作對儀器設(shè)備的要求低,在普通的化學(xué)或生物學(xué)實驗室都能實 現(xiàn)。 通過控制水凝膠微結(jié)構(gòu)的尺寸與細(xì)胞尺寸相近,還可以在微通道中實 現(xiàn)大量單細(xì)胞的固定。 將細(xì)胞包裹在水凝膠微結(jié)構(gòu)中

8、,在一定程度上能保護(hù)細(xì)胞避免經(jīng)受大 的剪切力的損傷,同時還能對固定在預(yù)定位置的細(xì)胞進(jìn)行長時間的監(jiān)測 和分析。 u在微流控芯片上巧妙設(shè)計含有截面積擴(kuò)大反應(yīng)室的型微通道用于分離和捕 獲淋巴細(xì)胞。根據(jù)流體力學(xué)基本原理,在連續(xù)的流體中,由于截面積不同導(dǎo)致流 速有差異。在截面積較大的反應(yīng)室內(nèi)液體的流速小有利于細(xì)胞的捕獲。 u在實驗中,利用外加磁鐵將包被有抗體的磁珠捕獲在反應(yīng)室內(nèi),通過磁珠表面 的抗體與細(xì)胞表面的抗原之間的免疫反應(yīng)將目標(biāo)細(xì)胞捕獲,其捕獲效率能達(dá)到 90%左右,成本低廉,檢測快速等特點(diǎn),并且只需要普通的顯微鏡即可完成檢測, 能應(yīng)用于資源匾乏地區(qū)的艾滋病檢測。 u可以在微通道中的不同位置同時設(shè)計多個反應(yīng)室來分選不同的細(xì)胞,例如同 時分選不同的腫瘤細(xì)胞,在疾病的早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。 u將光刻技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合,使用熒光顯微鏡控制紫外光照射的區(qū)域和 位置