酶工程_03-動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶-2012

1、 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 概述 動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 無細(xì)胞壁，容易貼壁無細(xì)胞壁，容易貼壁 對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格（血清培養(yǎng)基）對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格（血清培養(yǎng)基） 對(duì)環(huán)境敏感（對(duì)環(huán)境敏感（pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力）、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力） 植物細(xì)胞植物細(xì)胞 有細(xì)胞壁，但比微生物的細(xì)胞壁脆弱有細(xì)胞壁，但比微生物的細(xì)胞壁脆弱 營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單 生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，要達(dá)到高密度較困難生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，要達(dá)到高密度較困難 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 概述 植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比

2、較植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 概述 植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較 動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞可以用相同方式培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞可以用相同方式培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng) 植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感 植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同 動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 蛋白疫苗、抗體、激素、酶（蛋白質(zhì)或多肽）蛋白疫苗、

3、抗體、激素、酶（蛋白質(zhì)或多肽） 植物細(xì)胞植物細(xì)胞 色素、香精、天然藥物（小分子）、酶色素、香精、天然藥物（小分子）、酶 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 本章主要內(nèi)容 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn)植物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn) 植物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制植物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制 EnzymeEnzyme EngineeringEngineerin

4、g 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 從基因到蛋白質(zhì)從基因到蛋白質(zhì) 有關(guān)微生物細(xì)胞中酶合成的調(diào)節(jié)理論也基本適用于動(dòng)植有關(guān)微生物細(xì)胞中酶合成的調(diào)節(jié)理論也基本適用于動(dòng)植 物細(xì)胞物細(xì)胞 動(dòng)植物細(xì)胞具有比微生物更多的調(diào)節(jié)方式動(dòng)植物細(xì)胞具有比微生物更多的調(diào)節(jié)方式 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié) 翻譯水平調(diào)節(jié)翻譯水平調(diào)節(jié) DNA RNA Protein Active Enzyme 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄 逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄 復(fù)復(fù)制制 翻翻譯譯 ？ 折折疊疊 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 細(xì)胞分化改變酶的生物合成細(xì)胞分化改變酶的生物合成 端粒（端粒（telomere

5、） 端粒是真核生物染色體的末端結(jié)構(gòu)端粒是真核生物染色體的末端結(jié)構(gòu) 由富含由富含 G、T 的的 DNA 簡(jiǎn)單重復(fù)序列不斷重復(fù)而成簡(jiǎn)單重復(fù)序列不斷重復(fù)而成 人端粒序列：人端粒序列：TTAGGG 保護(hù)真核生物染色體免遭破壞保護(hù)真核生物染色體免遭破壞 犧牲自我，填補(bǔ)犧牲自我，填補(bǔ) DNA 復(fù)制后在復(fù)制后在 5-端留下的空隙端留下的空隙 端粒隨細(xì)胞年齡的增長(zhǎng)而逐漸縮短端粒隨細(xì)胞年齡的增長(zhǎng)而逐漸縮短 端粒酶（端粒酶（telomerase） 催化端粒合成和延長(zhǎng)催化端粒合成和延長(zhǎng) 核糖核蛋白，其中的核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可構(gòu)建端粒重部分含核苷酸模板序列，可構(gòu)建端粒重 復(fù)序列復(fù)序列

6、端粒酶一般存在于分化程度較低的細(xì)胞中端粒酶一般存在于分化程度較低的細(xì)胞中 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 基因擴(kuò)增加速酶的合成基因擴(kuò)增加速酶的合成 通過增加基因的數(shù)量調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以發(fā)生在個(gè)體發(fā)育某一階通過增加基因的數(shù)量調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以發(fā)生在個(gè)體發(fā)育某一階 段或細(xì)胞分化某一過程段或細(xì)胞分化某一過程 細(xì)胞的一種應(yīng)急方式細(xì)胞的一種應(yīng)急方式 基因擴(kuò)增可以由基因擴(kuò)增可以由 引起引起 耐藥性細(xì)胞的抗藥性產(chǎn)生耐藥性細(xì)胞的抗藥性產(chǎn)生 例：例：CHO 細(xì)胞為對(duì)抗氨甲基喋呤對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制，編碼細(xì)胞為對(duì)抗氨甲基喋呤對(duì)二氫葉酸還原酶的

7、抑制，編碼 這種酶的基因急劇擴(kuò)增這種酶的基因急劇擴(kuò)增 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成 增強(qiáng)子（增強(qiáng)子（modulator） 能高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的一段能高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA 序列序列 增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄活性，可高效增強(qiáng)某些增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄活性，可高效增強(qiáng)某些 酶基因的表達(dá)酶基因的表達(dá) 具有細(xì)胞或組織特異性，在不同細(xì)胞或組織中增強(qiáng)效果不同具有細(xì)胞或組織特異性，在不同細(xì)胞或組織中增強(qiáng)效果不同 EnzymeEnzyme Engi

8、neeringEngineering 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成 抗體酶（抗體酶（abzyme）：催化性抗體，是）：催化性抗體，是 具有生物催化功能的抗體分子，是人具有生物催化功能的抗體分子，是人 工改造的對(duì)抗體可變區(qū)賦予催化特性工改造的對(duì)抗體可變區(qū)賦予催化特性 的特殊抗體的特殊抗體 修飾法修飾法 在抗體與抗原結(jié)合部位引進(jìn)催化基團(tuán)在抗體與抗原結(jié)合部位引進(jìn)催化基團(tuán) 誘導(dǎo)法（主要方法）誘導(dǎo)法（主要方法） 半抗原誘導(dǎo)半抗原誘導(dǎo) 酶蛋白誘導(dǎo)酶蛋白誘導(dǎo) EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1902

9、年，年，Haberlandt 首次提出分離植物單細(xì)胞并培養(yǎng)成首次提出分離植物單細(xì)胞并培養(yǎng)成 植株的設(shè)想植株的設(shè)想 植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶種類植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶種類 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu) EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞的主要特點(diǎn)植物細(xì)胞的主要特點(diǎn) 體積較大：比動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞都大體積較大：比動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞都大 細(xì)

10、胞生長(zhǎng)速率和代謝速率低于微生物細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)速率和代謝速率低于微生物細(xì)胞， 營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單 細(xì)胞生長(zhǎng)及合成次級(jí)代謝產(chǎn)物需要細(xì)胞生長(zhǎng)及合成次級(jí)代謝產(chǎn)物需要條件條件 主要用于產(chǎn)天然產(chǎn)物、色素、香精等有機(jī)物（次級(jí)代謝物）主要用于產(chǎn)天然產(chǎn)物、色素、香精等有機(jī)物（次級(jí)代謝物） EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì) 提高目標(biāo)物的產(chǎn)率提高目標(biāo)物的產(chǎn)率 縮短生產(chǎn)周期縮短生產(chǎn)周期 木瓜蛋白酶：木瓜生長(zhǎng)期木瓜蛋白酶：木瓜生長(zhǎng)期 8 個(gè)月，木瓜細(xì)胞培養(yǎng)約個(gè)月，木瓜細(xì)胞培養(yǎng)約 1 個(gè)月個(gè)月 易于管理

11、，不受自然因素控制易于管理，不受自然因素控制 可以提高產(chǎn)物質(zhì)量可以提高產(chǎn)物質(zhì)量 通過嚴(yán)格的培養(yǎng)條件控制，減少植株病蟲害和污染通過嚴(yán)格的培養(yǎng)條件控制，減少植株病蟲害和污染 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 培養(yǎng)條件要求高培養(yǎng)條件要求高 光照、剪切力影響顯著光照、剪切力影響顯著 植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢 相對(duì)于微生物相對(duì)于微生物 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物體外培養(yǎng)植物體外培養(yǎng) 胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng) EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

12、植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 外植體選擇和處理外植體選擇和處理 外植體（外植體（explant） 從植株取出，經(jīng)預(yù)處理后用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的植物組織片段或小從植株取出，經(jīng)預(yù)處理后用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的植物組織片段或小 塊塊 根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等 選擇：無病蟲害、生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)有規(guī)則選擇：無病蟲害、生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)有規(guī)則 切片：切片：0.51 cm 消毒消毒 70% 乙醇乙醇 5% 次氯酸鈉次氯酸鈉 / 10% 漂白粉漂白粉 0.010.1% HgCl2 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物

13、細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：直接分離法獲取植物細(xì)胞：直接分離法 直接分離法即直接從外植體中分離直接分離法即直接從外植體中分離 機(jī)械法機(jī)械法 將外植體搗碎，過濾或離心分離細(xì)胞將外植體搗碎，過濾或離心分離細(xì)胞 質(zhì)壁未分離；質(zhì)壁未分離；，完整細(xì)胞數(shù)量少，完整細(xì)胞數(shù)量少 酶解法酶解法 利用果膠酶、纖維素酶等處理外植體，分離具有代謝活性的細(xì)胞利用果膠酶、纖維素酶等處理外植體，分離具有代謝活性的細(xì)胞 能降解細(xì)胞壁，必須對(duì)細(xì)胞給予能降解細(xì)胞壁，必須對(duì)細(xì)胞給予 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：愈傷組織誘導(dǎo)法獲取植物細(xì)

14、胞：愈傷組織誘導(dǎo)法 由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的團(tuán)狀不定型的由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的團(tuán)狀不定型的的的 群體群體 本意是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的可幫助本意是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的可幫助 傷口愈合的組織傷口愈合的組織 誘導(dǎo)過程誘導(dǎo)過程 配制半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基 滅菌、植入外植體滅菌、植入外植體 13周后繼代培養(yǎng)周后繼代培養(yǎng) EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：原生質(zhì)體再生法獲取植物細(xì)胞：原生質(zhì)體再生法 一般采用酶解法分離原生質(zhì)體，使用一般采

15、用酶解法分離原生質(zhì)體，使用和和混合物混合物 保持溶液的保持溶液的 狀態(tài)狀態(tài) 防止原生質(zhì)體脹裂防止原生質(zhì)體脹裂 滲透壓穩(wěn)定劑：糖、鹽、甘露醇、山梨醇等滲透壓穩(wěn)定劑：糖、鹽、甘露醇、山梨醇等 原生質(zhì)體培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁原生質(zhì)體培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 將游離的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)按照一定的細(xì)胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基將游離的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)按照一定的細(xì)胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)的方法中進(jìn)行培養(yǎng)的方法 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般來源于愈傷組織，選擇較松散的為宜懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般來源于愈傷組

16、織，選擇較松散的為宜 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 產(chǎn)物分離純化產(chǎn)物分離純化 收集培養(yǎng)液，從中獲得所需的產(chǎn)物收集培養(yǎng)液，從中獲得所需的產(chǎn)物 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 植物細(xì)胞培養(yǎng)基植物細(xì)胞培養(yǎng)基 水：一般用去離子水或蒸餾水水：一般用去離子水或蒸餾水 無機(jī)成分無機(jī)成分 大量元素：大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co 有機(jī)成分有機(jī)成分 碳源：糖，以碳源：糖，以 最常用最常用 氮源：氨基酸（氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、無機(jī)氮）及蛋白水解物、無機(jī)氮 維

17、生素：主要是維生素：主要是 B 族維生素和維生素族維生素和維生素 C 其他：肌醇、瓊脂等其他：肌醇、瓊脂等 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基 MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 硝酸鹽濃度較高，營(yíng)養(yǎng)成分適宜，使用范圍廣硝酸鹽濃度較高，營(yíng)養(yǎng)成分適宜，使用范圍廣 B5 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 NH4+ 濃度較低，適用于雙子葉木本植物濃度較低，適用于雙子葉木本植物 White 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 無機(jī)鹽濃度低，高無機(jī)鹽濃度低，高M(jìn)g(II)、B(III)，適用于生根培養(yǎng)，適用于生根培養(yǎng) KM-8P 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 有機(jī)成分種類齊全，用于

18、原生質(zhì)體培養(yǎng)有機(jī)成分種類齊全，用于原生質(zhì)體培養(yǎng) 培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制 配制母液，使用時(shí)按需要稀釋配制母液，使用時(shí)按需要稀釋 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 工藝條件及其控制（掌握要點(diǎn)，與微生物對(duì)比）工藝條件及其控制（掌握要點(diǎn)，與微生物對(duì)比） 溫度溫度 室溫范圍（室溫范圍（25 oC左右）左右） 最適產(chǎn)酶溫度和最適生長(zhǎng)溫度不同最適產(chǎn)酶溫度和最適生長(zhǎng)溫度不同 pH 微酸性（微酸性（pH 56） 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，pH一般變化不大一般變化不大 溶解氧溶解氧 植物細(xì)胞植物細(xì)胞，供氧不宜過量，供氧不宜過量 對(duì)剪切力敏感，通風(fēng)攪拌不宜太劇烈對(duì)

19、剪切力敏感，通風(fēng)攪拌不宜太劇烈 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 工藝條件及其控制工藝條件及其控制 光照對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成具有重要影響（植物特色）光照對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成具有重要影響（植物特色） 光照有時(shí)也抑制產(chǎn)物合成光照有時(shí)也抑制產(chǎn)物合成 添加前體添加前體 前體：處于目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì)前體：處于目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì) 添加前體相對(duì)于添加了反應(yīng)的底物添加前體相對(duì)于添加了反應(yīng)的底物 刺激劑（刺激劑（elector） 引導(dǎo)物質(zhì)朝特定的代謝方向進(jìn)行，強(qiáng)化次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成引導(dǎo)物質(zhì)朝特定的代謝方向進(jìn)行，強(qiáng)化次級(jí)代

20、謝產(chǎn)物的生物合成 常用微生物細(xì)胞壁碎片和胞外酶常用微生物細(xì)胞壁碎片和胞外酶 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 產(chǎn)酶實(shí)例產(chǎn)酶實(shí)例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SOD 超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1） 生物體內(nèi)清除超氧化物陰離子自由基（生物體內(nèi)清除超氧化物陰離子自由基（O2-）的重要金屬酶類）的重要金屬酶類 SOD 和過氧化氫酶和過氧化氫酶 (catalase)、過氧化物酶、過氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的酶促反應(yīng)防御體系，從而維

21、護(hù)生物體內(nèi)一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的酶促反應(yīng)防御體系，從而維護(hù)生物體內(nèi) 細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng)細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng) EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 產(chǎn)酶實(shí)例產(chǎn)酶實(shí)例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SOD 大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實(shí)、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮選取結(jié)實(shí)、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮 先用先用 70% 乙醇消毒乙醇消毒 20 s，再用，再用 0.1% 升汞消毒升汞消毒 10 min，然后無菌水，然后無菌水 漂洗漂洗 3 次次 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成 0.5 cm3

22、的小塊，植入含有的小塊，植入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的半固體的半固體 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中 25 oC，600 lux，12 h/d 光照條件下培養(yǎng)光照條件下培養(yǎng) 18 天，誘導(dǎo)得到愈傷組織，天，誘導(dǎo)得到愈傷組織， 每每 18 天繼代一次天繼代一次 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 產(chǎn)酶實(shí)例產(chǎn)酶實(shí)例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SOD 大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 將上述在半固體將上述在半固體 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18 天的愈傷組織，在無菌條件天的愈傷組織，在無菌條件 下轉(zhuǎn)入含

23、有下轉(zhuǎn)入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液體的液體 MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中， 加入滅菌的玻璃珠，加入滅菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d 光照條件下振蕩培養(yǎng)光照條件下振蕩培養(yǎng) 1012 天，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞天，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞 無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液體的液體 MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，25 oC，600 lux，12 h/d 光照條件下，振蕩培養(yǎng)光照條件下，振蕩培養(yǎng) 1

24、8 天天 SOD 分離純化分離純化 收集細(xì)胞，破碎，用收集細(xì)胞，破碎，用 pH 7.8 磷酸鹽緩沖液提取磷酸鹽緩沖液提取 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1907年，年，Harrison 開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河 從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，放在青蛙的凝固的淋巴液中培從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，放在青蛙的凝固的淋巴液中培 養(yǎng)，蝌蚪的神經(jīng)組織存活了數(shù)周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長(zhǎng)出了神經(jīng)養(yǎng)，蝌蚪的神經(jīng)組織存活了數(shù)周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長(zhǎng)出了神經(jīng) 纖維纖維 1950s，Earle 用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制取病毒疫苗用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制

25、取病毒疫苗 1967年，動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)微載體開發(fā)年，動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)微載體開發(fā) 1975年，雜交瘤技術(shù)年，雜交瘤技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞可產(chǎn)生較高價(jià)值的物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞可產(chǎn)生較高價(jià)值的物質(zhì) 激素、疫苗、單克隆抗體、酶激素、疫苗、單克隆抗體、酶 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu) EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞特性動(dòng)物細(xì)胞特性 ，細(xì)胞脆弱（區(qū)別于植物和微生物），細(xì)胞脆弱（區(qū)別于植物和微生物） ，比微生物細(xì)胞大幾千倍，但稍小于植物細(xì)胞，比微生物細(xì)胞大幾千倍，但稍小

26、于植物細(xì)胞 在肌體內(nèi)相互在肌體內(nèi)相互，以群體形式存在，以群體形式存在 在培養(yǎng)時(shí)具有群體效應(yīng)、在培養(yǎng)時(shí)具有群體效應(yīng)、接觸抑制性、功能全能性、接觸抑制性、功能全能性 營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜（營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基） EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 主要用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)主要用于生產(chǎn)蛋白質(zhì) 生長(zhǎng)緩慢生長(zhǎng)緩慢 容易受污染（細(xì)菌、支原體），培養(yǎng)過程中需添加抗生素容易受污染（細(xì)菌、支原體），培養(yǎng)過程中需添加抗生素 （胞外缺少保護(hù)結(jié)構(gòu)）（胞外缺少保護(hù)結(jié)構(gòu)） 大部分具有貼壁依賴性大部分具有貼壁依賴性 培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格高

27、昂培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格高昂 細(xì)胞生命有限，一般最多繼代培養(yǎng)細(xì)胞生命有限，一般最多繼代培養(yǎng) 50 代即退化死亡代即退化死亡 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 適用于非貼壁依賴型細(xì)胞適用于非貼壁依賴型細(xì)胞 、腫瘤細(xì)胞、體液（血液、淋巴、腫瘤細(xì)胞、體液（血液、淋巴 液）細(xì)胞液）細(xì)胞 類似于微生物細(xì)胞的深層發(fā)酵，但工藝條件類似于微生物細(xì)胞的深層發(fā)酵，但工藝條件 有較大差別有較大差別 對(duì)通氣、攪拌耐受性差對(duì)通氣、攪拌耐受性差 對(duì)氧氣的要求較微生物低，培養(yǎng)時(shí)需通入一對(duì)氧氣的要求較微生物低，培養(yǎng)時(shí)需通

28、入一 定比例定比例 優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)于貼壁培養(yǎng)）優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)于貼壁培養(yǎng)） 細(xì)胞在培養(yǎng)液中均勻分散，生長(zhǎng)情況良好細(xì)胞在培養(yǎng)液中均勻分散，生長(zhǎng)情況良好 傳代培養(yǎng)容易，無需消化分散細(xì)胞傳代培養(yǎng)容易，無需消化分散細(xì)胞 培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分利用率高培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分利用率高 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng) 適用于貼壁依賴型細(xì)胞適用于貼壁依賴型細(xì)胞 上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞 細(xì)胞在培養(yǎng)容器表面迅速鋪展并分裂細(xì)胞在培養(yǎng)容器表面迅速鋪展并分裂 滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但 微載

29、體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體培養(yǎng)系統(tǒng) 由葡聚糖凝膠等聚合物制得的微球由葡聚糖凝膠等聚合物制得的微球 兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì) 細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均一細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均一 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式 固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng) 貼壁或非貼壁依賴型細(xì)胞均適用貼壁或非貼壁依賴型細(xì)胞均適用 吸附法吸附法 載體為多孔性顆粒，如陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒載體為多孔性顆粒，如陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒 即屬此類即屬此類 包埋法包埋法 將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖

30、、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中 細(xì)胞不易脫落細(xì)胞不易脫落 固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞損傷程度低，可重復(fù)使用細(xì)胞損傷程度低，可重復(fù)使用 產(chǎn)物分離容易產(chǎn)物分離容易 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程 種質(zhì)細(xì)胞種質(zhì)細(xì)胞 體細(xì)胞（動(dòng)物體內(nèi)組織取出）體細(xì)胞（動(dòng)物體內(nèi)組織取出） 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞 基本工藝過程基本工藝過程 EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 氨基酸：必需氨基酸，如氨基酸：必需氨基酸，如 等，作為碳源和能源利用等

31、，作為碳源和能源利用 維生素：維生素：B 族和維族和維 C，可由，可由 提供提供 無機(jī)鹽：調(diào)節(jié)無機(jī)鹽：調(diào)節(jié) 微量元素：微量元素：Fe、Cu、Zn 等，可由血清提供等，可由血清提供 葡萄糖：作為碳源和能源（易產(chǎn)生乳酸）葡萄糖：作為碳源和能源（易產(chǎn)生乳酸） 激素：胰島素、生長(zhǎng)激素、甾體激素等，可由血清提供激素：胰島素、生長(zhǎng)激素、甾體激素等，可由血清提供 生長(zhǎng)因子：如表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因生長(zhǎng)因子：如表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子等，一般來源于血清子等，一般來源于血清 培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制 配制母液，使用前過濾除菌、稀釋；配制母液，使用前過濾除菌、稀釋； En

32、zymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 溫度溫度 影響細(xì)胞生長(zhǎng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞：影響細(xì)胞生長(zhǎng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞：36.50.25 oC 影響影響 溶解度，從而影響培養(yǎng)液溶解度，從而影響培養(yǎng)液 值值 保持細(xì)胞內(nèi)外等滲狀態(tài)，一般保持細(xì)胞內(nèi)外等滲狀態(tài)，一般 700850 kPa 溶解氧溶解氧 供氧不足：細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制供氧不足：細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制 過量供氧：容易產(chǎn)生較多氧自由基，殺傷細(xì)胞過量供氧：容易產(chǎn)生較多氧自由基，殺傷細(xì)胞 用用代替空氣（空氣、代替空氣（空氣、O2、N2、） EnzymeEnzyme

33、EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 pH 值與值與 CO2 濃度濃度 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液 pH 在在 7.07.6 之間，以之間，以 為最佳為最佳 最常用的緩沖體系為最常用的緩沖體系為 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)缺少動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)缺少 CO2，培養(yǎng)液中的，培養(yǎng)液中的 HCO3- 會(huì)被耗盡；會(huì)被耗盡； 通常通常 CO2 濃度維持在濃度維持在 210% 之間之間 指示劑：酚紅指示劑：酚紅 CO2 + H2O H+ + HCO3- EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培

34、養(yǎng)產(chǎn)酶 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 pH 值值 HEPES 緩沖體系緩沖體系 HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸羥乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acid HEPES is a zwitter-ionic organic chemical buffering agent. HEPES is widely used in cell culture, largely because it is better at maintaining physiological pH despite

35、 changes in carbon dioxide concentration (produced by cellular respiration) when compared to bicarbonate buffers, which are also commonly used in cell culture. HEPES is like water in that its dissociation decreases as the temperature decreases. This makes HEPES a more effective buffering agent for m

36、aintaining enzyme structure and function at low temperatures. EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 相關(guān)問題相關(guān)問題 為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代 傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分離、稀釋并接種到新培養(yǎng)基上繼傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分離、稀釋并接種到新培養(yǎng)基上繼 續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的階段續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的階段 體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)的特性，也就是說當(dāng)一個(gè) 細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止

37、生長(zhǎng) 當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿表面時(shí)，正常細(xì)胞停止生長(zhǎng)，但是轉(zhuǎn)化（即當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿表面時(shí)，正常細(xì)胞停止生長(zhǎng)，但是轉(zhuǎn)化（即 發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的、對(duì)接觸抑制不敏感的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的、對(duì)接觸抑制不敏感的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng) 如果不及時(shí)傳代，這些如果不及時(shí)傳代，這些，導(dǎo)，導(dǎo) 致正常細(xì)胞的退化致正常細(xì)胞的退化 ? EnzymeEnzyme EngineeringEngineering 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 產(chǎn)酶實(shí)例產(chǎn)酶實(shí)例 人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn) tPA Tissue plasminogen activator (abbr. tPA) is a protein involved in the breakdown of blood clots. It is a serine protease (EC 3.4.21.68) found on endothelial cells, the cells that line the blood vessels. As an enzyme, it catalyzes the conversion of plasminogen to