生物制藥工藝學(xué)1匯編

1、 生物制藥工藝學(xué) 第一篇 生物藥物發(fā)酵工藝 微生物代謝產(chǎn)物：次級代謝產(chǎn)物 菌種：選育、育種、保藏、培養(yǎng)基、滅菌除 菌、生產(chǎn)種子、發(fā)酵過程與控制、基因工程 菌、生物催化 第二篇 生物藥物分離純化工藝 生物藥物純化技術(shù)：液固分離、膜分離、萃 取、離子交換、吸附分離、沉淀分離、色譜 、 結(jié)晶 1 緒論 一、生物制藥的發(fā)展歷史 1929年 Fleming 青霉素 菌株：點(diǎn)青霉 1940年 Florey和Chain 結(jié)晶青霉素 20世紀(jì)40-50年代 抗生素工業(yè)發(fā)展黃金時(shí)代 20世紀(jì)60年代以來，抗腫瘤、抗病毒、抗蟲 抗生素 20世紀(jì)80年代以后，基因工程、細(xì)胞工程、 酶工程、發(fā)酵工程 第一章 緒論 二

2、、生物制藥工藝的改進(jìn)與創(chuàng)新 （一）微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展：表面培養(yǎng)到 深層培養(yǎng)、補(bǔ)料發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、高密度發(fā) 酵 （二）發(fā)酵控制技術(shù)的發(fā)展：發(fā)酵控制 （三）生物反應(yīng)器制造技術(shù)的發(fā)展：高效率 低能耗生物大容量反應(yīng)器，發(fā)酵罐技術(shù)發(fā)展 （四）分離純化技術(shù)的發(fā)展：各種分離理論 及分離技術(shù)的開發(fā) 第一章 緒論 三、生物制藥產(chǎn)品的類別 （一）微生物發(fā)酵產(chǎn)物： 1.菌體藥物，酵母菌體、單細(xì)胞蛋白，人工培 養(yǎng)真菌如靈芝、茯苓菌、香菇、猴頭菇等、 蘇云金芽孢桿菌； 2.微生物酶制劑：各類酶 3.酶活調(diào)節(jié)劑：酶的抑制劑和激活劑 4.微生物代謝產(chǎn)物：初級代謝產(chǎn)物、次級代謝 產(chǎn)物 第一章 緒論 三、生物制藥產(chǎn)品的類別

3、（二）生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：利用生物代謝過程中 的酶或酶體系將底物轉(zhuǎn)化成含有特殊功能團(tuán) 的產(chǎn)物 （三）基因工程產(chǎn)物：1982年，第一個(gè)基因 工程藥物胰島素上市，此外陸續(xù)上市的有人 生長因子、白介素、干擾素、促紅細(xì)胞生成 素等。 第一章 緒論 四、生物制藥的工藝過程 （一）菌種 （二）斜面培養(yǎng) （三）種子制備 （四）發(fā)酵 （五）發(fā)酵液預(yù)處理 （六）提取和精制 （七）成品檢驗(yàn) （八）成品包裝 2 微生物代謝產(chǎn)物生物合成與調(diào)控 2.1 微生物的代謝產(chǎn)物 2.1.1 初級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn) 2.1.2 次級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn) 2.1.3 初級代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物的關(guān)系 2.1.1 初級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn) 初級代謝

4、產(chǎn)物指的是與微生物的生長繁殖有 密切關(guān)系的代謝產(chǎn)物，如氨基酸、蛋白質(zhì)、 核苷酸、核酸、多糖、脂肪酸、維生素等 特點(diǎn)：（1）是菌體生長繁殖所必須的物質(zhì) （2）是各種微生物共有的產(chǎn)物 2.1.2 次級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn) 次級代謝產(chǎn)物指的是與生物的生長繁殖無直 接關(guān)系的代謝產(chǎn)物，是某些生物為了避免初 級代謝中間產(chǎn)物的過量積累或由于外界環(huán)境 的脅迫，而產(chǎn)生的一類有利于其生存的代謝 產(chǎn)物。 特點(diǎn)：（1）特定菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物；（2） 菌體特定生長階段的產(chǎn)物；（3）多組分的混 合物 2.1.3 初級代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物的關(guān)系 一、初級代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物的前體或 起始物 二、初級代謝的調(diào)控影響次級代謝產(chǎn)

5、物的生 物合成 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物或其中間代 謝產(chǎn)物為原料合成的，其構(gòu)建單位主要有： 氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮體及 其衍生物、甲羥戊酸衍生物、莽草酸及其衍 生物、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇、核苷衍生物等。 次級代謝產(chǎn)物的生物合成涉及起始物，包括 構(gòu)建單位的合成、構(gòu)建單位的連接和產(chǎn)物合 成后的修飾過程。 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 聚酮體及其衍生物是乙酸、丙酸、丁酸和某些短鏈 脂肪酸縮合反應(yīng)的產(chǎn)物，該反應(yīng)均由多酶復(fù)合體 聚酮合酶（PKS）催化。在縮合過程中小分子有機(jī) 酸中的羧基被轉(zhuǎn)化為合成產(chǎn)物中的酮基，所以該合 成途徑被稱為聚酮

6、體或多聚乙酰途徑（polyketide）。 聚酮體途徑的代表產(chǎn)物有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、多烯 類抗生素、蒽環(huán)類抗生素、四環(huán)類抗生素等。 聚酮體合成的起始單位有：乙酰輔酶A、丙酰輔酶A 和丁酰輔酶A；而作為鏈的延長單位有丙二酰輔酶A、 甲基丙二酰輔酶A、乙基丙二酰輔酶等，它們分別 是二碳、三碳、四碳單位的供體。 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.1 氨基酸及其衍生物 許多次級代謝產(chǎn)物是以氨基酸或氨基酸的衍 生物為原料合成的。如多肽類抗生素基本上 是由氨基酸及氨基酸的衍生物合成的。 氨基酸及其衍生物包括天然氨基酸；非天然 氨基酸如D-氨基酸、N-甲基氨基酸、-氨基 酸等。天然氨基酸合成

7、的中間產(chǎn)物鳥氨酸和 -氨基己酸。代表產(chǎn)物主要是肽類抗生素。 （見書中P16圖2-9） 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.2 糖及氨基糖 次級代謝產(chǎn)物中有些糖的結(jié)構(gòu)是非常特殊的，他們 在初級代謝產(chǎn)物中根本不存在，如構(gòu)成氨基糖苷類 抗生素的碳霉糖、竹桃糖、鏈霉糖等，它們以O(shè)-、 N-、S-、C-糖苷等與次級代謝產(chǎn)物分子中的糖苷配 基連接。 葡萄糖和戊糖是這些糖類和氨基糖的前體。葡糖糖 的碳架一般經(jīng)過異構(gòu)化、氨基化、脫氧、碳原子重 排、氧化還原或脫羧等反應(yīng)后形成各種糖類構(gòu)建單 位。氨基糖的合成是先將葡萄糖活化成己酮糖，然 后經(jīng)過轉(zhuǎn)氨作用將谷氨酰胺或谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到 己酮糖的分子上。

8、見書P16和P17的圖2-10和圖2- 11. 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.3 聚酮體及其衍生物 聚酮體及其衍生物是乙酸、丙酸、丁酸和某些短鏈 脂肪酸縮合反應(yīng)的產(chǎn)物。該反應(yīng)均由多酶復(fù)合體-聚 酮合酶（polyketide synthase,PKS）催化。 在縮合過程中，小分子有機(jī)酸中的羧基被轉(zhuǎn)化為合 成產(chǎn)物中的酮基，隨著小分子有機(jī)酸的不斷被縮合， 合成產(chǎn)物的碳鏈不斷延長，合成產(chǎn)物中的酮基也逐 漸增多聚酮體或多聚乙酰途徑。 聚酮體途徑的代表產(chǎn)物有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、多烯 類抗生素、蒽環(huán)類抗生素、四環(huán)類抗生素等。聚酮 體合成的基本步驟見書P18圖2-13，圖2-15為聚酮 體產(chǎn)

9、物與脂肪酸的生物合成過程，圖2-16為聚酮體 與脂肪酸生物合成示意圖。 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.4 甲羥戊酸及其衍生物 甲羥戊酸（mevalonic acid,MVA）,即3-甲基-3,5-二 羥基戊酸，是由乙酸縮合而成，P19圖2-17為甲羥 戊酸的生物合成路徑。 甲羥戊酸經(jīng)磷酸化、脫水和脫羧后形成具有生物活 性的異戊二烯焦磷酸（C5單位）。異戊二烯焦磷酸 幾乎可以任何數(shù)量的單元相結(jié)合，形成各種代謝產(chǎn) 物（見P20圖2-18 類胡蘿卜素和甾醇的生物合成途 徑） 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.5 環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇 環(huán)多醇是一些帶有羥基的環(huán)碳化合物

10、。氨基環(huán)多醇 是環(huán)多醇分子中的一個(gè)或多個(gè)羥基被氨基取代的衍 生物（見書P21圖2-20）。 在氨基環(huán)多醇類抗生素（如鏈霉素、慶大霉素、卡 那霉素等）中最常見的環(huán)多醇部分是由葡萄糖衍生 出來的，如-脫氧核糖、鏈霉胍都是由葡萄糖經(jīng)過 磷酸化、環(huán)化等反應(yīng)形成環(huán)多醇，再經(jīng)過氨基化等 反應(yīng)形成的（見書中P21圖2-21 氨基環(huán)多醇的生物 合成）。 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.6 堿基及其衍生物 正常核酸嘌呤堿基和嘧啶堿基，或由合成核酸的嘌 呤和嘧啶堿基經(jīng)過化學(xué)修飾而形成的非核酸嘌呤堿 基和嘧啶堿基，均可作為核酸與核苷類藥物的構(gòu)建 單位。如肌苷（inosine）是由次黃嘌呤與核糖結(jié)合

11、 而成的，又稱次黃嘌呤核苷。 肌苷和肌苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)見書中P21圖2-22。 嘌呤霉素和阿糖腺苷的轉(zhuǎn)化也都是通過生物轉(zhuǎn)化實(shí) 現(xiàn)的。其中腺嘌呤核苷酸直接被產(chǎn)生菌作為前體并 入到嘌呤霉素的分子中，阿糖腺苷是通過2-羥基腺 苷的差向異構(gòu)化合成的。 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.7 莽草酸及其衍生物 莽草酸是許多芳香族化合物（包括芳香氨基酸、肉 桂酸和某些多酚類化合物）的前體，源自葡萄糖。 芳香族氨基酸合成時(shí)有一段相同的途徑叫莽草酸途 徑。代表產(chǎn)物有利福霉素、綠膿菌素和新生霉素等 （見P22圖2-24 由芳香中間體合成的抗生素和其他 代謝產(chǎn)物） 利福霉素的芳香成分來自莽草酸；綠膿菌

12、素的吩嗪 骨架來自鄰氨基苯甲酸；新生霉素和黃青霉素的芳 香部分來自酪氨酸；放線菌素、吲哚霉素、硝吡咯 菌素的芳香環(huán)來自色氨酸。 2.2 次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑 2.2.8 吩噁嗪酮 吩噁嗪酮是構(gòu)成某些次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)，如 放線菌素的發(fā)色團(tuán)中就居于一個(gè)吩噁嗪酮的結(jié)構(gòu)。 代表產(chǎn)物有放線菌素（書中P23 圖2-25放線菌素） 色氨酸和其他一些代謝物是吩噁嗪酮生物合成的前 體，它們先形成4-甲基-3-羥基-鄰氨基苯甲酸（書中 P23圖2-26），然后兩分子的4-甲基-3-羥基-鄰氨基 苯甲酸在吩噁嗪酮合成酶的催化下被氧化脫水形成 吩噁嗪酮（見書P23圖2-27 吩噁嗪酮的生物合成） 2

13、.3.1 構(gòu)建單位的合成 次級代謝產(chǎn)物的合成首先是要合成各個(gè)構(gòu)建 單位，構(gòu)建單位就好比蓋高樓大廈的磚、瓦、 門、窗，有了這些基本材料才能蓋出各式各 樣的大廈。同樣，有了生物合成的各種構(gòu)建 單位，才能合成種類繁多的次級代謝產(chǎn)物。 2.3 次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程 2.3.2 構(gòu)建單位的連接 構(gòu)建單位合成后，在合成酶、連接酶、脫水 酶、氨基轉(zhuǎn)移酶等酶的作用下相互連接，形 成次級代謝產(chǎn)物的基本框架。 書中P24對青霉素、阿維菌素和鏈霉素的合 成途徑進(jìn)行了簡單介紹。 2.3 次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程 2.3.3 母核合成后的修飾 次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物或其中間代 謝產(chǎn)物為原料合成的，不同的構(gòu)

14、建單位合成 后的母核結(jié)構(gòu)類型和生物活性也不同。一般 次級代謝產(chǎn)物的母核結(jié)構(gòu)合成后，往往還不 具有生物活性，還要經(jīng)過后修飾過程才能產(chǎn) 生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，這些后修飾的 過程包括：氨基化、甲基化、酰基化、羥基 化等。書中P24圖2-28 由6-脫氧紅霉內(nèi)酯經(jīng) 過后修飾合成紅霉素A的過程。 2.3 次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程 微生物的生命活動是通過各種代謝途徑組成的 網(wǎng)絡(luò)相互協(xié)調(diào)來維持的，每一條代謝途徑都是 由一系列連續(xù)的酶促反應(yīng)構(gòu)成。微生物能嚴(yán)格 控制代謝活動，使之有序地運(yùn)行，并能快速適 應(yīng)環(huán)境，最經(jīng)濟(jì)地利用環(huán)境中的營養(yǎng)物。 微生物對次級代謝活動的調(diào)控主要有兩種代謝 調(diào)節(jié)方式：一種是酶合成的

15、調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)酶的 合成量，這是一種“粗調(diào)”；另一種是酶活力 調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)已有酶的活力，這是一種“細(xì)調(diào)” 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.1 酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié) 在底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的誘導(dǎo)下產(chǎn)生 2.4.2 反饋調(diào)節(jié) （一）自身代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié) （二）前體物的反饋調(diào)節(jié) （三）支路產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié) 2.4.3 磷酸鹽調(diào)節(jié) 在抗生素等多種次級代謝產(chǎn)物合成中，高濃度 磷酸鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，稱為磷酸鹽調(diào) 節(jié) 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.3 磷酸鹽調(diào)節(jié) 在抗生素等多種次級代謝產(chǎn)物合成中，高濃度 磷酸鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，稱為磷酸鹽調(diào) 節(jié)。調(diào)節(jié)機(jī)制一般可能有以下幾個(gè)方面

16、：（1） 磷酸鹽促進(jìn)初級代謝，抑制菌體的次級代謝； (2) 磷酸鹽抑制次級代謝產(chǎn)物前體的生物合成； （3）磷酸鹽抑制磷酸酯酶的活性；（4）ATP 的調(diào)節(jié)作用；（5）磷酸鹽對次級代謝產(chǎn)物合 成酶的調(diào)節(jié)；（6）磷酸鹽調(diào)控的分子機(jī)制 一般認(rèn)為作用在基因的轉(zhuǎn)錄水平上 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.4 碳分解產(chǎn)物調(diào)節(jié) （一）碳源對次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié) 碳分解產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用是指易被菌體迅速利用 的碳源及其降解產(chǎn)物對其他代謝途徑酶的調(diào)節(jié)； （二）碳分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)的分子機(jī)制 書中P31圖2-31吩噁嗪酮合成酶參與的放線菌 素生物合成 圖2-32 吩噁嗪酮合成酶mRNA水 平的Northern

17、-blotting分析 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.5 氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié) 在抗生素的生物合成中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中存在 多種氮源時(shí)，微生物總是先利用簡單的氮源， 然后再分解利用復(fù)雜的氮源；并且當(dāng)這些簡單 的氮源（如NH4+，氨基酸）濃度高時(shí)，幾乎 不合成抗生素，只有在較低的濃度時(shí)，抗生素 才開始合成。銨離子阻遏作用或氮阻遏 能夠被快速利用的氮源（如銨鹽、硝酸鹽、某 些氨基酸）對許多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成 有強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)作用 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.5 氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié) （一）阻遏次級代謝產(chǎn)物生物合成酶的合成 （二）調(diào)節(jié)初級代謝進(jìn)而影響次級代謝產(chǎn)物的 合成 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.6 菌體生長速率的調(diào)節(jié) 菌體的生長速率是控制次級代謝 的重要因素。 次級代謝產(chǎn)物受菌體生長速率調(diào)節(jié)，在生長期 次級代謝產(chǎn)物合成酶收到阻抑作用，次級代謝 產(chǎn)物不被合成。較低的菌體生長速率和缺乏某 一特定營養(yǎng)時(shí)，有利于次級代謝產(chǎn)物的合成。 書中P33表2-9 菌體生長期中受阻抑的抗生素 合成酶 2.4 次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控 2.4.7 化學(xué)調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié) 化學(xué)調(diào)節(jié)因子是微生物自身產(chǎn)生的小分子