綜合性實驗植物體內(nèi)過氧化物酶活性測定及同工酶電泳完整版

1、 過氧化物酶活性測定過氧化物酶活性測定 一、原理一、原理 1. 過氧化物酶過氧化物酶perox idase, POD ： 廣泛存在于各種動物、植物和微生物 體內(nèi)。催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng): RH2+ H2O22H2O + R 2. POD 分子結(jié)構(gòu)特點：分子結(jié)構(gòu)特點：POD 是一種由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白, 脫 輔基蛋白分子須與血紅素結(jié)合才構(gòu)成全酶。 3. POD的主要生理功能：的主要生理功能： 參與活性氧代謝過程；參與活性氧代謝過程； 參與木質(zhì)素和木栓質(zhì)的合成；參與木質(zhì)素和木栓質(zhì)的合成； 參與生長素的降解。參與生長素的降解。 二、實驗材料與試劑二、實驗材料與試劑 1.

2、1.材料材料：玉米幼苗 2.2.試劑：試劑： 0.1mol/L 磷酸緩沖液（pH6.0）；0.1mol/L 磷酸緩沖液（pH7.0） 愈創(chuàng)木酚； H2O2 三、實驗步驟三、實驗步驟 1. 提取酶液：取樣品1.0g，加入2ml的0.05mol/L pH5.5的磷酸緩沖液，冰浴研 磨，10000rpm，4離心后取上清，即為粗酶液。 2. 酶活性測定：采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，對照為煮沸5分鐘的粗酶液，反應(yīng) 體系包括：0.05mol/L pH5.5的磷酸緩沖液2.9ml；0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1ml; 2%H202 1ml；粗酶液0.1 ml，反應(yīng)1分鐘后，立刻在470nm下，測定OD值。 以每

3、分鐘在470nm處吸光度的變化0.01為一個酶活單位。 3. 計算酶活性：選取OD值變化較均勻的一段數(shù)據(jù)，代入公式計算； 以作為1個過氧化物酶活力單位（U）。 酶活力= 活力單位(U) w(g FW) 注：W = W總（g F W) V(ml)/V總 POD活性U/g.min = 注：A470為反時間內(nèi)吸光度的變化，w為樣品質(zhì)量 t為反應(yīng)時間 Vt為提取酶液總體積 Vs為測定時間酶液體積 A470*Vt W*Vs*0.01*t 同工酶電泳同工酶電泳 一、原理一、原理 聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合而聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚

4、合而 成，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)。凝膠電泳兼成，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)。凝膠電泳兼 有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀的差異，有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀的差異， 因此在電泳時產(chǎn)生不同的泳動速率而相互分離。因此在電泳時產(chǎn)生不同的泳動速率而相互分離。 利用特異性的顏色反應(yīng)使待測酶著色，這樣就可在凝膠中展現(xiàn)出酶譜。過氧 化物酶是植物體內(nèi)常見的氧化酶。植物體內(nèi)許多生理代謝過程常與它的活性及其同 工酶的種類有關(guān)。 利用過氧化物酶能催化利用過氧化物酶能催化H H2 2

5、O O2 2把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理，將經(jīng)把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理，將經(jīng) 過電泳后的凝膠置于有過電泳后的凝膠置于有H H2 2O O2 2及聯(lián)苯胺的溶液染色，出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色部位即為過氧及聯(lián)苯胺的溶液染色，出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色部位即為過氧 化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構(gòu)成過氧化物酶同工酶譜。本實化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構(gòu)成過氧化物酶同工酶譜。本實 驗利用垂直板凝膠電泳，采用驗利用垂直板凝膠電泳，采用TrisTrisGlyGly緩沖系統(tǒng)來分離陰離子過氧化物酶同工酶。緩沖系統(tǒng)來分離陰離子過氧化物酶同工酶。 二、材料、儀器設(shè)備及試劑二、材料、儀

6、器設(shè)備及試劑 1.1.材料：材料：玉米幼苗 2.2.儀器設(shè)備：儀器設(shè)備：穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；冷凍離心機(jī)及離心管； pH試紙； 3.3.試劑：試劑： （1)分離膠緩沖液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g， TEMED0.23ml，加水定容 至100ml。 (2)分離膠貯液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，過濾 后使用。 (3)過硫酸銨溶液：過硫酸銨0.2g，加水定容至100ml制膠時現(xiàn)配現(xiàn)用）。 (4)濃縮膠緩沖液：1mol/L HCl48mlTris5.98gTEMED0.46ml，調(diào)pH6.7，并定容至 100ml。 (5)濃縮

7、膠貯備液：丙烯酰胺10g，甲叉雙丙烯酰胺2.5g,加水定容到100ml，使用前過濾。 (6)電極緩沖液：Tris 6.0g，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀釋10倍。 (7)四甲基乙二胺（TEMED）。 (8)0.1的溴酚藍(lán)水溶液。 (9)聯(lián)苯胺染色母液：聯(lián)苯胺1g冰醋酸18mlH2O2ml溶解貯于棕色瓶中。 三、實驗步驟三、實驗步驟 1. 安裝電泳槽 2. 凝膠的配制 3. 過氧化物酶的提?。悍Q取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1ml H2O 或0.05mol/L TrisHCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2ml前 述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心 1520min，上清液即為酶提取液，供電泳分析用。 4. 點樣：取10ul樣品加等體積的40% 的蔗糖溶液和5ul 2%的溴酚藍(lán) 5. 電泳 6. 剝膠：電泳完畢，將電泳槽取出，倒去緩沖液，取下凝膠管，放入培養(yǎng)皿中。 用一個帶有長針頭的注射器，吸滿水，將針頭沿管壁插入，同時慢慢地將注 射器中的水推出，并不斷轉(zhuǎn)動凝膠管，將