單克隆抗體與基因工程抗體的制備

1、單克隆抗體與基因工程抗體的制備單克隆抗體與基因工程抗體的制備 抗體種類：抗體種類： 第一代抗體第一代抗體 多克隆抗體多克隆抗體（polyclonal antibody) 第二代抗體第二代抗體 單克隆抗體（單克隆抗體（monoclonal antibody) 第三代抗體第三代抗體 基因工程抗體（基因工程抗體（genetic engineering antibody) 雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產生一、單克隆抗體的產生 二、單克隆抗體的純化二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質鑒定三、單克隆抗體的性質鑒定 四、單克隆抗體的特性四

2、、單克隆抗體的特性 基因工程抗體制備基因工程抗體制備 一、一、基因工程抗體種類基因工程抗體種類 二、原理二、原理 三、重組抗原制備過程三、重組抗原制備過程 抗原決定簇（抗原表位）抗原決定簇（抗原表位） 細胞克隆細胞克隆 多克隆抗體多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體 是指抗原分子中是指抗原分子中 決定抗原特異性決定抗原特異性 的特殊化學基團，的特殊化學基團， 又稱表位又稱表位 (epitope). 由一個由一個B 淋巴細淋巴細 胞增殖胞增殖 而成的而成的 細胞集細胞集 團團 針對多種抗原決針對多種抗原決 定簇的混合抗體定簇的混合抗體 由單個由單個B細胞克細胞克 隆產生的針對單隆產生的針對單 一抗原

3、決定簇的一抗原決定簇的 同源抗體同源抗體 雜交瘤技術的理論基礎雜交瘤技術的理論基礎 淋巴細胞產生抗體的克隆選擇學說，即一種克 隆只產生一種抗體 細胞融合技術產生的雜交瘤細胞可以保持雙方 親代細胞的特性 利用代謝缺陷補救機理篩選雜交瘤細胞，并克 隆化，制備McAb 當兩個細胞緊密接觸時，細胞膜可能融合在一 起。融合細胞含有兩個不同的細胞核，稱為異核 體，產生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細 胞，稱為雜交細胞（hybrid cell）。 雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理 雜交瘤技術原理：雜交瘤技術原理： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細細胞融合劑，使免

4、疫的小鼠脾細 胞與小鼠骨髓瘤細胞融合胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 HATHAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克隆化反復的免疫學檢測篩選克隆化 增殖的雜交瘤增殖的雜交瘤細胞系細胞系 單克隆抗體生成：單克隆抗體生成：接種雜交瘤接種雜交瘤細胞于小鼠腹腔，腹水細胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效價的單克隆抗體中即可得到高效價的單克隆抗體 流流 程程 雜交瘤技術雜交瘤技術 不產生不產生IgIg的重鏈和輕鏈的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK- 與提供淋巴細胞的動物品系相同與提供淋巴細胞的動物品系相同 （一）小鼠骨髓瘤細胞（一）小鼠骨髓瘤細胞 動動 物：物： BALB/BALB/c c小鼠

5、小鼠 7 71212周齡周齡 20g20g25g25g體重體重 （二）免疫脾細胞（二）免疫脾細胞 細胞性抗原：細胞性抗原： （1 12 2）10107 7/ /只，不加佐劑，只，不加佐劑，2 23 3周重復一次周重復一次 可溶性抗原：可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑首次，完全福氏佐劑+100+100微克抗原，微克抗原，3 36 6周周 100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加強免疫天，加強免疫 免疫小鼠免疫小鼠 細胞融合劑：細胞融合劑： PEG:分子量分子量4000 的的PEG是最常用的細胞融合劑是最常用的細胞融合劑 作用機理：作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排

6、，使細胞誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞 膜易打開而有助于細胞融合膜易打開而有助于細胞融合 作用特點：作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的 PEGPEG，其純度與毒性有所不同，其純度與毒性有所不同 骨髓瘤細胞與淋巴細胞骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3-10)(1:3-10) 50% PEG 1min50% PEG 1min內加完內加完; ; 10ml10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液終止反應終止反應 融合方法融合方法 SP2/0SP2/0細胞與脾細胞的比例為細胞與脾細胞的比例為1 1：2 25 5 1ml 50%1ml 50%的的PEGPEG（無菌，預溫（無菌，

7、預溫3737）在）在1 1分鐘內滴完分鐘內滴完, ,靜置靜置4545秒秒, , 時間一到時間一到, ,將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入, ,停止停止PEGPEG作用作用 根據細胞數量加入根據細胞數量加入HATHAT培養(yǎng)基，使之分加到培養(yǎng)基，使之分加到9696孔板中時每孔孔板中時每孔 細胞數為（細胞數為（0.50.51.51.5）10105 5個。融合后個。融合后7-147-14天，換用天，換用HTHT培培 養(yǎng)液養(yǎng)液 細胞融合細胞融合 7 72020天出現克隆天出現克隆 HATHAT篩選篩選 挑克隆挑克隆 融合細胞的早期培養(yǎng)融合細胞的早期培養(yǎng) HATHAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)

8、基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤次黃嘌呤 A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，氨基喋呤；葉酸拮抗物， 阻斷阻斷DNA合成主要途徑合成主要途徑 T(Thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸前核苷酸前 體體”，供細胞通過替代途徑合成，供細胞通過替代途徑合成DNADNA 雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) HATHAT選擇作用：選擇作用： 淋巴細胞：淋巴細胞：不能生長，不能生長，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的合成的 主要途徑被主要途徑被A A阻斷阻斷 骨髓瘤細胞：骨髓瘤細胞：不能生長，不能生長，5 57 7天死亡；天死亡；

9、HGPRTHGPRT缺缺 乏，乏，DNADNA合成的替代途徑受阻合成的替代途徑受阻 雜交瘤細胞：雜交瘤細胞： 長期生長繁殖長期生長繁殖 利用淋巴細胞的利用淋巴細胞的HGPRT，將，將H合成為嘌呤合成為嘌呤 堿并最終與堿并最終與T一起合成一起合成DNA 從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力 有限稀釋法有限稀釋法 特點：特點： 不需任何特殊設備不需任何特殊設備 克隆出現效率高克隆出現效率高 實驗室常用方法實驗室常用方法 方法：方法： 細胞懸液通過系列稀釋細胞懸液通過系列稀釋 每個培養(yǎng)孔含每個培養(yǎng)孔含0

10、.50.51 1個細胞個細胞 陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備 經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤 細胞株應立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞細胞株應立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞 外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而 使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還 應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制 備單克隆抗體。備單克隆抗體。 一、單克隆抗體的產生一、單克隆抗體的產生 動物體內誘生方法

11、：動物體內誘生方法： 每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/ /只只 體外培養(yǎng)法：體外培養(yǎng)法： 中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng) 單抗含量不高，牛血清單抗含量不高，牛血清AbAb難以去除難以去除 腹腔注射法腹腔注射法 鹽析沉淀鹽析沉淀 親和層析親和層析 離子交換層析離子交換層析 二、二、McAbMcAb的純化的純化 IgIg類型、亞類測定：類型、亞類測定：雙擴法或雙擴法或ELISAELISA法法 特異性測定：特異性測定：抗原類似物的交叉反應抗原類似物的交叉反應 效價測定：效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

12、 表位測定：表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的幾株單抗是否為不同表位特異的, ,用競用競爭抑制爭抑制 法，相加指數法及微機集群分析法，相加指數法及微機集群分析 親和性測定：親和性測定：測定親和常數測定親和常數K K 雜交瘤細胞染色體：雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B細胞染色體細胞染色體 4040條，條，SP2/0SP2/0細胞細胞6868條，雜交瘤細胞一般條，雜交瘤細胞一般100100多條多條 McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western blotwestern blot 三、三、 單克隆抗體的性質鑒定單克隆抗體的性質鑒定 四、單克隆抗

13、體的特性四、單克隆抗體的特性 高度特異性高度特異性 高度的均一性和可重復性高度的均一性和可重復性 弱凝集反應和不呈現沉淀反應弱凝集反應和不呈現沉淀反應 對環(huán)境敏感性對環(huán)境敏感性 （一）單克隆抗體的特性（一）單克隆抗體的特性 優(yōu)點優(yōu)點 ： 在體外在體外“永久永久”地存活并傳代地存活并傳代 用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗 體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法 可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療 單克隆抗體的優(yōu)點與局限性單克隆抗體的優(yōu)點與局限性 局限

14、性局限性 ： 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍 反應強度不如多克隆抗體反應強度不如多克隆抗體 制備技術復雜、費時費工、價格較高制備技術復雜、費時費工、價格較高 McAbMcAb Pc PcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不純可以不純 純度高純度高 得量得量 高高 低低 特異性特異性 高高 低低 穩(wěn)定穩(wěn)定 低低 高高 沉淀反應沉淀反應 無無 有有 成本成本 高高 低低 McAbMcAb與與PcPcAbAb的比較的比較 McAb and PcAb 基因工程抗體制備基因工程抗體制備 基因工程抗體基因工程抗體(Genetic engineer

15、ing antibody) 根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在 基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或 修飾后導入受體細胞進行表達，產生新型抗體。修飾后導入受體細胞進行表達，產生新型抗體。 主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙 價抗體和雙特異性抗體。價抗體和雙特異性抗體。 將小鼠將小鼠IgIg基因敲除，轉染人基因敲除，轉染人IgIg基因，在基因，在 小鼠體內產生人小鼠體內產生人AbAb，再經雜交瘤技術，產生，再經雜交瘤技術，產生 大量完全人源化抗體大量完全人源

16、化抗體 一、人源化抗體一、人源化抗體 FabFab：抗原結合片斷抗原結合片斷 FvFv：可變區(qū)片段可變區(qū)片段 ScFvScFv：單鏈可變區(qū)片段單鏈可變區(qū)片段 SdAbSdAb：單區(qū)抗體單區(qū)抗體 二、小分子抗體二、小分子抗體 其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合 三、抗體融合蛋白三、抗體融合蛋白 許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原 分子上的兩個表位交聯或使兩個抗原分子連接。將識別腫分子上的兩個表位交聯或使兩個抗原分子連接。將識別腫 瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗 體

17、連結在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結合識別，體連結在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結合識別， 取得殺傷腫瘤細胞的作用。取得殺傷腫瘤細胞的作用。 四、雙特異性抗體四、雙特異性抗體 定義：定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體， 轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得 特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術可以得到特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術可以得到 完全人源性的抗體，在完全人源性的抗體，在HIVHIV等病毒感染和腫瘤的診斷等病毒感染和腫瘤的診斷 與治療方面有其獨特的優(yōu)越性與治療方面有其

18、獨特的優(yōu)越性 五、噬菌體抗體庫技術五、噬菌體抗體庫技術 基因工程亦稱遺傳工程，即利用基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的重組技術的 方法，把方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源作為組件，在細胞外將一種外源 DNA（目的基因）和載體（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重重新組合連接（重 組），最后將重組體轉入宿主細胞，使外源基因組），最后將重組體轉入宿主細胞，使外源基因 DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖 （cloning，克隆），或最后得到表達，最終獲得，克?。蜃詈蟮玫奖磉_，最終獲得 基因表達產物或改變生物原有的遺傳性狀?；虮磉_產物或改

19、變生物原有的遺傳性狀。 Foreign DNA to be insertedPlansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、體外基因重組、體外基因重組 目的基因的制備目的基因的制備 載體的構建：質?；蜉d體的構建：質?；?噬菌體噬菌體 目的基因與載體重

20、組目的基因與載體重組 2、重組體重組體DNA的轉的轉 化增殖和表達化增殖和表達 轉化轉化 篩選篩選 增殖和基因表達增殖和基因表達 靶序列靶序列 變性和引變性和引 物復姓物復姓 循環(huán)循環(huán)1 循環(huán)循環(huán)2 循環(huán)循環(huán)3 變性和引變性和引 物復姓物復姓 鏈延伸鏈延伸 Tag酶酶 鏈延伸鏈延伸 抗原的原核表達抗原的原核表達 以脂肪酸結合蛋白（以脂肪酸結合蛋白（FABPFABP）為例：）為例： 首先要合成或購買表達首先要合成或購買表達FABPFABP的基因序列并設計合的基因序列并設計合 成引物成引物 ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAA GAATTTCGA

21、TGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTAC CAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAA AGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAG AACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGAC AACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATG GAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACC ACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCT

22、GACACTC ACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGC ATGA 上游引物：上游引物：HF15 CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3 下游引物：下游引物：HF25 GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3 基因序列基因序列 酶切位酶切位 點點 NdeIXbaI CATATG GTATAC TCTAGA AGATCT TATG AC T AGATC CA GTAT CTAGA T 通過擴增獲取足夠的聯結片段 PCR PCR擴增擴增 。 PCR產物產物 T載體載體 連接緩沖液連接緩沖液 連接酶連接酶

23、連接連接 CATATG GTATAC TCTAGA AGATCT 表達載體表達載體 目的片段目的片段 Solution I 重組子的鑒定重組子的鑒定 誘導表達誘導表達 表達產物的表達產物的SDS-PageSDS-Page鑒定鑒定 表達產物的分離純化表達產物的分離純化 分離純化目的產物主要依賴于色譜分離技術。色譜技分離純化目的產物主要依賴于色譜分離技術。色譜技 術分為術分為： Ion exchange chromatography (IEC) Reversed phase chromatography (RPC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC) 小結小結 雜交瘤單克隆抗體制備技術的原理是利用聚乙二雜交瘤單克隆抗體制備技術的原理是利用聚乙二 醇作為細胞融合劑，使免疫