細(xì)胞培養(yǎng)操作流程.doc

1、精品文檔細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作流程細(xì)胞復(fù)蘇：1將新鮮培養(yǎng)基置于37C水浴鍋中回溫，回溫后噴以75%酉精并擦拭之，移入 無菌操作臺(tái)內(nèi)。如配置：50mL完全培養(yǎng)基（含10%FBS 1%f鏈霉素雙抗）44.5mL基礎(chǔ)培 養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL 青鏈霉素雙抗。2. 戴防護(hù)手套后，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37C水槽中快速解凍（避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡），輕搖冷凍管使其在 2 分鐘內(nèi)全部融化，以 75%酉精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。3將解凍的1mL細(xì)胞懸液緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再向瓶中加入10mL完全培養(yǎng) 基（稀釋比例為1:10），混合均勻，放入37C,

2、5%CO勺恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取 0.1ml解凍細(xì)胞懸液作存活測(cè)試。（Sf9細(xì)胞在27E生長(zhǎng)，可不需CO）4. 一般而言，細(xì)胞大都不需立即去除冷凍保護(hù)劑 （例如DMSQ）若要立即去除， 則將解凍的細(xì)胞懸液加入含有 5-10ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心 1300rpm， 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CQ培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基）傳代培養(yǎng)：1. 37T恒溫培養(yǎng)約48小時(shí)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90%后，從培養(yǎng)箱取出75cmi培養(yǎng)瓶， 倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBSS沖液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩沖液）2沿壁（無細(xì)胞的一面）緩緩加入 1mL胰酶

3、溶液消化細(xì)胞約1mi n,輕輕搖晃， 倒掉殘余胰酶，將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約 1min，拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細(xì) 胞貼壁的一面）注意：最佳消化溫度是37C，加液后用移液管反復(fù)吹打分散細(xì)胞）3. 向瓶中加入5mL完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打均勻2min，從中取出20至0.5ml 小離心管中，向管中加入80 pl臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，從混合液中取出 10 d至 蓋好蓋玻片的計(jì)數(shù)板上，計(jì)算細(xì)胞密度及活率）4. 將5mL細(xì)胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶 中，其余舍棄。再向兩瓶中各加入 10mL完全培養(yǎng)基，置于CQ培養(yǎng)箱培養(yǎng)）（細(xì)胞傳代時(shí)按 1： 5或更大比例稀釋）精品文檔細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活

4、測(cè)試:1. 取10（!混合液自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色2. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為510X105細(xì)胞 /ml。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分稀釋后計(jì)數(shù)。3. 每一大格的體積為0.1cmX）.1cmX）.01cm= 10-4ml。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)左線與上線的細(xì)胞。注：細(xì)胞密度=四大格細(xì)胞總數(shù) 稀釋倍數(shù)x104/4=細(xì)胞數(shù)/ml ;細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/ （活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）X100%細(xì)胞凍存:1. 冷凍前確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，傳代后的 5mL細(xì)胞懸液取出1mL接種到培 養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另

5、取一無菌離心管，將剩余 4mL細(xì)胞懸液置于其中，離心 1000rpm, 5min （轉(zhuǎn)速勿超過 1500rpm）。2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細(xì)胞沉淀。向離心管中加入900ul完全培養(yǎng)基，用槍頭反復(fù)吹打重懸起細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。一般細(xì)胞濃度為25X106cells/ml較適宜。3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5mL無菌凍存管中，再加入100ul試劑級(jí)DMSO混勻，制 成細(xì)胞凍存懸液（DMSOI后濃度為10%）。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代 數(shù)、日期，然后進(jìn)行凍存。注意：對(duì)Sf9細(xì)胞而言，凍存比例為：95%培養(yǎng)液+5%DMSO4. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于4C 10分鐘-20 C 30分鐘-80 C 1618小時(shí)（隔夜） f液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。（-20 C