顯微操作針制作方法研究

1、 顯微操作針制作方法研究 摘要：在顯微操作中,顯微操作針是不可缺少的工具，其質(zhì)量直接對(duì)操作的效果造成影響。文章重點(diǎn)對(duì)顯微操作中(體細(xì)胞移植、胞質(zhì)內(nèi)單精子注射等)使用的針頭類型進(jìn)行了分析，并介紹了相應(yīng)操作針的制作方法、注意事項(xiàng)等，以提高顯微操作針的制作質(zhì)量。關(guān)鍵詞：核移植；單精子注射；顯微；操作針1.儀器設(shè)備、材料拉針儀器為narishige，其型號(hào)是pn-3，其參數(shù)依次為heater、magnet、main magnet；斷針儀器為h.saur，其型號(hào)是d-72770；針磨儀器為narishige，其型號(hào)是eg-400；毛細(xì)玻璃管是borosilicate。2.制針用-毛細(xì)玻璃管的準(zhǔn)備工作要點(diǎn)

2、在采購(gòu)硅化的毛細(xì)管玻璃管時(shí)，應(yīng)檢驗(yàn)其是否已滅菌，通常國(guó)產(chǎn)的毛細(xì)管僅經(jīng)酒精浸泡處理，并且包裝非常簡(jiǎn)單，需要進(jìn)行以下處理：為了去除毛細(xì)玻璃管壁的雜物，可以將其浸泡在4hcl中24小時(shí)，并經(jīng)自來(lái)水進(jìn)行沖洗，使其保持中性狀態(tài)，在浸泡在去離子水中半小時(shí)，烘干，然后將其浸泡在75的酒精中24小時(shí)，在使用去離子水進(jìn)行沖洗烘干處理，最后經(jīng)包裝后在160的干烤2.5個(gè)小時(shí)，以達(dá)到徹底滅菌。3.顯微操作針的制作3.1固定針的制作固定針用于固定卵母細(xì)胞，它必須牢固并且不會(huì)損壞卵子。因此，固定針的形狀和內(nèi)徑至關(guān)重要，尖端應(yīng)光滑，內(nèi)徑不應(yīng)太大或太小。如果內(nèi)徑過大，卵母細(xì)胞很容易被吸入管中；如果內(nèi)徑過小，則卵子在顯微操作

3、時(shí)很容易旋轉(zhuǎn)，增加操作難度。如外徑過大，則會(huì)導(dǎo)致固定針接觸操作盤底部時(shí)，固定卵子的針嘴與底面距離過高，當(dāng)在底部分離直徑過小的卵母細(xì)胞時(shí)，易出現(xiàn)卵子旋轉(zhuǎn)，并且會(huì)失去觀察原核的最佳位置。一般固定針最佳的外徑應(yīng)為120至140um，內(nèi)徑應(yīng)為25um，且側(cè)面應(yīng)保持對(duì)稱、光滑。固定針的制作流程為：拉、斷、燒、彎。3.1.1拉針在選擇毛細(xì)玻璃管時(shí)，應(yīng)選擇外徑、內(nèi)徑、長(zhǎng)度分別為1mm、0.58mm、長(zhǎng)150mm的后壁毛細(xì)管。首先用手將毛細(xì)管兩端固定，在中間位置用自制小酒精燈加熱并旋轉(zhuǎn)，使其變軟后將其拉伸至1厘米，迅速?gòu)募訜崽幫顺觯瑫r(shí)將玻璃管拉長(zhǎng)；另外，也可以使用更合適的拉針器，具體參數(shù)為4.5、10、10

4、，但是用此方法制作的針具有較大斜坡。斷針時(shí)，需要在適當(dāng)?shù)奈恢眠M(jìn)行一次斷針操作，后續(xù)沒有改動(dòng)空間，會(huì)造成大量浪費(fèi)，一般不推薦使用。3.1.2斷針左手握針，右食指和中指用來(lái)夾醫(yī)用小砂輪。在合適位置觸摸砂輪邊緣，對(duì)玻璃管轉(zhuǎn)動(dòng)一圈，然后用拇指輕輕按一下尖端，針會(huì)斷裂，并保持尖端光滑。如若斷口不光滑，因?yàn)橛檬掷尼槺容^長(zhǎng)，可以繼續(xù)進(jìn)行折斷，直到尖端光滑、口徑對(duì)稱為止，運(yùn)用此方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)，可以通過對(duì)斷針儀進(jìn)行使用，來(lái)進(jìn)行斷針操作，利用毛細(xì)管在鉑絲彎頭的中點(diǎn)燒制一個(gè)小玻璃珠，并在斷針儀上水平安裝針，將玻璃珠移至約100um位置處，使玻璃珠剛好與針頭接觸，打開開關(guān)小火加熱，這時(shí)，由于溫度的變化，玻

5、璃珠會(huì)移動(dòng)至針尾，如玻璃珠慢慢變紅停止移動(dòng)時(shí)，毛細(xì)管會(huì)與玻璃珠接觸融合，然后將加熱開關(guān)關(guān)閉，隨著溫度突然下降，玻璃珠馬上收縮，針馬上被拉斷，此方法折斷的針具備口徑光滑的優(yōu)點(diǎn)，但由于卵針直徑過大，容易出現(xiàn)鉑絲拉斷問題，通常很少使用。3.1.3燒口用斷針儀玻璃珠接觸斷針的嘴，以使二者位于相同水平面，相隔較大距離并逐漸加熱。當(dāng)玻璃珠變成紅色并停止移動(dòng)時(shí)，停止加熱操作，并朝玻璃珠方向慢慢移動(dòng)針，針直徑會(huì)越來(lái)越小，當(dāng)口徑小于等于25um時(shí)，將加熱開關(guān)關(guān)閉。3.1.4烤彎在斷針儀上將針頭垂直固定，并與玻璃珠保持4mm的距離接觸，以確保它們?cè)谕凰矫嫔?，兩者相隔很遠(yuǎn)時(shí)，打開開關(guān)緩慢加熱，在玻璃珠顏色為紅色

6、時(shí)，停止加熱操作，玻璃珠移到靠近針位置時(shí)，針尖朝玻璃珠的方向逐步彎曲，用左手對(duì)旋鈕調(diào)節(jié)，使玻璃珠略微向上移動(dòng)，用右手拿不用的玻璃管將針尖朝玻璃珠輕輕按壓，角度為30時(shí)，將加熱開關(guān)關(guān)閉，以免出現(xiàn)針內(nèi)徑融合問題。使用時(shí)，為了確保針尖接觸操作盤底部，需要在與針中部的第一彎頭平行方向上烤第二彎頭，即使其成為倒z形。3.2去核針的制作透明帶切口去核指的是用去核針挑破透明帶，從破裂透明帶位置擠出核，此方法要求去核針尖端較細(xì)，但細(xì)的位置不宜過長(zhǎng)，基部應(yīng)較厚，方便擠壓。一般厚壁毛細(xì)管的參數(shù)應(yīng)為8、2、8最佳，抽出的針頭細(xì)處長(zhǎng)度約為1.5毫米，針尖與針頭肩部之間的距離小于5毫米，拔出針后，將其直接烤至彎曲，方法

7、與固定針一致。3.3移核針的制作移核針作用是對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行儲(chǔ)存，體細(xì)胞通過透明膠帶上的切口在透明膠帶下方移動(dòng)。因此，不需拉出尖端，但是針前端用于儲(chǔ)存體細(xì)胞的部分對(duì)內(nèi)徑、長(zhǎng)度要求要合理，內(nèi)徑過大過小都不利于操作。制作移核針的過程為拉、斷、烤。除了玻璃管的外徑、內(nèi)徑、長(zhǎng)度依次為1mm、0.75mm、150 mm的薄壁毛細(xì)管外，該方法與固定針較為相似。拉針的參數(shù)分別為7.5、8和10。在操作中，由于移核針較細(xì)，加熱速度應(yīng)放緩，否則容易出現(xiàn)針熔化。3.4盲吸法去核針的制作盲吸法核移植針用的玻璃管及操作要求與移核針基本一樣，但盲吸法是直接穿越透明帶擠出核，然后在透明帶下方移入體細(xì)胞。所以對(duì)針尖要求較高，且

8、口徑還需要維持不變，以避免將體細(xì)胞擠壞，制作流程為：拉-斷-燒-磨-洗-拔尖。3.4.1拉、斷、彎使用薄壁毛細(xì)管，其外徑、內(nèi)徑、長(zhǎng)度分別為1mm、0.75mm、150mm。拉-斷-烤彎和移核針一樣，但是在烤彎折后，需要在針尾部和彎頭相方向上進(jìn)行標(biāo)記，從而使操作更加容易，拉針參數(shù)為5、9和9。3.4.2磨在磨針儀上固定標(biāo)記好的針，將角度調(diào)整至40，使標(biāo)記點(diǎn)位于上方，旋轉(zhuǎn)90，對(duì)持針器提升桿調(diào)整，使針尖端剛好接觸磨石平面，針之間陰影重合，如沒有重疊，需繼續(xù)調(diào)整針的角度直到重疊。研磨針有兩種方法，一種是加水磨，在磨針儀器的注射器中加入適量水，慢慢向磨石加水，使水柱在針中保持特定位置，一般磨好一根約5

9、分鐘即可。另一種是不加水研磨：在放下針頭之前稍微調(diào)整磨儀器的角度，使針的尖端輕輕將研磨面按到一個(gè)小角度，以使磨針?biāo)俣忍岣?，一般磨好一根?分左右。3.4.3洗由于經(jīng)研磨的針內(nèi)外都存在玻璃碎片，需進(jìn)行清潔。使用一段連接到注射器的塑料管，其內(nèi)徑略大于針管的外徑，以連接到針，用5的氫氟酸對(duì)針尖外壁進(jìn)行清洗（由注射器對(duì)針進(jìn)行打氣）30秒鐘，然后將針連接到另一個(gè)裝有millq水的試管中，并重復(fù)清洗幾次，在清潔時(shí)，可以通過注射器打出的氣泡大小對(duì)針內(nèi)徑進(jìn)行粗略判斷。3.4.4拔尖拔尖與斷針相同，如果溫度過高，則針口容易收縮，尖拔過長(zhǎng)，在顯微操作中很容易折斷針尖且會(huì)損害胞質(zhì)；如果溫度太低，則不能順利拔出針尖，

10、在熔針儀上將經(jīng)處理成斜角的針?biāo)焦潭ǎ舛私佑|鉑絲上的玻璃珠并慢慢加熱，當(dāng)針尖和玻璃珠慢慢融合時(shí)，迅速拉出玻璃珠，這樣可在毛細(xì)玻璃管尖端形成一個(gè)短而尖的尖端，針的邊緣光滑度也較好，這種針頭可以很好完成透明帶刺破工作，且不易損壞卵膜。3.5胞質(zhì)內(nèi)單精注射（icsi）針的制作icsi的操作沒有核移植繁瑣，但對(duì)針細(xì)度提出了較高要求。如果針太細(xì)，不僅不能順利將精子吸入針內(nèi)，而且針易出現(xiàn)抖動(dòng)；針太粗，易將pvp液體攜帶進(jìn)卵母細(xì)胞，導(dǎo)致后期培養(yǎng)難度較大，因此，要求針的口徑只能容納精子頭。 icsi針的制作流程為：拉-斷-烤-磨-洗-拔尖；毛細(xì)玻璃管內(nèi)壁外徑、內(nèi)徑、長(zhǎng)度分別為1mm、0.5mm、150mm的厚壁毛細(xì)管。但要注意由于icsi針很細(xì)且容易出現(xiàn)熔化，所以在斷針過程中通常不加熱，只需將針尖輕輕觸碰玻璃珠即可完成斷針操作，因需將其磨成斜角，則無(wú)需關(guān)注口徑光滑度；在烤彎時(shí)應(yīng)慢慢加熱，拉針參數(shù)為5、9和8.5。4.顯微操作針的保存制作好的針需要存儲(chǔ)在經(jīng)75%乙醇清洗的容器中，并在使用前使用紫外線燈消毒45分鐘。結(jié)束語(yǔ)顯微操作過程比較繁瑣，且對(duì)技術(shù)的要求較高，如