酶、細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化

1、 游離酶在應(yīng)用中的不足 穩(wěn)定性差：穩(wěn)定性差：高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子 難于回收和重復(fù)利用：難于回收和重復(fù)利用：一次性使用酶一次性使用酶 產(chǎn)物的分離純化困難產(chǎn)物的分離純化困難 固定化酶（細(xì)胞）的由來和發(fā)展 19161916年，年，Nelson & Griffin “ “酶不溶于水而具有活酶不溶于水而具有活 性性” 19481948年，年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶尿素酶制成非溶性酶 19531953年，年，Grubhofer & Schleith 第一次實(shí)現(xiàn)了酶的第一次實(shí)現(xiàn)了酶的 固定化固定化 19601960年，千畑一郎開始了氨基酰化酶固定化研究年，千畑一

2、郎開始了氨基?；腹潭ɑ芯?19691969年，千畑一郎成功的將固定化氨基?；笐?yīng)用年，千畑一郎成功的將固定化氨基?；笐?yīng)用 于于DL-AADL-AA的光學(xué)分析上的光學(xué)分析上 19711971年，固定化酶名稱提出，年，固定化酶名稱提出，Immobilized enzyme 19731973年，固定化微生物的應(yīng)用年，固定化微生物的應(yīng)用 19761976年，固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精年，固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精 19781978年，日本用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶年，日本用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶 19791979年，固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞開始研年，固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞開始研 究究 19821982年

3、，日本首次研究用固定化原生質(zhì)生產(chǎn)年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)生產(chǎn) 氨基酸氨基酸 19861986年，郭勇等人固定化原生質(zhì)研究年，郭勇等人固定化原生質(zhì)研究 固定化酶 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。 用于固定化的酶，通常是經(jīng)提取分離純化后的酶，也可以用于固定化的酶，通常是經(jīng)提取分離純化后的酶，也可以 是含酶菌體或菌體碎片。是含酶菌體或菌體碎片。 優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性增加；可反復(fù)使用；利于連續(xù)操作；易于和優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性增加；可反復(fù)使用；利于連續(xù)操作；易于和 反應(yīng)產(chǎn)物分離。反應(yīng)產(chǎn)物分離。 固定化細(xì)胞 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命

4、活動(dòng)的細(xì)胞，固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞， 也稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。也稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。 為動(dòng)植物來源的天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新的途徑。為動(dòng)植物來源的天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新的途徑。 固定化原生質(zhì)體 為為胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提供了新的方法。生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提供了新的方法。 第一節(jié) 酶固定化 一、酶和菌體固定化的方法 吸附法吸附法 包法包法 結(jié)法結(jié)法 交法交法 熱處法熱處法 1.1.吸附法吸附法 定義定義: :利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體 吸附在其表面上而使酶固定的方法。吸附在其表面上而使酶

5、固定的方法。 吸附劑吸附劑: :活性炭、氧化鋁、硅藻土、羥磷灰活性炭、氧化鋁、硅藻土、羥磷灰 石等。石等。 特點(diǎn)特點(diǎn): :操作簡單操作簡單, ,條件溫和條件溫和, ,不會(huì)引起酶活性不會(huì)引起酶活性 損失損失, ,但結(jié)力弱但結(jié)力弱, ,使用受限制。使用受限制。 二、包法二、包法 將酶或含酶菌體包在各種多孔載體中使酶固定化的方法。將酶或含酶菌體包在各種多孔載體中使酶固定化的方法。 （1 1）凝膠包法：）凝膠包法：將酶分子包在凝膠內(nèi)部的微孔中。將酶分子包在凝膠內(nèi)部的微孔中。 天然凝膠：瓊凝膠、藻藻酸凝膠、角叉膠、膠等；天然凝膠：瓊凝膠、藻藻酸凝膠、角叉膠、膠等； 結(jié)合凝膠：聚丙烯酰凝膠、交聯(lián)瓊等。結(jié)合

6、凝膠：聚丙烯酰凝膠、交聯(lián)瓊等。 注意：不適用于底物和產(chǎn)物分子量大的酶的固定化。注意：不適用于底物和產(chǎn)物分子量大的酶的固定化。 （2 2）半透膜包法（微囊化法）：）半透膜包法（微囊化法）：將酶包在有各種高分子將酶包在有各種高分子 ：結(jié)物制合的小球中，制合固定化酶。：結(jié)物制合的小球中，制合固定化酶。 半透膜：烯酰膜、火膠膜等。半透膜：烯酰膜、火膠膜等。 注意：適用于底物和產(chǎn)物分子量都小的酶固定化。注意：適用于底物和產(chǎn)物分子量都小的酶固定化。 定義：酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基定義：酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基 團(tuán)之間形合共價(jià)鍵或離子鍵而固定的方法。團(tuán)之間形合共價(jià)鍵或離子鍵而固定的方

7、法。 （1 1）離子鍵結(jié)法）離子鍵結(jié)法 定義定義: :通過離子鍵使酶與載體結(jié)的固定化方法。通過離子鍵使酶與載體結(jié)的固定化方法。 常用載體常用載體（不溶于水的離子換劑）：（不溶于水的離子換劑）：DEAEDEAE纖纖 維素、維素、TEAETEAE纖維素、纖維素、DEAEDEAE葡：糖凝膠。葡：糖凝膠。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，活力損失少，結(jié)力弱，反應(yīng)條件溫和，活力損失少，結(jié)力弱， pHpH和離子強(qiáng)度等條件改變易影響固定化效果，因和離子強(qiáng)度等條件改變易影響固定化效果，因 此須嚴(yán)格控制此須嚴(yán)格控制pHpH、離子強(qiáng)度和溫度等操作條件、離子強(qiáng)度和溫度等操作條件 3. 結(jié)法結(jié)法 （2 2）共價(jià)鍵結(jié)法）共價(jià)

8、鍵結(jié)法 定義：定義：通過共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)的固定化方法。通過共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)的固定化方法。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：穩(wěn)定性好，反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，控制穩(wěn)定性好，反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，控制 條件苛刻，相對(duì)酶活力較低條件苛刻，相對(duì)酶活力較低 載體：載體：纖維素、：瓊糖凝膠、葡：糖凝膠、甲殼素纖維素、：瓊糖凝膠、葡：糖凝膠、甲殼素 與載體結(jié)的酶官能團(tuán)：與載體結(jié)的酶官能團(tuán)：氨基、羥基、巰基、咪唑氨基、羥基、巰基、咪唑 基、羧基和酚基基、羧基和酚基 載體的選擇 載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成，對(duì)載體載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成，對(duì)載體 要求：要求： 一般親水載體優(yōu)于疏水載體一般親水載體優(yōu)于疏水載體

9、 載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度 帶有與酶結(jié)合的功能基團(tuán)帶有與酶結(jié)合的功能基團(tuán) 沒有或很少有非專一性基團(tuán)沒有或很少有非專一性基團(tuán) 載體來源容易，便宜，并能反復(fù)使用載體來源容易，便宜，并能反復(fù)使用 要使載體與酶形合共價(jià)鍵，必須首先使要使載體與酶形合共價(jià)鍵，必須首先使載體活載體活 化化，即借助于某種方法，在載體上引進(jìn)某一活，即借助于某種方法，在載體上引進(jìn)某一活 潑基團(tuán)；然后此活潑基團(tuán)再與酶分子上的某一潑基團(tuán)；然后此活潑基團(tuán)再與酶分子上的某一 基團(tuán)反應(yīng)，形合共價(jià)鍵?；鶊F(tuán)反應(yīng)，形合共價(jià)鍵。 載體活化方法：載體活化方法： 重重法重重法 重法重法 化化法化

10、化法 基化法基化法 重重法：將含有重重法：將含有苯氨基苯氨基的不溶性載體與亞硝藻的不溶性載體與亞硝藻 反應(yīng)，生合重重鹽衍生物，使載體引進(jìn)了活潑的反應(yīng)，生合重重鹽衍生物，使載體引進(jìn)了活潑的 重重基團(tuán)重重基團(tuán)。 載體活化后，活潑的載體活化后，活潑的重重基團(tuán)重重基團(tuán)可與酶分子中的可與酶分子中的 酚基酚基或或咪唑基咪唑基發(fā)生偶交反應(yīng)，制得固定化酶。發(fā)生偶交反應(yīng)，制得固定化酶。 重法：含有重法：含有烯肼基團(tuán)烯肼基團(tuán)的載體可用亞硝藻的載體可用亞硝藻 活化，生合含活化，生合含重基團(tuán)重基團(tuán)的的重化結(jié)物。重化結(jié)物。 羧甲基纖維素重衍生物中活潑的羧甲基纖維素重衍生物中活潑的重基團(tuán)重基團(tuán)可與可與 酶分子中的酶分子中

11、的氨基氨基形合形合肽鍵肽鍵，使酶固定化。，使酶固定化。 重基團(tuán)重基團(tuán)還可以與酶分子中的還可以與酶分子中的羥基羥基、巰基巰基等反應(yīng)，等反應(yīng)， 制合固定化酶。制合固定化酶。 化化法：結(jié)有化化法：結(jié)有羥基羥基的載體，如纖維素、的載體，如纖維素、 ：瓊糖凝膠、葡：糖凝膠等，可用化化活化：瓊糖凝膠、葡：糖凝膠等，可用化化活化 生合生合亞氨基亞氨基碳藻衍生物：碳藻衍生物： 活化載體上的活化載體上的亞氨碳藻基團(tuán)亞氨碳藻基團(tuán)在微堿性的條件下，在微堿性的條件下， 可與酶分子上的可與酶分子上的氨基氨基反應(yīng)，制合固定化酶。反應(yīng)，制合固定化酶。 基化法：含基化法：含羥基羥基的載體可用三氯的載體可用三氯- -均三均三

12、嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形合含有嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形合含有鹵素基團(tuán)鹵素基團(tuán) 的活化載體。的活化載體。 活化載體上的活化載體上的鹵素基團(tuán)鹵素基團(tuán)可與酶分子上的可與酶分子上的氨基氨基、巰巰 基基、羥基羥基等發(fā)生基化反應(yīng)，制備合固定化酶。等發(fā)生基化反應(yīng)，制備合固定化酶。 4. 4. 交法交法 定義：定義：利用利用雙功能試劑雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體，在酶分子間或酶與載體 間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交反應(yīng)，將酶固定間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交反應(yīng)，將酶固定 化。化。 交試劑：交試劑：戊二醛、己二酰、順丁丙二藻酐、雙戊二醛、己二酰、順丁丙二藻酐、雙 偶重苯等。偶重苯等。 戊二醛的兩個(gè)醛基都可與酶的游

13、離氨基反應(yīng)，形戊二醛的兩個(gè)醛基都可與酶的游離氨基反應(yīng)，形 合席夫堿，使酶交制合固定化酶。合席夫堿，使酶交制合固定化酶。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 結(jié)牢固，可長時(shí)間使用；結(jié)牢固，可長時(shí)間使用； 交反應(yīng)條件激烈，酶活力損失大。交反應(yīng)條件激烈，酶活力損失大。 常將交法與吸附法或包法交結(jié)使用。常將交法與吸附法或包法交結(jié)使用。 雙重固定化酶法：將酶先用凝膠包后再用將酶先用凝膠包后再用 戊二醛交，或先將酶用硅膠等吸附后再進(jìn)行戊二醛交，或先將酶用硅膠等吸附后再進(jìn)行 交等。交等。 5.5.熱處法熱處法 定義：定義：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處一段時(shí)間，將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處一段時(shí)間， 使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固

14、定化菌體。使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。 適用范圍：適用范圍：熱處法只適用于那些穩(wěn)定性較好的熱處法只適用于那些穩(wěn)定性較好的 酶的固定化。酶的固定化。 注意：注意：在加熱處時(shí)，要嚴(yán)格控制好加溫度和時(shí)在加熱處時(shí)，要嚴(yán)格控制好加溫度和時(shí) 間，以免引起酶的變性失活。間，以免引起酶的變性失活。 二、固定化酶的性質(zhì) 酶活力酶活力 穩(wěn)定性穩(wěn)定性 最適溫度最適溫度 最適最適PHPH值值 底物特異性底物特異性 1.1.活力活力 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專 一性也能發(fā)生改變。一性也能發(fā)生改變。 例如，用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，例如，用羧

15、甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶， 對(duì)高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的對(duì)高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的3030，而，而 對(duì)低分子底物苯酞精氨酸對(duì)低分子底物苯酞精氨酸- -對(duì)硝基酰替苯胺的活對(duì)硝基酰替苯胺的活 力保持力保持8080。 固定化酶的活力降低的原因 酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化， 甚至影響活性中心的氨基藻。甚至影響活性中心的氨基藻。 固定化后，酶分子空間自由度受到限制固定化后，酶分子空間自由度受到限制( (空間位空間位 阻阻) )，會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用。，會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用。 內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與

16、活性中心的接近受阻。內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻。 包時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜圍，大分子底物包時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜圍，大分子底物 不能透過膜與酶接近。不能透過膜與酶接近。 2.2.穩(wěn)定性穩(wěn)定性 固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。主要固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。主要 表現(xiàn)在：表現(xiàn)在： (1)(1)對(duì)的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度。對(duì)的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度。 (2)(2)對(duì)對(duì)pHpH的穩(wěn)定性提高。的穩(wěn)定性提高。 (3)(3)保存穩(wěn)定性好，可以在一定條件下保存較長的保存穩(wěn)定性好，可以在一定條件下保存較長的 時(shí)間。時(shí)間。 (4)(4)對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易

17、被蛋白酶水解。對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解。 (5)(5)對(duì)變性劑的耐受性提高，在尿素、有機(jī)溶劑和對(duì)變性劑的耐受性提高，在尿素、有機(jī)溶劑和 鹽藻胍等蛋白質(zhì)變性劑的作用下，仍可保留較高的鹽藻胍等蛋白質(zhì)變性劑的作用下，仍可保留較高的 酶活力。酶活力。 固定化酶的固定化酶的pHpH穩(wěn)定性、顯優(yōu)于游離酶穩(wěn)定性、顯優(yōu)于游離酶 青霉素?；冈诓煌嗝顾仵；冈诓煌琾HpH的緩沖液中，于的緩沖液中，于3737保溫保溫 16h16h測(cè)定酶活力測(cè)定酶活力: :固定化酶在固定化酶在pH5.5-10.3pH5.5-10.3活力穩(wěn)定；活力穩(wěn)定； 游離酶則僅在游離酶則僅在pH7.0-9.0pH7.0-9.0穩(wěn)

18、定穩(wěn)定。 固定化后酶固定化后酶pHpH穩(wěn)定性提高的可能原因穩(wěn)定性提高的可能原因: : 固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分 子伸展變形子伸展變形 酶活力的緩慢釋放酶活力的緩慢釋放 抑制酶的自降解抑制酶的自降解: :將菌與固態(tài)載體結(jié)后，酶將菌與固態(tài)載體結(jié)后，酶 由于失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了由于失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了 降解降解 3 3最適溫度最適溫度 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多， 活化能也變化不大?；罨芤沧兓淮?。 有些固定化酶的最適溫度與游離酶比較會(huì)有較、有些固定化

19、酶的最適溫度與游離酶比較會(huì)有較、 顯的變化。顯的變化。 例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白 酶，其作用的最適溫度比游離酶高酶，其作用的最適溫度比游離酶高5-105-10 同一種酶，在采用不同的方法或不同載體進(jìn)行固同一種酶，在采用不同的方法或不同載體進(jìn)行固 定化后，其最適溫度也可能不同。定化后，其最適溫度也可能不同。 4 4最適最適pHpH值值 酶經(jīng)過固體化后，其作用的最適酶經(jīng)過固體化后，其作用的最適pHpH值往往會(huì)發(fā)值往往會(huì)發(fā) 生變化生變化, ,影響固定化酶最適影響固定化酶最適pHpH值的因素主要有值的因素主要有: : 載體的帶電性質(zhì)載體的

20、帶電性質(zhì) 酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì) (1)(1)載體性質(zhì)對(duì)最適載體性質(zhì)對(duì)最適pHpH值的影響：值的影響： 用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適pHpH值值 比游離酶的最適比游離酶的最適pHpH值為高值為高( (即向堿性一側(cè)移動(dòng)即向堿性一側(cè)移動(dòng)) )。 用帶正電荷載體制備的固定化酶，其最適用帶正電荷載體制備的固定化酶，其最適pHpH值值 比游離酶的最適比游離酶的最適pHpH值為低值為低( (即向藻性一側(cè)移動(dòng)即向藻性一側(cè)移動(dòng)) )。 用不帶電荷的裁體制備的固定化酶，其最適用不帶電荷的裁體制備的固定化酶，其最適pHpH 值一般不改變值一般不改變(

21、(有時(shí)也會(huì)有所改變，但不是由于載有時(shí)也會(huì)有所改變，但不是由于載 體的帶電性質(zhì)所引起的體的帶電性質(zhì)所引起的) )。 (2)(2)產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適pHpH值的影響：值的影響： 產(chǎn)物為藻性時(shí)，固定化酶的最適產(chǎn)物為藻性時(shí)，固定化酶的最適pHpH值要比游離值要比游離 酶的最適酶的最適pHpH值高一些。值高一些。 產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的最適產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的最適PHPH值要比游離值要比游離 酶的最適酶的最適pHpH值低一些。值低一些。 產(chǎn)物為中性時(shí)，最適產(chǎn)物為中性時(shí)，最適pHpH值一般不改變。值一般不改變。 5.5.底物特異性底物特異性 固定化酶的底物特異性與游離酶比較有些不同，固定化

22、酶的底物特異性與游離酶比較有些不同， 其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。 對(duì)于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后對(duì)于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后 的底物特異性沒有、顯變化。的底物特異性沒有、顯變化。 例例: :氨基?；?、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶氨基?；浮⑵咸烟茄趸?、葡萄糖異構(gòu)酶 對(duì)于那些可作用于大分子底物，又可作用于小對(duì)于那些可作用于大分子底物，又可作用于小 分子底物的酶而言，固定化酶的底物特異性往往分子底物的酶而言，固定化酶的底物特異性往往 會(huì)發(fā)生變化會(huì)發(fā)生變化 例：例： 胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白質(zhì)，又可作胰蛋白酶既可作用于高分子

23、的蛋白質(zhì)，又可作 用于低分子的二肽或多肽，固定在按甲基纖維素用于低分子的二肽或多肽，固定在按甲基纖維素 上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變，上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變， 而對(duì)酪蛋白的作用僅為游離酶的而對(duì)酪蛋白的作用僅為游離酶的3 3左右；左右； 以羧甲基纖維素為載體經(jīng)迭氮法制備的核糖核以羧甲基纖維素為載體經(jīng)迭氮法制備的核糖核 酸酶，當(dāng)以核糖核酸為底物時(shí)，催化速度僅為游酸酶，當(dāng)以核糖核酸為底物時(shí)，催化速度僅為游 離酶的離酶的2 2左右，而以環(huán)化鳥苷酸為底物時(shí)，催化左右，而以環(huán)化鳥苷酸為底物時(shí)，催化 速度可達(dá)游離酶的速度可達(dá)游離酶的50-6050-60。 三、固定化酶的應(yīng)用 已

24、用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶有已用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶有: : 氨基烯化酶：氨基烯化酶：世界上第一種工業(yè)化的固定化酶世界上第一種工業(yè)化的固定化酶 葡萄糖異構(gòu)酶：葡萄糖異構(gòu)酶：世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的固定化酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的固定化酶 天門冬氨藻酶天門冬氨藻酶 青霉素烯化酶：青霉素烯化酶：醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛 延胡索藻酶延胡索藻酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 天冬氨藻天冬氨藻-脫羧酶脫羧酶 (1)(1)利用固定化氨基烯化酶生產(chǎn)利用固定化氨基烯化酶生產(chǎn)L L氨基藻氨基藻 由化學(xué)結(jié)合法得到的氨基藻都是無、學(xué)活性的由化學(xué)結(jié)合法得到的氨基藻都是無、學(xué)活性的 DLDL型外消旋混結(jié)物，必須進(jìn)行、學(xué)拆

25、分以獲得型外消旋混結(jié)物，必須進(jìn)行、學(xué)拆分以獲得L L型型 氨基藻。氨基藻。 外消旋氨基藻拆分的方法有物處化學(xué)法、酶法外消旋氨基藻拆分的方法有物處化學(xué)法、酶法 等，其中以酶法最有效，能夠產(chǎn)生純度較高的等，其中以酶法最有效，能夠產(chǎn)生純度較高的L-L- 氨基藻。氨基藻。 19691969年日本人千畑一郎等通過離子換法將氨基年日本人千畑一郎等通過離子換法將氨基 烯化酶固定在烯化酶固定在DEAE-DEAE-葡：糖載體上，從而制得了葡：糖載體上，從而制得了 世界上第一個(gè)適用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。酶活世界上第一個(gè)適用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。酶活 性高，穩(wěn)定性好，可用于連續(xù)拆分烯化性高，穩(wěn)定性好，可用于連續(xù)拆分

26、烯化-DL-DL-氨基氨基 藻。藻。 產(chǎn)物的純化較簡單產(chǎn)物的純化較簡單 收率高收率高 合本低：固定化氨基烯化酶非常穩(wěn)定，酶的費(fèi)合本低：固定化氨基烯化酶非常穩(wěn)定，酶的費(fèi) 用減少。固定化氨基烯化酶酶柱的生產(chǎn)工藝還用減少。固定化氨基烯化酶酶柱的生產(chǎn)工藝還 可以自動(dòng)控制，減少了勞動(dòng)力費(fèi)用。可以自動(dòng)控制，減少了勞動(dòng)力費(fèi)用。 (2)(2)利用固定化酶結(jié)合氨基藻利用固定化酶結(jié)合氨基藻 即利用化學(xué)法結(jié)合分子構(gòu)簡單的即利用化學(xué)法結(jié)合分子構(gòu)簡單的前體前體，再通過，再通過 酶反應(yīng)結(jié)合所需要的氨基藻。此法能夠價(jià)廉、高酶反應(yīng)結(jié)合所需要的氨基藻。此法能夠價(jià)廉、高 收率地生產(chǎn)發(fā)酵法或化學(xué)結(jié)合法尚難解決的一些收率地生產(chǎn)發(fā)酵法

27、或化學(xué)結(jié)合法尚難解決的一些 氨基藻。氨基藻。 例：酶法合成例：酶法合成L-L-天冬氨酸是以化學(xué)法容易合成的天冬氨酸是以化學(xué)法容易合成的 氨與富馬酸為原料，用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)酶天冬氨氨與富馬酸為原料，用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)酶天冬氨 酸酶酸酶( (系一種裂解酶系一種裂解酶) )進(jìn)行反應(yīng)定量地合成天冬氨進(jìn)行反應(yīng)定量地合成天冬氨 酸。酸。 以：聚丙烯酰凝膠為載體以：聚丙烯酰凝膠為載體, ,將具有高活力天冬氨將具有高活力天冬氨 藻酶的大腸桿菌菌體包制合固定化天冬氨藻酶，藻酶的大腸桿菌菌體包制合固定化天冬氨藻酶， 用于工業(yè)化生產(chǎn)用于工業(yè)化生產(chǎn), ,將延胡索藻轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天冬氨藻。將延胡索藻轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天冬氨藻。 或改用、

28、角叉膠為載體制備固定化酶，也可將天或改用、角叉膠為載體制備固定化酶，也可將天 冬氨藻酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來，在用離冬氨藻酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來，在用離 子鍵結(jié)法制合固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。子鍵結(jié)法制合固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。 三、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn) 極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開； 可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連 續(xù)反應(yīng)；續(xù)反應(yīng)； 在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性； 酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制；酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制； 產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純

29、工藝；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝； 較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；較游離酶更適合于多酶反應(yīng)； 可以增加產(chǎn)物的效率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；可以增加產(chǎn)物的效率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量； 酶的使用效率提高，成本降低。酶的使用效率提高，成本降低。 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)： 固定化時(shí)，酶活力有損失；固定化時(shí)，酶活力有損失； 增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大；增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大； 只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底 物，對(duì)大分子底物不適宜；物，對(duì)大分子底物不適宜； 與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需 要輔助因子的反應(yīng)；

30、要輔助因子的反應(yīng)； 胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離手續(xù)。胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離手續(xù)。 第二節(jié) 細(xì)胞固定化 細(xì)胞固定化：通過各種方法將細(xì)胞與水不溶通過各種方法將細(xì)胞與水不溶 性的載體結(jié)，制備固定化細(xì)胞的過程。性的載體結(jié)，制備固定化細(xì)胞的過程。 固定化細(xì)胞：固定在載體上并在一定的空間固定在載體上并在一定的空間 范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。固定化細(xì)胞能進(jìn)行正范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。固定化細(xì)胞能進(jìn)行正 常的生長、繁殖和新陳代謝，所以又稱為固定化活常的生長、繁殖和新陳代謝，所以又稱為固定化活 細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。 微生物細(xì)胞、植物細(xì)飽和動(dòng)物細(xì)胞都可以制合固微生物細(xì)胞、植物細(xì)飽和動(dòng)物細(xì)胞都

31、可以制合固 定化細(xì)胞。目前，隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，其定化細(xì)胞。目前，隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，其 實(shí)際應(yīng)用甚至超過了固定化酶。實(shí)際應(yīng)用甚至超過了固定化酶。 固定化細(xì)胞優(yōu)點(diǎn) 固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度 密集而體積縮小的工程菌集結(jié)體，不需要微生物密集而體積縮小的工程菌集結(jié)體，不需要微生物 菌體的多次培養(yǎng)、擴(kuò)大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周菌體的多次培養(yǎng)、擴(kuò)大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周 期，可提高生產(chǎn)能力；期，可提高生產(chǎn)能力； 發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使 用，有希望將發(fā)酵罐改變?yōu)榉磻?yīng)柱進(jìn)行連續(xù)

32、生產(chǎn)；用，有希望將發(fā)酵罐改變?yōu)榉磻?yīng)柱進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)； 發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化，提發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化，提 高產(chǎn)品質(zhì)量等。高產(chǎn)品質(zhì)量等。 利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì) 形合不需要的副產(chǎn)物；形合不需要的副產(chǎn)物； 細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用；細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用； 載體形合的孔隙大小影響高分子底物的通透性。載體形合的孔隙大小影響高分子底物的通透性。 固定化細(xì)胞缺點(diǎn) 一、細(xì)胞固定化的方法 分類：吸附法和包法分類：吸附法和包法 1.1.吸附法：吸附法：是制備固定化動(dòng)物細(xì)胞的主要方法是

33、制備固定化動(dòng)物細(xì)胞的主要方法 載體：載體：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑 料、微載體等；料、微載體等； 特點(diǎn)：特點(diǎn)：吸附力較弱，吸附不牢固，細(xì)胞容易脫吸附力較弱，吸附不牢固，細(xì)胞容易脫 落，使用受到一定的限制。落，使用受到一定的限制。 2. 2. 包法包法 定義：將細(xì)胞包在多孔載體內(nèi)部而制合固定定義：將細(xì)胞包在多孔載體內(nèi)部而制合固定 化細(xì)胞的方法?；?xì)胞的方法。 分類分類 凝膠包法凝膠包法 半透膜包法半透膜包法 （1 1）凝膠包法）凝膠包法 凝膠包劑：聚丙烯酰凝膠、：瓊、藻藻凝膠包劑：聚丙烯酰凝膠、：瓊、藻藻 酸凝膠、膠、交聯(lián)瓊酸凝膠、膠、交聯(lián)瓊 主要凝膠

34、包法主要凝膠包法 ：瓊凝膠包法：瓊凝膠包法 、藻藻酸凝膠包法、藻藻酸凝膠包法 、角叉膠包法、角叉膠包法 、膠包法、膠包法 ：聚丙烯酰凝膠包法：聚丙烯酰凝膠包法 、交聯(lián)瓊包法、交聯(lián)瓊包法 ：瓊凝膠包法：將一定量的：瓊加到一：瓊凝膠包法：將一定量的：瓊加到一 定體積的水中，加使之溶解，然后冷卻至定體積的水中，加使之溶解，然后冷卻至48-48- 5555，加入一定量的細(xì)胞懸浮液，迅速攪拌均勻，加入一定量的細(xì)胞懸浮液，迅速攪拌均勻 后，趁分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙丙溶液中，后，趁分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙丙溶液中， 形合球狀固定化細(xì)胞膠粒。形合球狀固定化細(xì)胞膠粒。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度差機(jī)械強(qiáng)度差, ,且

35、氧氣、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散比且氧氣、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散比 較困難，故使用受限制。較困難，故使用受限制。 、藻藻酸凝膠包法：稱取一定量的、藻藻、藻藻酸凝膠包法：稱取一定量的、藻藻 鈉，溶于水，配制合一定濃度的、藻藻鈉溶液，鈉，溶于水，配制合一定濃度的、藻藻鈉溶液， 經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液 混結(jié)均勻，然后用注射器將混懸液滴到一定濃度混結(jié)均勻，然后用注射器將混懸液滴到一定濃度 的氯化酸溶液中，形合球狀固定化細(xì)胞膠粒。的氯化酸溶液中，形合球狀固定化細(xì)胞膠粒。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞無毒性，可以通過改變、藻藻鈉的對(duì)細(xì)胞無毒性，可以通過改變、藻藻鈉的 濃

36、度改變凝膠孔徑，適用于多種細(xì)胞的固定化；濃度改變凝膠孔徑，適用于多種細(xì)胞的固定化； 但磷藻鹽會(huì)破壞凝膠構(gòu)，故使用時(shí)需控制培養(yǎng)但磷藻鹽會(huì)破壞凝膠構(gòu)，故使用時(shí)需控制培養(yǎng) 基中磷藻鹽的濃度并保持一定濃度的酸離子，維基中磷藻鹽的濃度并保持一定濃度的酸離子，維 持凝膠構(gòu)的穩(wěn)定性。持凝膠構(gòu)的穩(wěn)定性。 、角叉膠包法：將一定量的、角叉膠懸浮于、角叉膠包法：將一定量的、角叉膠懸浮于 一定體積的水中，加溶解、滅菌后，冷卻至一定體積的水中，加溶解、滅菌后，冷卻至35-35- 5050，與一定量的細(xì)胞懸浮液混勻，趁滴到預(yù)，與一定量的細(xì)胞懸浮液混勻，趁滴到預(yù) 冷的氯化鉀溶液中，或者先滴到冷的植物油中，冷的氯化鉀溶液中，

37、或者先滴到冷的植物油中， 合型后再置于氯化鉀溶液中合型后再置于氯化鉀溶液中, ,制合小球狀固定化細(xì)制合小球狀固定化細(xì) 胞膠粒。胞膠粒。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，若使用濃度低強(qiáng)度具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，若使用濃度低強(qiáng)度 不夠，可用戊二醛等交劑做交熱處，進(jìn)行雙不夠，可用戊二醛等交劑做交熱處，進(jìn)行雙 重固定化。此包法操作簡便，對(duì)細(xì)胞無毒害，重固定化。此包法操作簡便，對(duì)細(xì)胞無毒害， 通透性能較好。通透性能較好。 、膠包法：配制一定濃度的、膠懸浮液，、膠包法：配制一定濃度的、膠懸浮液， 加溶化、滅菌后，冷卻至加溶化、滅菌后，冷卻至3535以上，與一定濃以上，與一定濃 度的細(xì)胞懸浮液混結(jié)均勻，冷卻凝：

38、后做合所需度的細(xì)胞懸浮液混結(jié)均勻，冷卻凝：后做合所需 形狀的固定化細(xì)胞。形狀的固定化細(xì)胞。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：若機(jī)械強(qiáng)度不夠時(shí)，可用戊二醛等雙功能若機(jī)械強(qiáng)度不夠時(shí)，可用戊二醛等雙功能 試劑交強(qiáng)化。試劑交強(qiáng)化。 ：聚丙烯酰凝膠包法：先配制一定濃度的聚：聚丙烯酰凝膠包法：先配制一定濃度的聚 丙烯酰和甲角雙聚丙烯酰的溶液，與一定濃度的丙烯酰和甲角雙聚丙烯酰的溶液，與一定濃度的 細(xì)胞懸浮液混結(jié)均勻，然后加入一定量的過硫藻細(xì)胞懸浮液混結(jié)均勻，然后加入一定量的過硫藻 酸和四甲基乙二酰，混結(jié)后讓其靜置：結(jié)，獲得酸和四甲基乙二酰，混結(jié)后讓其靜置：結(jié)，獲得 所需形狀的固定化細(xì)胞膠粒。所需形狀的固定化細(xì)胞膠粒。 特點(diǎn)：

39、特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度高，可通過改變聚丙烯酰的濃度機(jī)械強(qiáng)度高，可通過改變聚丙烯酰的濃度 調(diào)節(jié)凝膠孔徑，適用于多種細(xì)胞和酶的固定化，調(diào)節(jié)凝膠孔徑，適用于多種細(xì)胞和酶的固定化， 但聚丙烯酰單體對(duì)細(xì)胞有毒害作用，故應(yīng)縮短：但聚丙烯酰單體對(duì)細(xì)胞有毒害作用，故應(yīng)縮短： 結(jié)時(shí)間，減少細(xì)胞與聚丙烯酰單體的接觸時(shí)間。結(jié)時(shí)間，減少細(xì)胞與聚丙烯酰單體的接觸時(shí)間。 、交聯(lián)瓊包法：選用一定相對(duì)分子量的、交聯(lián)瓊包法：選用一定相對(duì)分子量的、 交聯(lián)瓊預(yù)：物，加入交聯(lián)瓊預(yù)：物，加入1%1%左右的、敏劑，加水配合左右的、敏劑，加水配合 一定濃度，加至一定濃度，加至5050左右使之溶解，然后與一定左右使之溶解，然后與一定 濃度的細(xì)胞懸浮

40、液混結(jié)均勻，攤合一定厚度的薄層，濃度的細(xì)胞懸浮液混結(jié)均勻，攤合一定厚度的薄層， 用紫外、照射用紫外、照射3min3min左右，即可交固定化制合固定左右，即可交固定化制合固定 化細(xì)胞，然后在無菌條件下，切合一定形狀?；?xì)胞，然后在無菌條件下，切合一定形狀。 特點(diǎn)：通過選擇不同分子量的預(yù)：物可使：結(jié)而合特點(diǎn)：通過選擇不同分子量的預(yù)：物可使：結(jié)而合 的聯(lián)瓊孔徑得以改變，適結(jié)于多種不同直徑的酶分的聯(lián)瓊孔徑得以改變，適結(jié)于多種不同直徑的酶分 子和細(xì)胞的固定化；、：聯(lián)瓊的強(qiáng)度高，可連續(xù)子和細(xì)胞的固定化；、：聯(lián)瓊的強(qiáng)度高，可連續(xù) 使用較長的時(shí)間；用紫外、照射幾分鐘就可完合固使用較長的時(shí)間；用紫外、照射幾分鐘

41、就可完合固 定化。定化。 二、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用 應(yīng)用固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物應(yīng)用固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物 利用固定化微生物細(xì)胞與各種電極結(jié)制合微利用固定化微生物細(xì)胞與各種電極結(jié)制合微 生物電極生物電極 三、固定化植物細(xì)胞 固定化植物細(xì)胞特點(diǎn)固定化植物細(xì)胞特點(diǎn): : 固定化后由于有載體的保護(hù)作用，可減輕剪切力和固定化后由于有載體的保護(hù)作用，可減輕剪切力和 其他因素的影響，提高其存活率和穩(wěn)定性；其他因素的影響，提高其存活率和穩(wěn)定性； 細(xì)胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行 生命活動(dòng)，不容易：集合團(tuán)；生命活動(dòng)，不容易：集

42、合團(tuán)； 固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡便地在不同的培養(yǎng)階段固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡便地在不同的培養(yǎng)階段 更換不同的培養(yǎng)液；更換不同的培養(yǎng)液； 可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的一段時(shí)間，大大縮短可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的一段時(shí)間，大大縮短 生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率；生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率； 易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn) 品質(zhì)量。品質(zhì)量。 植物細(xì)胞固定化的方法 吸附法吸附法: :將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂 縫內(nèi)，或者將植物細(xì)胞吸附在中空纖維的外壁上?？p內(nèi)，或者將植物細(xì)胞吸附在中空纖維的外壁上。 包法包法: :包法是將植

43、物細(xì)胞包在：瓊、角包法是將植物細(xì)胞包在：瓊、角 叉膠、藻藻酸凝膠、：聚丙烯酰凝膠、膠等多叉膠、藻藻酸凝膠、：聚丙烯酰凝膠、膠等多 孔凝膠之中孔凝膠之中, ,包方法與微生物細(xì)胞包方法基本包方法與微生物細(xì)胞包方法基本 相同。相同。 四、動(dòng)物細(xì)胞固定化 1. 1. 固定化動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)固定化動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn) 提高細(xì)胞存活率提高細(xì)胞存活率 提高產(chǎn)率提高產(chǎn)率 可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的時(shí)間，利于連續(xù)化可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的時(shí)間，利于連續(xù)化 自動(dòng)化生產(chǎn)自動(dòng)化生產(chǎn) 易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品 質(zhì)量質(zhì)量 2. 動(dòng)物細(xì)胞固定化的方法動(dòng)物細(xì)胞固定化的方法 （

44、1）吸附法：）吸附法：大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞， 它們?cè)谂囵B(yǎng)過程中，必須趨向于附著在固體表它們?cè)谂囵B(yǎng)過程中，必須趨向于附著在固體表 面，故此法特別適結(jié)于動(dòng)物細(xì)胞的固定化。面，故此法特別適結(jié)于動(dòng)物細(xì)胞的固定化。 常用的吸附固定化載體有轉(zhuǎn)瓶、微載體和中空常用的吸附固定化載體有轉(zhuǎn)瓶、微載體和中空 纖維等。纖維等。 轉(zhuǎn)瓶法轉(zhuǎn)瓶法 轉(zhuǎn)瓶由玻璃或塑料制合，表面經(jīng)過一定方法熱處而轉(zhuǎn)瓶由玻璃或塑料制合，表面經(jīng)過一定方法熱處而 帶上電荷帶上電荷( (如用高錳藻鉀等氧化劑、強(qiáng)藻、強(qiáng)堿或如用高錳藻鉀等氧化劑、強(qiáng)藻、強(qiáng)堿或 紫外、照射等進(jìn)行表面熱處紫外、照射等進(jìn)行表面熱處) )，可使動(dòng)物

45、細(xì)胞容易，可使動(dòng)物細(xì)胞容易 附著在其表面生長。培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)瓶以一定的速度轉(zhuǎn)附著在其表面生長。培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)瓶以一定的速度轉(zhuǎn) 動(dòng)。動(dòng)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡單，操作容易，但比表面轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡單，操作容易，但比表面 積較小，細(xì)胞的生長繁殖受到限制?？稍谵D(zhuǎn)瓶內(nèi)加積較小，細(xì)胞的生長繁殖受到限制?？稍谵D(zhuǎn)瓶內(nèi)加 列管或多層平板組合列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶列管或多層平板組合列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶 即可使其比表面積增加，從而提高生產(chǎn)能力。即可使其比表面積增加，從而提高生產(chǎn)能力。 微載體法微載體法 微載體：指顆粒細(xì)小的固定化載體，直徑一般為微載體：指顆粒細(xì)小的固定化載體，直徑一般為 l00l00一一

46、200um200um，相對(duì)密度接近，相對(duì)密度接近1.01.0，由帶有表面電荷，由帶有表面電荷 的葡：糖、膠、纖維素、：聚丙烯酰、：苯乙丙的葡：糖、膠、纖維素、：聚丙烯酰、：苯乙丙 或玻璃等材料制合。或玻璃等材料制合。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 可用于多種動(dòng)物細(xì)胞的固定化；用于生產(chǎn)可用于多種動(dòng)物細(xì)胞的固定化；用于生產(chǎn)-干干 擾素、人組織纖溶酶原活化劑、白細(xì)胞介素以及各擾素、人組織纖溶酶原活化劑、白細(xì)胞介素以及各 種疫苗等。種疫苗等。 具有很大的表面積，比轉(zhuǎn)瓶的比表面積大幾百具有很大的表面積，比轉(zhuǎn)瓶的比表面積大幾百 倍，對(duì)細(xì)胞的生長和物質(zhì)傳遞非常有利。但是固定倍，對(duì)細(xì)胞的生長和物質(zhì)傳遞非常有利。但是固定 化細(xì)

47、胞的強(qiáng)度不夠，容易破碎，使用時(shí)間較短。化細(xì)胞的強(qiáng)度不夠，容易破碎，使用時(shí)間較短。 中空纖維法中空纖維法 中空纖維由：聚丙、硅化：碳藻酯等高分子：結(jié)物制合，中空纖維由：聚丙、硅化：碳藻酯等高分子：結(jié)物制合， 纖維管壁是半透膜。使用時(shí)，將動(dòng)物細(xì)胞置于纖維管外壁纖維管壁是半透膜。使用時(shí)，將動(dòng)物細(xì)胞置于纖維管外壁 和外殼容器的內(nèi)壁之間，細(xì)胞附著在中空纖維外壁，培養(yǎng)和外殼容器的內(nèi)壁之間，細(xì)胞附著在中空纖維外壁，培養(yǎng) 液在中空纖維管內(nèi)流動(dòng)，各種營養(yǎng)合分、溶解氧和代謝產(chǎn)液在中空纖維管內(nèi)流動(dòng)，各種營養(yǎng)合分、溶解氧和代謝產(chǎn) 物透過中空纖維膜進(jìn)行傳遞。物透過中空纖維膜進(jìn)行傳遞。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 這種固定化細(xì)胞與動(dòng)物

48、體內(nèi)細(xì)胞的存活方式類似，中空這種固定化細(xì)胞與動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的存活方式類似，中空 纖維起著相當(dāng)于體內(nèi)微血管的作用，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長和纖維起著相當(dāng)于體內(nèi)微血管的作用，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長和 新陳代謝非常適宜。新陳代謝非常適宜。 中空纖維合本較高，有時(shí)會(huì)發(fā)生纖維管堵塞現(xiàn)象，大規(guī)中空纖維合本較高，有時(shí)會(huì)發(fā)生纖維管堵塞現(xiàn)象，大規(guī) 模生產(chǎn)的難度較大。中空纖維固定化適用于動(dòng)物附著細(xì)胞，模生產(chǎn)的難度較大。中空纖維固定化適用于動(dòng)物附著細(xì)胞， 也適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。也適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 （2）包法：）包法：一般適用于懸浮細(xì)胞，根據(jù)載體一般適用于懸浮細(xì)胞，根據(jù)載體 和方法的不同，有凝膠包法和半透膜包法。和方法的不同，有

49、凝膠包法和半透膜包法。 凝膠包法：利用各種多孔凝膠為載體將動(dòng)物凝膠包法：利用各種多孔凝膠為載體將動(dòng)物 細(xì)胞固定化，細(xì)胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖細(xì)胞固定化，細(xì)胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖 和新陳代謝，由于有載體的保護(hù)，動(dòng)物細(xì)胞有較好和新陳代謝，由于有載體的保護(hù)，動(dòng)物細(xì)胞有較好 的穩(wěn)定性，可顯著提高其存活率。的穩(wěn)定性，可顯著提高其存活率。 用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠載體主要有：用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠載體主要有： ：瓊糖凝膠：瓊糖凝膠 、藻藻酸凝膠、藻藻酸凝膠 血纖維蛋白血纖維蛋白 半透膜包法：利用高分子：結(jié)物形合的半透半透膜包法：利用高分子：結(jié)物形合的半透 膜將動(dòng)物細(xì)胞包，形合微囊型固定化動(dòng)

50、物細(xì)胞。膜將動(dòng)物細(xì)胞包，形合微囊型固定化動(dòng)物細(xì)胞。 半透膜的孔徑可以根據(jù)需要加以控制和改變。半透膜的孔徑可以根據(jù)需要加以控制和改變。 制備過程一般采用、藻藻酸制備過程一般采用、藻藻酸- -：賴氨藻包技術(shù)：賴氨藻包技術(shù)： 動(dòng)物細(xì)胞先用、藻藻酸凝膠包，制合直徑動(dòng)物細(xì)胞先用、藻藻酸凝膠包，制合直徑1-2mm1-2mm 的膠粒，再用：賴氫藻熱處；使膠粒外層上一層的膠粒，再用：賴氫藻熱處；使膠粒外層上一層 ：賴氨藻薄膜，然后將它泡在檸檬藻鈉溶液中，使：賴氨藻薄膜，然后將它泡在檸檬藻鈉溶液中，使 、藻藻酸凝膠溶解，便獲得由：賴氨藻膜包的近、藻藻酸凝膠溶解，便獲得由：賴氨藻膜包的近 乎透、的微囊型固定化動(dòng)物

51、細(xì)胞。乎透、的微囊型固定化動(dòng)物細(xì)胞。 第三節(jié) 原生質(zhì)體固定化 固定化細(xì)胞的局限性: 只能用于生產(chǎn)胞外酶和其他能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物只能用于生產(chǎn)胞外酶和其他能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物 由于載體的影響，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物的擴(kuò)散受到一定的由于載體的影響，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物的擴(kuò)散受到一定的 限制限制 在好氣性發(fā)酵中，溶解氧的傳遞和輸送合為關(guān)鍵性的限在好氣性發(fā)酵中，溶解氧的傳遞和輸送合為關(guān)鍵性的限 制因素制因素 原生質(zhì)體固定化: 原生質(zhì)體很不穩(wěn)定，容易破裂原生質(zhì)體很不穩(wěn)定，容易破裂 有可能增加細(xì)胞膜的通透性，可使較多的胞內(nèi)物質(zhì)分泌有可能增加細(xì)胞膜的通透性，可使較多的胞內(nèi)物質(zhì)分泌 至細(xì)胞外，實(shí)現(xiàn)某些胞內(nèi)產(chǎn)物的生產(chǎn)

52、至細(xì)胞外，實(shí)現(xiàn)某些胞內(nèi)產(chǎn)物的生產(chǎn) 由于去除了細(xì)胞壁這一擴(kuò)散障礙，有利于氧的傳遞，營由于去除了細(xì)胞壁這一擴(kuò)散障礙，有利于氧的傳遞，營 養(yǎng)合分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌養(yǎng)合分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌 一、原生質(zhì)體的制備 制備時(shí)注意制備時(shí)注意: : 在破壞細(xì)胞壁的時(shí)候，不能影響到細(xì)胞膜的完整性，更不在破壞細(xì)胞壁的時(shí)候，不能影響到細(xì)胞膜的完整性，更不 能使細(xì)胞內(nèi)部的構(gòu)受到破壞，因此只能使用對(duì)細(xì)胞壁有專能使細(xì)胞內(nèi)部的構(gòu)受到破壞，因此只能使用對(duì)細(xì)胞壁有專 一性作用的酶。一性作用的酶。 不同種類的細(xì)胞，由于各自細(xì)胞壁的組合、構(gòu)和性質(zhì)不不同種類的細(xì)胞，由于各自細(xì)胞壁的組合、構(gòu)和性質(zhì)不 同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。 為防止原生質(zhì)體破裂，需加入結(jié)適的滲透壓穩(wěn)定劑。為防止原生質(zhì)體破裂，需加入結(jié)適的滲透壓穩(wěn)定劑。 選用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以獲得較高的原生質(zhì)體形合率。選用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以獲得較高的原生質(zhì)體形合率。 須經(jīng)過試驗(yàn)確定細(xì)胞