產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測(cè)定

1、-作者xxxx-日期xxxx產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測(cè)定【精品文檔】本科開放項(xiàng)目題 目：產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測(cè)定學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：學(xué) 院：專業(yè)班級(jí)：2016年3月【精品文檔】產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測(cè)定摘要纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是高等植物細(xì)胞壁的主要成分，是公認(rèn)的自然界數(shù)量最豐富、最廉價(jià)的可再生有機(jī)物質(zhì)資源。據(jù)估計(jì)，纖維素生成量每年高達(dá)1000億噸。我國(guó)每年農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量為7億噸左右，僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘?jiān)ㄈ绲静?、玉米秸、麥秸等），每年就?億噸之多。纖維素的降解是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。但由于纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)纖維素的利用仍然非常有限。

2、目前僅有20%的纖維素物質(zhì)被開發(fā)利用，大量的纖維素物質(zhì)因無法分解利用而廢棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。隨著人口數(shù)量的不斷增長(zhǎng)和人民生活水平的不斷提高，能源危機(jī)、食物短缺、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，尋找利用可再生資源、節(jié)省糧食、減少環(huán)境污染的有效途徑顯得日趨重要。采用微生物技術(shù)處理秸稈是當(dāng)前研究最多的一種秸稈處理方法,纖維素酶能將天然纖維素降解,生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖,然而目前制約纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素之一是纖維素酶效率低下,從而造成生產(chǎn)成本過高。因此,篩選具有高活性纖維素酶的秸稈降解微生物菌株以及相關(guān)研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。關(guān)鍵詞：纖維素降解 高活性纖維

3、素酶 微生物菌株目錄第1章 緒論11.1 實(shí)驗(yàn)原理11.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑11.2.1 實(shí)驗(yàn)材料11.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器11.2.3 培養(yǎng)基2第2章 實(shí)驗(yàn)步驟32.1 采樣培養(yǎng)32.2 初篩32.3 復(fù)篩32.4 酶活的測(cè)定3334第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制63.2 菌株復(fù)篩結(jié)果63.3 測(cè)定纖維素酶活力結(jié)果7結(jié)束語8參考文獻(xiàn)9第1章 緒論1.1 實(shí)驗(yàn)原理自然界中存在大量的纖維素類物質(zhì)，同時(shí)存在著很多能分解纖維素類物質(zhì)的生物，小到細(xì)菌、放線菌、真菌，大到一些食草類昆蟲與動(dòng)物。這些生物與綠色植物一起構(gòu)成了這個(gè)世界的碳循環(huán)。在發(fā)酵堆肥中，存在著大量的，耐高溫的纖維素分解菌株，但多半都為

4、混合分解，菌種需要：1. 內(nèi)切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-D-glucanase,EC3.3.1.4,簡(jiǎn)稱EBG），也稱Cx酶、CMC酶、EG。這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)識(shí)別并水解-1,4-糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素； 2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-D-glucanase,EC3.2.1.91），也稱C1酶、微晶纖維素酶、纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolase,簡(jiǎn)稱CBH）,這類酶從纖維素長(zhǎng)鏈的非還原性末端水解-1,4-糖苷鍵，每次切下纖維二糖分子；3.-葡萄糖苷酶（-glucosidase，EC3.2.21，簡(jiǎn)稱B

5、G）又稱纖維二糖酶，它能水解纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖生產(chǎn)葡萄糖，對(duì)纖維二糖和纖維三糖的水解很快。隨著葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，這種酶的專一性比較差。只有三種酶的協(xié)同作用，才能較好的分解纖維素。就單菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的總體酶活性較高，產(chǎn)量大，故在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中的應(yīng)用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。本實(shí)驗(yàn)以羥甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，只有能夠水解纖維素成單糖并加以利用的微生物才能在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，利用篩選培養(yǎng)基分離產(chǎn)纖維素酶的微生物。以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為唯一碳源，通過微生物分解利用CMC-Na，分離出能產(chǎn)纖維素酶的菌種；剛果紅是一種酸性染

6、料，可與纖維素反應(yīng)形成紅色復(fù)合物。1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料土樣取自湖南省長(zhǎng)沙市岳麓山上、中南大學(xué)校本部草地1520cm深處； 1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器試管、燒杯、移液管、平板、錐形瓶、玻璃珠、電磁爐、電子稱、量筒、培養(yǎng)皿、酒精燈、移液槍、接種環(huán)、高壓滅菌鍋等； 1.2.3 培養(yǎng)基（1）培養(yǎng)基A、纖維素富集培養(yǎng)基（1L）：NaCl 6g，MgSO4 0.1g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.1g，(NH4)SO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，瓊脂1.5%，CMC-Na 0.5%，pH調(diào)至7.0。B、纖維素篩選培養(yǎng)基（1L）：在上述纖維素酶富集培養(yǎng)基中加入酵母粉1g。

7、C、馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，KH2PO43H2O0.1g，MgSO47H2O0.05g，0.1%孟加拉紅溶液0.33mL，瓊脂1.5g，蒸餾水100mL，自然ph，2%去氧膽酸鈉溶液2mL（預(yù)先滅菌,臨用前加入），；鏈霉素溶液10000u/mL 0.33mL（臨用前加入）。（2）溶液A、剛果紅染色液：用蒸餾水溶解剛果紅,終濃度為0.1%(w/v)。B、剛果紅脫色液:終濃度為1mol/L的NaCl溶液。 第2章 實(shí)驗(yàn)步驟2.1 采樣培養(yǎng)（1） 采樣：在事先勘察好的取樣地土壤15-20cm，取3個(gè)點(diǎn)采樣；（2） 溶解：將3份土樣各10g加入帶有玻璃珠的錐形瓶并溶于無菌水中，在搖床上

8、以200r/min振蕩30min；（3） 富集：配制100m L 富集培養(yǎng)基中，加入250mL錐形瓶中，取生理鹽水中振蕩的土樣溶液上清取5mL加入富集培養(yǎng)基中，30200r/min，培養(yǎng)24h；（4） 稀釋：梯度稀釋10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L、10-4 mol/L,10-5 mol/L、10-6 mol/L。 2.2 初篩 初篩：選取10-5mol/L、10-6mol/L兩個(gè)濃度梯度各0.1mL分別做3個(gè)平行，涂布于纖維素富集培養(yǎng)基平板上，30恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。挑取生長(zhǎng)良好的形態(tài)大小不同的菌落于纖維素液體富集培養(yǎng)基中30200r/min，培養(yǎng)24h。 2

9、.3 復(fù)篩（1） 復(fù)篩：用接種針將分離到的菌株活化后點(diǎn)種于纖維素篩選培養(yǎng)基平板上,30恒溫倒置培養(yǎng)2d。用0.1%剛果紅染色液浸染再用1mol/LNaCl溶液脫色5min。若菌株產(chǎn)纖維素酶,則會(huì)在菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈,依據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值大小選擇產(chǎn)酶菌株（2） 將篩選獲得的產(chǎn)纖維素酶的菌株接種到馬丁培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)4d,能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的為真菌,不能生長(zhǎng)的為細(xì)菌。 2.4 酶活的測(cè)定 纖維素經(jīng)纖維素酶水解后生成的還原糖能將3，5-二硝基水楊酸(DNS)中的硝基還原為氨基，生成棕紅色的氨基化合物。在一定的濃度范圍內(nèi),還原糖的量與棕紅色的深淺呈正比關(guān)系?？捎帽壬y(cè)定。 溶液

10、配制（1） CMC-Na底物溶液的配制 （2） DNS的配制 總量為250ml配方 0.1 g)，置于約150mL水中，逐漸加入氫氧化鈉10g，在50水浴中(磁力)攪拌溶解，在再依次加入酒石酸鉀鈉50g、苯酚(重蒸)0.5g和無水硫酸鈉1.25g，待全部溶解澄清后，冷卻至室溫，用水定容至250mL，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7d后使用。但是一定要注意，3，5-二硝基水楊酸和NaOH的加入時(shí)間一定要很近，或者是先加入NaOH。否則會(huì)產(chǎn)生難溶的沉淀，導(dǎo)致配制溶液失敗。且配置過程中，溶液加熱溫度不宜超過50攝氏度。 （3） （4）酶活定義1mL液體酶在指定溫度50 ，pH=4.5，每分鐘水

11、解CMC-Na底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1g葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)g/mL*min表示。簡(jiǎn)寫為CMC-Na。 實(shí)驗(yàn)步驟（1）繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度10mg/mLA、向25mL容量瓶中按下表加入相應(yīng)體積的葡萄糖儲(chǔ)液。B、取0.5mL各個(gè)濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入3mL DNS試劑混勻，沸水浴10min后終止反應(yīng)，定容至25mL，在540nm處測(cè)定吸光度。每管取3個(gè)平行樣。C、所得平行吸光度取均值，對(duì)應(yīng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo)作圖，作線性擬合，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）（3）制備粗酶液A、取發(fā)酵液1mL 8000r/min 常溫離心10min，取

12、上清液為粗酶液；B、取粗酶液依次稀釋至10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L。（4）DNS法測(cè)酶活力 參照DNS法，取0.5mL稀釋后的酶液，加入到2mL的CMC-Na底物緩沖液溶液。50水浴反應(yīng)30min后，立即加入3mLDNS試劑混勻，沸水浴10min后終止反應(yīng)，冷卻后定容至25mL。在 540nm處測(cè)定吸光度，以空白作為對(duì)照調(diào)零值，每管取三個(gè)平行樣。第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3.2 菌株復(fù)篩結(jié)果 3.3 測(cè)定纖維素酶活力結(jié)果 復(fù)篩之后測(cè)定酶活沒有得到預(yù)想的結(jié)果，分析原因如下：（1） 復(fù)篩挑選的菌株不準(zhǔn)確，培養(yǎng)得到的菌株不是產(chǎn)纖維素酶的菌株；（2） 取樣

13、地點(diǎn)有限，取樣地菌落可能不符合實(shí)驗(yàn)要求；（3） 稀釋梯度太大，富集之后得到的菌株太少；（4） 操作過程中無菌不是很嚴(yán)格，可能發(fā)生了染菌。結(jié)束語 地球上每年生產(chǎn)超過5000億噸的纖維素，因而纖維素是儲(chǔ)藏極為豐富的資源。它的生產(chǎn)對(duì)人類生存環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展有著舉足輕重的影響。纖維素酶的微生物的發(fā)酵研究主要為菌種的選育以及工藝優(yōu)化兩方面。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的纖維素酶生產(chǎn)的研究主要集中于原料預(yù)處理和發(fā)酵過程。纖維素酶的生產(chǎn)主要存在酶活力和產(chǎn)酶量不足的問題，運(yùn)用各種科學(xué)方法提高纖維素酶的活力和產(chǎn)量已成為科學(xué)研究的重要方面。當(dāng)前纖維素酶研究的一個(gè)重要課題就是選育新菌株以提高纖維素酶的產(chǎn)量和質(zhì)量從而達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要

14、求。萬事開頭難，第一次實(shí)驗(yàn)報(bào)告也是如此，實(shí)驗(yàn)原理論述長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理麻煩，課后思考題做著糾結(jié)，牢騷也發(fā)了，但還是耐著性子一項(xiàng)一項(xiàng)的完成了。慢慢地也就沒有了那種排斥感，更多的是當(dāng)做一種習(xí)慣，當(dāng)作實(shí)驗(yàn)后的一種總結(jié)把實(shí)驗(yàn)時(shí)得到的一些簡(jiǎn)單數(shù)字變成說服人的道理。這次實(shí)驗(yàn)對(duì)我而言并不僅僅是學(xué)習(xí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法的寶貴經(jīng)歷，它意味著更多。首先是實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)過程、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的完備性，從這里可以初步感受到生物學(xué)研究的科學(xué)性與嚴(yán)肅性，自己可以得到寶貴的機(jī)會(huì)，親身體會(huì)生物學(xué)研究的苦辣酸甜。 一直一直喜歡，得到正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)刻的暢快感，那是無法言明的欣慰感，一次身心徹底地放松，可以將所有一整天來積累的疲勞拋之身后，

15、即使僅僅是小小的成功，也會(huì)讓我們興奮不已。失誤是常有的，經(jīng)歷過吃驚、后悔、無奈，檢討分析，最后重新開始。一波三折的記憶清晰的印在腦海中，這種深深的挫折感，再試一次的勇氣，我會(huì)一生記取的。我明白了實(shí)踐遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于理論的道理，很感謝學(xué)校老師給了我們這么好的機(jī)會(huì)，能讓我們及時(shí)地把生物課堂上學(xué)習(xí)的理論結(jié)合上實(shí)踐。我也漸漸掌握了用已學(xué)的知識(shí)去處理數(shù)據(jù)，制作合適的表格，并用自己的語言去總結(jié)。不再是高中時(shí)看老師做實(shí)驗(yàn)，被動(dòng)地記錄數(shù)據(jù)，得出結(jié)論。在這樣的課上，我感受到的是我們每個(gè)人都是主體，我們要靠自己課前的預(yù)習(xí)知識(shí)和基礎(chǔ)知識(shí)，要靠自己的思考和探究。因此我們學(xué)會(huì)了做好課前預(yù)習(xí)，鍛煉了思考的靈性和深度。當(dāng)然另一方面，我還深深感到自己動(dòng)手能力的不足，有些實(shí)驗(yàn)做著總感覺沒別的同學(xué)來得快，可能還是練得少的緣故。孰能生巧，我相信通過不斷的練習(xí)，實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)行得更加順利。參考文獻(xiàn)1J吉林農(nóng)業(yè)，2005，28（1）：64-67 2張壯志.高效纖維素分解菌的篩選、鑒定及其生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶活性的研究D.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.3韓立榮，張雙璽，祝傳書，張興.高效纖維素降解真菌的篩選和鑒定J.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,0174.4汪金萍,徐爾尼,史立康等.高產(chǎn)