鴨坦布蘇病毒病防治關鍵技術研究及應用2[精選]

1、第三章 材料與方法1 材料實驗動物及病料來源病原分離鑒定所需要病料來源為豐城、宜豐發(fā)病鴨場無菌采集的組織病料。病毒人工感染實驗、病毒傳播實驗中所需實驗鴨采購南昌縣本地產(chǎn)蛋高峰期的南昌麻鴨（120只）；病毒防治試驗中所需實驗鴨采購宜豐縣石市鎮(zhèn)某鴨場蛋高峰期的初產(chǎn)種麻鴨（240只）。與細胞試驗種病毒復制、攻毒所用菌株為宜豐發(fā)病鴨場采集病料，由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室分離、鑒定、保存。0.01mol/l pbs（ph 7.34）：稱量1.44g的na2hpo4，0.2g的kcl，0.24g的kh2po4，8 g的nacl溶解到單蒸水中，定容至1000 ml。g/ ml，rnase酶工

2、作濃度50g/ ml，可于試驗前用緩沖液稀釋使用。引物設計軟件：primer premier 6. 0 ；基因測序比對軟件：lasergene v 7.1中的seqman軟件，rdp3(recombination detection program)軟件,jameson-wolf,mega 5.1 軟件包中的nj（neighbor-joining 方法）。研究數(shù)據(jù)處理與分析：microsoft office excel 2010。2病原分離鑒定實驗2.1.1 樣品背景調(diào)查實驗用于病毒分離鑒定的樣品為豐城市、宜豐縣鴨場樣品，樣品的背景調(diào)查情況如下:2013年，某防疫機構選取豐城市某蛋鴨養(yǎng)殖密集區(qū)

3、域，該區(qū)域大多數(shù)人從事蛋鴨養(yǎng)殖，通過現(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2013年9-10月，鴨坦布蘇病毒病在該區(qū)域曾在部分養(yǎng)殖場散發(fā)，到2013年底，產(chǎn)蛋率又逐漸恢復，現(xiàn)場實地調(diào)查2家蛋鴨養(yǎng)殖場，其中一家蛋鴨養(yǎng)殖場存籠蛋鴨8000多羽，在2013年2月份出現(xiàn)蛋鴨產(chǎn)蛋率突然下降，最低時降至10%左右，經(jīng)過40多天后，產(chǎn)蛋逐漸恢復，死亡率約10；另外一家蛋鴨養(yǎng)殖場存籠蛋鴨3000多羽，在2013年9月份開始發(fā)病，產(chǎn)蛋率下降至25%，經(jīng)過35天后，產(chǎn)蛋逐漸恢復，死亡率5%左右。兩家養(yǎng)鴨場的免疫程序為：20日齡免疫一次（h5+h9）禽流感疫苗，100日齡免疫（h5+h9）禽流感、大腸桿菌和鴨瘟三種疫苗。因此初步判定造成豐

4、城市該區(qū)域蛋鴨產(chǎn)蛋下降的主要原因，可能為鴨坦布蘇病毒病。2014年年初，某防疫機構選取宜豐縣某蛋鴨養(yǎng)殖密集區(qū)域的4家規(guī)模蛋鴨場，進行流行病學調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)2013年年底出現(xiàn)減蛋癥的有3家，現(xiàn)場實地采樣調(diào)查了2家。其中一家蛋鴨養(yǎng)殖場存籠蛋鴨約1000羽，2013年4月份購買鴨苗，17日齡、200日齡分別兩次免疫禽流感（h5n1）疫苗，發(fā)生疫情前產(chǎn)蛋率可達98%，在2013年11月底開始出現(xiàn)產(chǎn)蛋驟減的問題，直至產(chǎn)蛋率下降至10%以下，該場防疫條件尚可，天然屏障較好，產(chǎn)蛋鴨除產(chǎn)蛋率下降外，采食量等沒有明顯改變，沒有發(fā)現(xiàn)其他病理性臨床癥狀。另外一家蛋鴨養(yǎng)殖場存籠蛋鴨約1400羽，85日齡免疫禽流感（h

5、5n1）疫苗。2013年7月份購買鴨苗，11月底開產(chǎn)，按正常日齡推算，到2014年年初產(chǎn)蛋率應達到80%以上，但實際上僅日產(chǎn)鴨蛋10多枚，產(chǎn)蛋率1%左右，該場蛋鴨采食量等沒有明顯改變，沒有發(fā)現(xiàn)其他病理性臨床癥狀。剖檢可見卵巢萎縮，蛋仔均如珍珠般大小且透明；腸道鼓起，拉白色稀便；腦部有輕度腦萎縮現(xiàn)象。綜合調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蛋鴨產(chǎn)蛋率驟然下降在初次開產(chǎn)和產(chǎn)蛋高峰期蛋鴨易發(fā)，在飼養(yǎng)管理、防疫條件相對較好的養(yǎng)殖場蛋鴨繼發(fā)感染少，蛋鴨死亡率明顯減少。通過臨床癥狀等情況綜合分析，初步認為可能是由鴨坦布蘇病毒感染所致，但確診需進一步做實驗室診斷。2.1.2 樣品采集無菌采集豐城、宜豐兩地各一蛋鴨場蛋鴨的卵巢、腦等，

6、加入3倍體積等滲pbs（含1000 u青霉素和鏈霉素）進行勻漿，制成混懸液，樣品處理后保存于-80備用。將自2個鴨場采集的8份研磨處理的病料樣品（fc1-fc4和yf1-yf4）反復凍融3次，8000 rmin-1離心5min，吸取上清液，用0.22 mol/l一次性濾器過濾除菌后，將濾液接種于接種于10日齡spf雞胚，每枚胚接種0.2 ml，接種10日齡spf雞胚，接種后雞胚3 d開始出現(xiàn)死亡，5 d后5枚spf雞胚中死亡3枚，收取所有樣品雞胚尿囊液.表1病毒全基因組擴增引物序列引物名稱引物序列（5-3）上游下游atvp1/r1agaagttcatctgtgtgatagaattgccccat

7、gtcaacatvp2/r 2gtcccgtctacaccgctgatcactgtgcacagctctattatvp3/r 3gttgtccacaaaggtattggttgtcatccagtaacctatvp4/r 4gtgtttgggcctttcgaactctgagtagtggtattcatctatvp5/r5gatggagaaggaagcgtgcaacctcaattagtgtcaccgaaatvp6/r 6caccaaatacgctaaccttgatgttgtaaatgcaggtctcaatvp7/r 7gacagagaaagagaactgcatccatggattgaccacgttgatv

8、p8/r 8gaggaagtcaggccagggaaagatcctgtgttctacca注：r= a/g;y= c/t;將已鑒定為dhav-1陽性的雞胚尿囊液參照病毒rna提取試劑盒的操作說明進行病毒基因組rna提取，隨后按照amv反轉錄酶說明書進行病毒基因組cdna第一鏈的合成，反轉錄條件為：4260min, 80 5min，反應結束后將cdna置于-20保存?zhèn)溆?。fast pfu buffer 10ul，dntps(10 mm) 1ul，上/下游引物(20 pmol/ul)各1ul，cdna 2ul，fast pfu dna聚合酶(5u/ul) 1 ul，ddh2o至50ul。反應條件為：

9、94預變性3min;然后9430s，50-5430s， 72 2min30s，35個循環(huán); 72延伸，7 min，10結束反應。取 5ul pcr產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠上電泳觀察擴增結果。通過rt-pcr 擴增出病毒yf株基因組的8個基因片段，瓊脂凝膠電泳檢測，片段大小與預測基本相符，結果見圖1。擴增片段經(jīng)1%瓊脂凝膠純化回收后，克隆到peasy-b載體中，隨后每個片段挑選3個陽性克隆送生物技術公司測序。3病毒復制試驗將省宜豐縣蛋鴨場分離到的鴨坦布蘇病毒yf毒株，接種于日齡spf雞胚傳代培養(yǎng)，每天進行早上、中午和晚上共計三次照胚，將接種病毒后24內(nèi)死亡的雞胚去掉，在無菌條件下收集24h以外死亡

10、雞胚的尿囊液，尿囊液的收集不要在雞胚死亡后立馬收集，要在死亡后反復凍融兩次后再收集，收集時間為7天，然后將收集的尿囊液放入20備用。 本實驗鴨坦布蘇病毒的含量通過eld50測定來確定。具體操作方式為，在無菌條件下，將收集的spf雞胚尿囊液經(jīng)無菌檢測后用pbs液進行10倍遞增梯度稀釋，稀釋度設置為五個梯度，即濃度依次為100（尿囊原液）和10、10、10、10-4、10-5這五個濃度。將制作好的五個稀釋度尿囊液依次接種于spf雞胚的尿囊腔，操作要控制在無菌條件下進行，每個稀釋度接種枚10日齡spf雞胚，每個spf雞胚接種0.1ml。接種后雞胚置于37條件下孵化120h，觀察記錄接種后120h內(nèi)的

11、雞胚死亡情況，并按reedmuench法計算鴨坦布蘇病毒yf毒株的eld50。距離比（大于50的百分數(shù)50）（大于50的百分數(shù)小于50的百分數(shù)）eld50高于50的病毒稀釋度的對數(shù)距離比稀釋的對數(shù)。實驗分為三組（a組、b組、c組）每組蛋鴨40只，具體攻毒種類及方式如下：a組：胸肌肌肉注射注射鴨坦布蘇病毒懸液，1ml/只；b組：胸肌肌肉注射注射等量生理鹽水；c組：空白對照，不注射任何試劑。在病毒復制實驗開始前，要求麻鴨需做好常規(guī)鴨病疫苗免疫接種且為產(chǎn)蛋高峰期，選購后在試驗場地飼養(yǎng)一周，待蛋鴨適應環(huán)境正常產(chǎn)蛋后開始進行病毒人工感染試驗。實驗開始過程中三組蛋鴨之間嚴格隔離，飼養(yǎng)員嚴格執(zhí)行生物安全措施

12、，防止交叉感染影響試驗結果。從試驗開始后每天仔細觀察各組情況并做好產(chǎn)蛋量、發(fā)病情況等詳細記錄。實驗中級實驗結束后，進行臨床癥狀觀察、病理組織解剖，最終取組織樣品進行常規(guī) pcr檢測以及基因測序分析，通過蛋鴨病毒人工感染前后的試驗結果，用pcr確定及分析病毒感染情況。4病毒傳播途徑探究試驗病毒增殖培養(yǎng)、eld50測定同病毒復制試驗相同，所用毒株和蛋鴨來源均相同。實驗分為三組（a組、b組、c組）每組蛋鴨18只，具體實驗方法如下：a組：與感染病鴨混群，采用直接接觸感染方式；b組：與感染鴨在一個空間（處于下風口）但不直接接觸，采用空氣傳播感染方式；c組：空白對照，隔離飼養(yǎng)，不采取任何措施。在實驗開始前

13、飼養(yǎng)要求同病毒復制實驗。實驗開始過程中三組蛋鴨之間通過與感染病鴨混群、與感染鴨在一個空間（處于下風口）但不直接接觸、與感染鴨相隔一定空間等方式研究鴨坦布蘇病毒病經(jīng)接觸、空氣和蟲媒傳播的可能性。因此空白對照組飼養(yǎng)員嚴格執(zhí)行生物安全措施，防止交叉感染影響試驗結果。實驗開始后同樣每天仔細觀察各組情況并做好產(chǎn)蛋量、發(fā)病情況等詳細記錄。綜合臨床癥狀觀察、病理組織解剖、pcr檢測以及基因測序分析結果，綜合判定鴨群感染該病的途徑。5鴨坦布蘇病毒防治試驗5.1毒株、疫苗來源病毒復蘇培養(yǎng)、tcid50測定、所用毒株同病毒復制試驗相同，蛋鴨來源同實驗材料所述一致。疫苗：由福建農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供（f疫苗）。中

14、草藥：粉末狀，有三種，其主要配方為中草藥散劑1（復方白龍散）：主要成分有五爪龍、龍膽草、白花蛇舌草、黃芪等。按處方加工成散劑密封袋包裝備用；飼喂方式：拌料飼喂。中草藥制劑2（5%保比液-牛至提取液）：由希臘依可發(fā)公司生產(chǎn)；飼喂方式：飲水飼喂。中草藥散劑3（復方黃梔子散）：主要成分有黃梔子、生大黃、板藍根、地榆等。按處方加工成散劑密封袋包裝備用；飼喂方式：拌料飼喂。實驗分為八組（1組、2組、3組、4組、5組、6組、7組、8組）每組蛋鴨30只，具體實驗方法如表2。表2 鴨坦布蘇病毒病毒試驗分組表序號試驗組別鴨數(shù)（只）處理方法1感染對照組30攻毒、不免疫、不給藥2f疫苗免疫組30開產(chǎn)第1d和第28d

15、分別肌注f疫苗1 ml3中草藥預防1組（復方白龍散）30攻毒前20d每組用散劑70 g/d混料飼喂，攻毒后停藥4中草藥預防2組（5%牛至提取液）30攻毒前20d按照100 l水添加10 ml牛至液，鴨自由飲水，攻毒后停止添加5中草藥預防3組（復方黃梔子散）30攻毒前20d每組用散劑100 g/d混料飼喂，攻毒后停藥6中草藥治療1組（復方白龍散）30攻毒后第2d起每組用散劑105 g/d，混料飼喂7中草藥治療2組（5%牛至提取液）30攻毒后第2d起按每100 l水添加10 ml牛至液，鴨自由飲水8空白對照組30不攻毒、不免疫、不給藥攻毒時，每只鴨腿部肌肉接種制備的鴨坦布蘇病毒懸液1 ml（病毒含

16、量：5103.5tcid50）。空白對照組每只鴨注射相同劑量的正常細胞培養(yǎng)液。攻毒后，各組分別連續(xù)觀察12d，最后采血、剖檢并采集組織樣品。在實驗開始前及攻毒開始前，飼養(yǎng)要求同病毒復制、病毒傳播實驗研究相同。攻毒開始后，八組蛋鴨之間分欄飼養(yǎng)，尤其對照組飼養(yǎng)員嚴格執(zhí)行生物安全措施，防止交叉感染影響試驗結果。攻毒實驗前后，實驗開始后同樣每天每天觀察各個試驗組鴨的臨床表現(xiàn)，記錄采食量、產(chǎn)蛋率和死亡率等數(shù)據(jù)。驗結束時，每組隨機選2只鴨進行剖檢，觀察各組織臟器的眼觀病變，綜合臨床癥狀觀察、病理組織解剖、產(chǎn)蛋量變化與恢復情況、pcr檢測以及基因測序分析結果，綜合判定防控與治療該病的較好途徑與措施。6流行病學調(diào)查及田間應用試驗流行病學調(diào)查涉及南昌、九江、吉安等5個設區(qū)市的29個養(yǎng)殖場（含3個發(fā)病場）田間應用試驗主要針對吉安地區(qū)發(fā)病養(yǎng)殖場開展，涉及7個縣（市/區(qū)）10個養(yǎng)殖場。流行病學調(diào)查采取隨機抽取鴨場，通過采集病料、問詢等方式了解養(yǎng)殖場養(yǎng)殖情況及相關疫病情況。田間應用試驗主要通過在一些蛋鴨養(yǎng)殖場陸續(xù)出現(xiàn)個別死亡、產(chǎn)蛋量驟降的病，按禽流感和鴨副粘