細胞生物學：實驗六葉綠體的提取和光還原反應

1、實驗五實驗五 葉綠體的提取葉綠體的提取 和光還原反應和光還原反應( (希爾反應希爾反應) ) 基粒類囊體基粒類囊體 基質(zhì)類囊體基質(zhì)類囊體 基?；?外膜外膜 內(nèi)膜內(nèi)膜 基質(zhì)基質(zhì) 葉綠體的結(jié)構(gòu)葉綠體的結(jié)構(gòu) v葉綠體被膜：外膜，內(nèi)膜葉綠體被膜：外膜，內(nèi)膜 v類囊體：類囊體： 基粒類囊體，基質(zhì)類囊體基粒類囊體，基質(zhì)類囊體 v基質(zhì)：有基質(zhì)：有DNADNA，RNARNA，核糖體，淀粉粒和酶，核糖體，淀粉粒和酶 問問 題題 v葉綠體具有什么功能？葉綠體具有什么功能？ v如何判斷葉綠體的功能強弱？如何判斷葉綠體的功能強弱？ v如何比較不同植物的葉綠體活性大?。咳绾伪容^不同植物的葉綠體活性大??？ v如何研究影

2、響葉綠體活性的因素？如何研究影響葉綠體活性的因素？ 實驗目的實驗目的 v學習差速離心分離葉綠體的方法；學習差速離心分離葉綠體的方法； v通過檢測光還原反應（希爾反應）速率判通過檢測光還原反應（希爾反應）速率判 斷葉綠體的活性；斷葉綠體的活性； v比較兩種實驗材料的葉綠體活性。比較兩種實驗材料的葉綠體活性。 細胞器的分離細胞器的分離 v細胞組分的分離包括細胞組分的分離包括組織勻漿和離心組織勻漿和離心兩個步驟兩個步驟 。 v組織勻漿組織勻漿是在保持細胞活力的低溫條件下，用快是在保持細胞活力的低溫條件下，用快 速的機械或超聲波方式使細胞膜破裂，細胞內(nèi)的速的機械或超聲波方式使細胞膜破裂，細胞內(nèi)的 細胞

3、器等組分逸出，常用的設備有組織搗碎器、細胞器等組分逸出，常用的設備有組織搗碎器、 玻璃勻漿器、超聲波細胞破碎器等。玻璃勻漿器、超聲波細胞破碎器等。 v勻漿介質(zhì)勻漿介質(zhì)通常是含一定濃度蔗糖的緩沖溶液，比通常是含一定濃度蔗糖的緩沖溶液，比 較接近細胞質(zhì)的分散相，能保持細胞器的活性。較接近細胞質(zhì)的分散相，能保持細胞器的活性。 在整個操作過程應注意保持在在整個操作過程應注意保持在40 0C C下（即冰浴中）下（即冰浴中） 進行。進行。 細胞器的分離細胞器的分離 v利用離心機產(chǎn)生的離心力來分離不同沉利用離心機產(chǎn)生的離心力來分離不同沉 降系數(shù)的物質(zhì)或顆粒。降系數(shù)的物質(zhì)或顆粒。 v沉降系數(shù)沉降系數(shù)指在單位離

4、心力作用下，顆粒指在單位離心力作用下，顆粒 在在20200 0C C水中的沉降速度，以水中的沉降速度，以S S表示。表示。 v差速離心差速離心 利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心 力，依次增加離心力和離心時間，使各力，依次增加離心力和離心時間，使各 種沉降系數(shù)不同的顆粒先后沉淀下來的種沉降系數(shù)不同的顆粒先后沉淀下來的 分離技術(shù)。沉降系數(shù)差別在一個或幾個分離技術(shù)。沉降系數(shù)差別在一個或幾個 數(shù)量級的顆粒，可以用此法分離。數(shù)量級的顆粒，可以用此法分離。 細胞器的分離細胞器的分離 v根據(jù)離心速度的不同，可分為：根據(jù)離心速度的不同，可分為： 低速離心（低速離心（0-4,

5、000rpm0-4,000rpm） 高速離心（高速離心（4,000-20,000rpm4,000-20,000rpm） 超高速離心（超高速離心（20,000-80,000rpm20,000-80,000rpm） 差速離心差速離心 細胞核細胞核線粒體線粒體 葉綠體葉綠體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基器高爾基器 溶酶體溶酶體 核糖體核糖體 密度梯度離心密度梯度離心 v密度梯度離心密度梯度離心是將要分離的細胞組分放是將要分離的細胞組分放 在已形成密度梯度的在已形成密度梯度的惰性物質(zhì)惰性物質(zhì)（如蔗糖（如蔗糖 5%5%20%20%）溶液的表面，在這種條件下）溶液的表面，在這種條件下 進行離心，不同組分以不同的沉

6、降速度進行離心，不同組分以不同的沉降速度 沉降，形成不同的沉降，形成不同的沉降帶沉降帶。 v差速離心與密度梯度離心相結(jié)合可以達差速離心與密度梯度離心相結(jié)合可以達 到更精細的分離到更精細的分離。 密度梯度離心密度梯度離心 1. 葉綠體的提取葉綠體的提取 沉淀沉淀1 沉淀沉淀2 將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心, , 是分離細胞器的常用方法。是分離細胞器的常用方法。 RPM RPM 與與 g g 的關(guān)系的關(guān)系 vRPMRPM（revolution per minute)revolution per minute)為離心機的轉(zhuǎn)為離心機的轉(zhuǎn) 速，以每分鐘

7、多少轉(zhuǎn)表示。速，以每分鐘多少轉(zhuǎn)表示。 vg g(gravity=relative centrifugal force)(gravity=relative centrifugal force)為為 相對離心力。相對離心力。 v RPMRPM與與g g的關(guān)系為：的關(guān)系為： g=1.11g=1.111010-5 -5 R RRPMRPM2 2 R R為離心機轉(zhuǎn)軸到離心管遠端的距離（為離心機轉(zhuǎn)軸到離心管遠端的距離（cm)cm) v將直尺連接將直尺連接R 與與r/min值，值， 與與g直線相交直線相交 的點表示相對的點表示相對 離心力。離心力。 vg的左列數(shù)值的左列數(shù)值 對應對應r/min的的 左列數(shù)值

8、，左列數(shù)值，g 的右列數(shù)值對的右列數(shù)值對 應應r/min的右的右 列數(shù)值。列數(shù)值。 1. 葉綠體的提取葉綠體的提取 v5g 5g 新鮮青菜葉片，剪碎，在研缽中加新鮮青菜葉片，剪碎，在研缽中加10 10 mlml預冷的提取介質(zhì)和少許石英砂，預冷的提取介質(zhì)和少許石英砂，冰浴中冰浴中 迅速研磨迅速研磨成勻漿，補成勻漿，補5 ml5 ml提取介質(zhì)。提取介質(zhì)。 v用用4 4層紗布將勻漿液層紗布將勻漿液過濾過濾于一支預冷的離心于一支預冷的離心 管中管中(1(1號號) )。 v44下下800rpm 800rpm 離心離心3 min3 min，離心后將上清液，離心后將上清液 倒入另一支預冷的離心管中倒入另一支

9、預冷的離心管中(2(2號號) )。 v將上清液于將上清液于44下下2000rpm2000rpm離心離心8min8min，棄上，棄上 清，清，2 2號管沉淀即為葉綠體。號管沉淀即為葉綠體。 2. 葉綠體的功能檢測葉綠體的功能檢測 v葉綠體是植物進行光合作用的細胞器。葉綠體是植物進行光合作用的細胞器。 v在低溫下以等滲溶液制備完整的葉綠體。在低溫下以等滲溶液制備完整的葉綠體。 v在光照下葉綠體中的在光照下葉綠體中的水被光解水被光解，放出氧氣，放出氧氣 和質(zhì)子，質(zhì)子進入電子傳遞鏈，這就是葉和質(zhì)子，質(zhì)子進入電子傳遞鏈，這就是葉 綠體中進行的光還原反應。在本實驗中質(zhì)綠體中進行的光還原反應。在本實驗中質(zhì)

10、子則還原子則還原2,6-2,6-二氯靛酚二氯靛酚( (簡稱簡稱DCIP)DCIP)。 vDCIP DCIP 被還原后，顏色從藍色變?yōu)闊o色，被還原后，顏色從藍色變?yōu)闊o色， 因此可根據(jù)溶液因此可根據(jù)溶液ODOD值的變化檢測光還原反值的變化檢測光還原反 應。應。 實驗原理實驗原理 光光 2 + 2H2O 2 + O2 葉綠體葉綠體 氧化型二氯靛酚氧化型二氯靛酚 還原型二氯靛酚還原型二氯靛酚 （藍色）（藍色） （無色）（無色） ClCl N OH O ClCl NH OH OH 葉綠體的功能葉綠體的功能_光合作用光合作用 光反應光反應原初反應原初反應 對光的吸收、對光的吸收、 傳遞和轉(zhuǎn)換傳遞和轉(zhuǎn)換 光

11、能光能 電能電能 電子傳遞和電子傳遞和 光合磷酸化光合磷酸化 水的光解水的光解 氧的釋放氧的釋放 形成形成ATPATP和和 NADPHNADPH 電能電能 活活 躍的化學能躍的化學能 暗反應暗反應碳同化碳同化 COCO2 2被還原，生被還原，生 成碳水化合物成碳水化合物 活躍的化學活躍的化學 能能 穩(wěn)穩(wěn) 定的化學能定的化學能 光合作用光合作用 v光反應光反應 在在類囊體膜類囊體膜上進行，通過葉綠素等色素分上進行，通過葉綠素等色素分 子吸收、傳遞光能，將光能轉(zhuǎn)化為化學能，子吸收、傳遞光能，將光能轉(zhuǎn)化為化學能， 形成形成ATPATP和和NADPHNADPH的過程，在此過程中水分的過程，在此過程中水

12、分 子被光解放出氧。子被光解放出氧。 v暗反應暗反應 利用光反應產(chǎn)生的利用光反應產(chǎn)生的ATPATP和和NADPHNADPH的化學能，的化學能， 使使COCO2 2還原，合成糖，是在還原，合成糖，是在葉綠體基質(zhì)葉綠體基質(zhì)中進中進 行的。行的。 光還原反應檢測光還原反應檢測 v取預冷的試管取預冷的試管5 5支，分別編號支，分別編號1 1、2 2、3 3、4 4、5 5，然，然 后按下表加入試劑：后按下表加入試劑： 管號管號提取介質(zhì)提取介質(zhì) （mlml） 葉綠體稀釋液葉綠體稀釋液 （mlml） 預處理預處理DCIP DCIP （mlml） 1 1調(diào)零調(diào)零 2.52.5（冰?。ū。?2 22.52

13、.52.52.5（青菜）（青菜）（冰?。ū。? 1滴滴 3 32.52.52.52.5（青菜）（青菜）沸水浴沸水浴1 1滴滴 4 42.52.52.52.5（青菜）（青菜）TritonX-100TritonX-1001 1滴滴 5 52.52.52.52.5（任選）（任選）（冰?。ū。? 1滴滴 光還原反應檢測光還原反應檢測 v當加入當加入2,6-2,6-二氯靛酚后立即搖勻，倒入相二氯靛酚后立即搖勻，倒入相 應的比色杯中，迅速測定應的比色杯中，迅速測定620nm620nm處的處的ODOD值，值， 此即代表作用時間為此即代表作用時間為0 0時的時的ODOD值值( (分光光度分光光度 計在

14、計在227227室）。室）。 v將比色杯置于日燈光下照光（在將比色杯置于日燈光下照光（在217217室），室）， 每隔每隔3min3min快速讀下快速讀下ODOD值值，連續(xù)進行光照和，連續(xù)進行光照和 讀數(shù)讀數(shù), ,直至直至ODOD值接近穩(wěn)定。值接近穩(wěn)定。 v以以ODOD620nm 620nm為縱坐標，時間 為縱坐標，時間(min)(min)為橫坐標作為橫坐標作 圖。圖。 結(jié)果記錄結(jié)果記錄 管號管號 ODOD值值 0min0min光照光照 3min3min 光照光照 6min6min 光照光照 9min9min 2 2 3 3 4 4 5 5 3. 觀察和測量葉綠體觀察和測量葉綠體 v用提取介質(zhì)

15、將用提取介質(zhì)將1 1號和號和2 2號離心管中的沉淀制號離心管中的沉淀制 成懸液，取少量懸液滴在載玻片中央，蓋成懸液，取少量懸液滴在載玻片中央，蓋 上蓋玻片，在顯微鏡下觀察沉淀物。上蓋玻片，在顯微鏡下觀察沉淀物。 v用顯微測微尺測量葉綠體的大小，即長度用顯微測微尺測量葉綠體的大小，即長度 和寬度。和寬度。 目鏡測微尺（目微尺）目鏡測微尺（目微尺） 物鏡測微尺（臺微尺）物鏡測微尺（臺微尺） 測微尺的使用測微尺的使用 v將目鏡自鏡筒中取出，旋下接目透鏡；將目微將目鏡自鏡筒中取出，旋下接目透鏡；將目微 尺有刻度的一面向下放在目鏡中的視場光闌上尺有刻度的一面向下放在目鏡中的視場光闌上； 旋上接目透鏡，將

16、目鏡放回鏡筒上，即可在目旋上接目透鏡，將目鏡放回鏡筒上，即可在目 鏡中看清目微尺；鏡中看清目微尺； v將臺微尺置于載物臺上，使刻度面朝上。將臺微尺置于載物臺上，使刻度面朝上。將臺將臺 微尺移至視野正中按照正確使用低、高倍物鏡微尺移至視野正中按照正確使用低、高倍物鏡 的方法，調(diào)焦至能看清臺微尺上的刻度；的方法，調(diào)焦至能看清臺微尺上的刻度； v轉(zhuǎn)動目鏡和移動臺微尺，轉(zhuǎn)動目鏡和移動臺微尺，使二尺平行使二尺平行，再使二，再使二 尺左邊（或右邊）的一刻線重合，然后自左向尺左邊（或右邊）的一刻線重合，然后自左向 右找出二尺另一次重合的刻線；右找出二尺另一次重合的刻線； 目微尺目微尺 臺微尺臺微尺 每小格為

17、每小格為10um 臺微尺格線臺微尺格線目微尺格線目微尺格線 測微尺的使用測微尺的使用 v分別記錄下二條重合刻線間臺微尺和目分別記錄下二條重合刻線間臺微尺和目 微尺的格數(shù)（微尺的格數(shù)（4040 X X物鏡），按下列公式物鏡），按下列公式 計算目微尺每一小格的實際長度：計算目微尺每一小格的實際長度： 臺微尺的格數(shù)臺微尺的格數(shù) 目微尺每一小格的長度（目微尺每一小格的長度（mm）= = 1010 目微尺的格數(shù)目微尺的格數(shù) 3 3 目微尺每一小格的長度目微尺每一小格的長度 = = 10 = 1.5m10 = 1.5m 2020 測微尺的使用測微尺的使用 v取下臺微尺，換上需要測量的標本。取下臺微尺，換上

18、需要測量的標本。 v通過移動標本或轉(zhuǎn)動目鏡，測出葉綠體所通過移動標本或轉(zhuǎn)動目鏡，測出葉綠體所 占目微尺的格數(shù)，將此結(jié)果乘以每小格所占目微尺的格數(shù)，將此結(jié)果乘以每小格所 代表的長度，即可求出葉綠體的長和寬。代表的長度，即可求出葉綠體的長和寬。 v考慮到測量時各種因素的影響會引起測量考慮到測量時各種因素的影響會引起測量 值發(fā)生誤差，所以一般要測量值發(fā)生誤差，所以一般要測量5 5個以上標個以上標 本，然后取其平均值，這樣可減少誤差。本，然后取其平均值，這樣可減少誤差。 目鏡測微尺的每格長度：目鏡測微尺的每格長度： 測量測量 次數(shù)次數(shù) 長度（目長度（目 鏡測微尺鏡測微尺 的格數(shù)）的格數(shù)） 寬度（目寬度（目 鏡測微尺鏡測微尺 的格數(shù)）的格數(shù)） 長度（長度（umum） 寬度寬度(um) (um) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 平均值平均值 實驗分組和注意事項實驗分組和注意事項 v4 4人為