結(jié)核分枝桿菌抑制吞噬體-溶酶體形成機(jī)制研究進(jìn)展（完整版）

1、結(jié)核分枝桿菌抑制吞噬體-溶酶體形成機(jī)制研究進(jìn)展（全文）結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌傳播所引起的一種全球流行性疾病，是造成人類死亡的十大原因之一。該疾病每年造成140萬(wàn)人死亡，盡管目前有多種抗結(jié)核藥物用于抗結(jié)核治療，結(jié)核病依然對(duì)全球公共衛(wèi)生造成極大威脅。結(jié)核病是一種以空氣傳播為主要傳播途徑的肺部疾病，亦有少數(shù)可傳播到人體其他器官引起肺外結(jié)核。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌通過 阻斷巨噬細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞壞死、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及避免凋亡等途徑來避免機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并誘發(fā)機(jī)體感染1,2,3。正常的吞噬過程可以概括為細(xì)胞外受體與病原體發(fā)生初始相互作用后，信號(hào)通路誘導(dǎo) 肌動(dòng)蛋白絲聚合，使細(xì)胞膜伸長(zhǎng)形成偽足包圍病原體。細(xì)菌等

2、病原微 生物一旦被巨噬細(xì)胞所吞噬，細(xì)胞膜就會(huì)閉合成為一種叫做初期吞噬 體的結(jié)構(gòu)，隨后該結(jié)構(gòu)與溶酶體融合成為晚期核內(nèi)體或吞噬溶酶體。同時(shí)該結(jié)構(gòu)中的數(shù)種溶酶體裂解酶在酸性環(huán)境下（最適pH值為4.5 -5.0）降解病原體。結(jié)核分枝桿菌能通過以下幾種機(jī)制阻止吞噬體成熟。1 抑制吞噬體內(nèi)的酸化結(jié)核分枝桿菌通過胞吞作用或與CR3、Fc YR等特異性受體結(jié)合的方式進(jìn)入巨噬細(xì)胞中，并聚集在吞噬體內(nèi)。巨噬細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，吞噬體未與溶酶體融合，吞噬體內(nèi)呈弱酸性，pH值為6.2左右；當(dāng)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞中將巨噬細(xì)胞激活后，含有結(jié)核分枝桿菌的 吞噬體將會(huì)與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，融合過程中溶酶體中的大 量

3、蛋白水解酶將被激活，這些被激活的蛋白水解酶分解細(xì)菌等大分子物質(zhì)形成的終產(chǎn)物使得吞噬體酸化，其pH值甚至可低至4.5 4。然而事實(shí)上結(jié)核分枝桿菌能在巨噬細(xì)胞中生存、繁殖，且生存的微環(huán)境 pH值較高，這表明結(jié)核分枝桿菌可能抑制吞噬體的酸化5 o研究表明，巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌將LAM和脂多糖等成分分泌到吞噬體中，同時(shí) LAM、脂多糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi)作為脂膜循環(huán)，吞噬 體將會(huì)與胞內(nèi)的某些囊泡發(fā)生融合。在融合過程中，吞噬體與來自囊 泡的膜蛋白結(jié)合，吞噬體對(duì)與之結(jié)合的膜蛋白具有一定選擇性，能選 擇性地抑制其與 H + -ATP酶結(jié)合，導(dǎo)致吞噬體始終缺乏H + -ATP酶參與酸化作用。這樣就使吞噬體酸化過程

4、障礙，吞噬體始終處于一個(gè)較 高的pH值，從而阻止了吞噬性溶酶體的形成。同時(shí)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生并釋放大量的氨，升高溶酶體內(nèi)pH值同時(shí)抑制溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，干擾溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝減少酸性 終產(chǎn)物形成，從而抑制了吞噬體-溶酶體的結(jié)合I o2 結(jié)核分枝桿菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子微環(huán)境影響Rab家族分子表達(dá)研究結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌在真核細(xì)胞內(nèi)通過膜融合調(diào)節(jié)Rab分子功能o Rab家族分子是 RAS蛋白超家族的成員，其通常具有 GTPase折疊和低相對(duì)分子質(zhì)量；它們位于細(xì)胞內(nèi)膜中，與人體膜融 合過程和囊泡運(yùn)輸功能相關(guān)o Rab20依賴的膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路通過增加膜流入吞噬體的數(shù)量，有助于將結(jié)

5、核分枝桿菌維持在膜結(jié)合室中，減少 具有胞質(zhì)通路的吞噬體數(shù)量，從而清除病原菌10 o Rab分子是吞噬體成熟的標(biāo)志物，Rab5出現(xiàn)在吞噬體的早期，Rab9出現(xiàn)在吞噬體的晚期11 o在正常條件下，Rab7的活性形式（aRab7）與位于吞噬體膜中的Rab7 相互作用溶酶體蛋白結(jié)合。 aRab7/Rab7相互作用溶酶體蛋白復(fù)合物促進(jìn)與微管相關(guān)的吞噬體/動(dòng)力蛋白-動(dòng)力蛋白激活蛋白復(fù)合物之間的聯(lián)系。因此，吞噬體沿向心方向移動(dòng)，促進(jìn)吞噬體小管延伸到 晚期內(nèi)吞區(qū)室并誘導(dǎo)吞噬體成熟過程12?；罘种U菌釋放出一種催化Rab7 GTP/GDP 轉(zhuǎn)換的因子，削弱 Rab7與Rab7相互作用溶酶體蛋 白相互作用的能力，

6、從而阻礙感染的吞噬體與溶酶體融合13。同時(shí)研究表明Rab22a是晚期內(nèi)體的主要調(diào)節(jié)因子，感染結(jié)核分枝桿菌的吞 噬體積累Rab22a以阻止Rab7聚集，使吞噬體成熟延遲。3 含色氨酸天冬氨酸的外殼蛋白(tryptopha n-aspartate containing coat protein， TACO)/coronin 1 的潴留保持細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞質(zhì)整合的一個(gè)重要分子是TACO，也稱為p57、coronin 1 或CORO1A 14,15。TACO對(duì)于調(diào)節(jié)多種 F-肌動(dòng)蛋白 依賴性細(xì)胞過程至關(guān)重要16,17 o 90%左右含有活細(xì)菌的吞噬體保留了TACO，但與死菌結(jié)合的巨噬細(xì)胞在吞噬作用后的

7、前2小時(shí)內(nèi)釋放出TACO o因此，TACO在吞噬體膜上的長(zhǎng)時(shí)間潴留可能是活細(xì)菌阻礙 吞噬體成熟的原因。在牛分枝桿菌卡介苗感染模型中發(fā)現(xiàn)，TACO潴留是對(duì)細(xì)菌吞噬產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的反應(yīng)，但是只有當(dāng)細(xì)菌以團(tuán)塊形式吞噬而不是作為 單一生物體時(shí)才能觀察到TACO潴留。此外，TACO定位于吞噬體膜中的 Toll 樣受體 2 型(Toll-like receptor-2 ，TLR-2)，表明 TACO 潴 留是細(xì)菌聚集體阻斷TLR2依賴性抗微生物機(jī)制的結(jié)果18 oTACO另一方面，TACO參與抑制吞噬體成熟并非直接作用：因促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2 +流入增加，激活鈣調(diào)磷酸酶(鈣依賴的磷酸酶)，后者直接阻止吞噬體-

8、溶酶體融合19 o4 ESX-1系統(tǒng)的蛋白質(zhì)阻斷吞噬體-溶酶體融合分枝桿菌屬型分泌系統(tǒng)即ESAT-6分泌系統(tǒng)-1(ESX-1)，由RD-1及周圍區(qū)域基因編碼，該系統(tǒng)釋放的抗原有以下4種：具有高度免疫原性的 CFP-10、ESAT-6 以及 MM1553 和Mh3881c2種新蛋白研究證明，以上抗原在抑制吞噬體成熟的過程中是不可或缺的。其中CFP-10、ESAT-6 和 Mh3881c 以抗原依賴的方式分泌，特別是Mh3881c 抗原，在其羧基末端斷裂后，會(huì)導(dǎo)致吞噬體成熟停滯。而缺乏該系統(tǒng)的分枝桿菌在感染24、72 h后抑制吞噬體-溶酶體融合的效率較低，在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的效率也較低。ESX-1的

9、吞噬體干擾作用為結(jié)核分枝桿菌的胞外DNA等物質(zhì)提供了細(xì)胞質(zhì)通路，細(xì)胞外DNA 作為一種特異性激活配體，直接識(shí)別結(jié)核分枝桿菌 DNA并激活STING的胞質(zhì)DNA傳感器環(huán)狀 GMP-AMP 合成酶20，作用于STING-TBK1-IRF3 信號(hào)軸，誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生 21。有趣的是，缺乏IRF3的小鼠對(duì)長(zhǎng)期結(jié)核分枝桿菌感染具有耐藥性22。實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，吞噬體破壞將導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌DNA的胞質(zhì)定位觸發(fā)了負(fù)責(zé)發(fā)病機(jī)制的STING-TBK1-IRF3-I型干擾素通路 創(chuàng)。綜上, ESX-1系統(tǒng)能通過胞質(zhì)結(jié)核分枝桿菌DNA誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生破壞吞噬體而阻斷吞噬體-溶酶體融合。5 自噬參與延遲吞噬體成熟自噬是

10、細(xì)胞器和細(xì)胞溶質(zhì)分子在自噬體囊泡內(nèi)被識(shí)別和降解的過 程。自噬和吞噬作用具有共同的特征，研究表明自噬可能調(diào)節(jié)吞噬作用列。在自噬中，吞噬細(xì)胞的雙膜結(jié)構(gòu)將細(xì)胞質(zhì)中大分子成分包圍，演變成一個(gè)自噬體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體12 o這個(gè)過程涉及與自噬有關(guān)的家族蛋白(Atg) 25，它以復(fù)雜的交互級(jí)聯(lián)和多種功能運(yùn)作。自噬包括參與囊泡形成的4種蛋白質(zhì)：Atg13、FIP2000、Atg101和 Atg1/ULK1 復(fù)合物(ULK1/2)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白非依賴性途徑和活化蛋白激酶靶點(diǎn)等途徑調(diào)控自噬的起始。川型磷脂酰肌醇3-激酶Vps34、p150、Atg14 和Beclin

11、1等組成的空泡蛋白分選復(fù)合體影響吞噬體的形成。吞噬體膜的延長(zhǎng)首先需要Atg12與Atg5結(jié)合，并與Atg16L形成復(fù)合物26 o然后與微管相連接的LC3分裂，產(chǎn)生胞質(zhì)LC3-i(Atg8)，通過與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-ii，導(dǎo)致LC3-ii附著在隔離膜上27 o關(guān)閉隔離膜使得自噬體形成過程得以完成，隔離膜與溶酶體融合形成自溶酶體并加工和消化細(xì)胞內(nèi)病原體。結(jié)核分枝桿菌可能通過阻止自噬體發(fā)展為自噬溶酶體或抑制其在自噬體內(nèi)的降解等機(jī)制逃避自噬過程。磷脂酰肌醇3-激酶依賴性結(jié)合PI3P，PI3P參與自噬體成熟。因此，結(jié)核分枝桿菌的糖基化磷脂酰肌 醇充當(dāng)了細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸途徑的抑制劑，這對(duì)結(jié)核分枝桿菌抑

12、制自噬體成 熟是不可或缺的。另一方面，LC3 相關(guān)吞噬作用(LC3-associated phagocytosis ，LAP)在對(duì)抗多種細(xì)胞內(nèi)病原體的感染中發(fā)揮重要作用。LAP包括傳統(tǒng)受體和自噬受體，但作為自噬作用的觸發(fā)因子的確切機(jī)制目前仍不清楚。TLR和c型凝集素等模式識(shí)別受體在啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān) 鍵作用，該信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致吞噬體內(nèi)LC3結(jié)合，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的合成。研究表明，結(jié)核分枝桿菌可以防止LAPosome 融合，促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的存活和增殖。只有部分吞噬體與 LC3有關(guān)28。研究表明，吞噬溶酶體囊泡中發(fā) 現(xiàn)的beclin和LC3等分子在小鼠巨噬細(xì)胞吞噬體中的易位與雙膜囊 泡無關(guān)。該

13、機(jī)制由識(shí)別受體如Fc、TLR、磷脂酰絲氨酸受體TIM4或B-葡聚糖Dectin-1 受體啟動(dòng)；一旦發(fā)生受體識(shí)別，病原體就被吞噬并 隔離在一個(gè)單膜吞噬體內(nèi)，此時(shí)，在LAP下，磷脂酰肌醇-3-磷酸生成的川類 pi3-激酶復(fù)合物特異性結(jié)合到該單膜吞噬體腔室內(nèi)，最后 LC3- U介導(dǎo)吞噬體與溶酶體快速融合29。與傳統(tǒng)的吞噬作用不同，在LC3介導(dǎo)的吞噬作用中，細(xì)胞類型和病原體將影響抗原表達(dá)。例如，在小鼠巨噬細(xì)胞中，抗原處理速度加快，而在人類細(xì)胞中，吞噬體的成熟似乎有所延遲30。有些微生物已具有完全避免吞噬體作用的功能，在這些區(qū)室內(nèi)或在宿主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi) 繁殖。綜上所述，結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)病原體，它具有多種機(jī)制來逃避宿主的免疫反應(yīng)。抑制吞噬體成熟、阻止吞噬體溶酶體形成作為 機(jī)制之一將直接影響抗原加工和呈遞，導(dǎo)致其他細(xì)胞群的無效激活， 從而使結(jié)核分