基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)課件

1、基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1 前言前言 基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以 及所有加工過(guò)程。及所有加工過(guò)程。 基因工程主要目標(biāo)之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的基因工程主要目標(biāo)之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的 大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物即實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)。即實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)。 基因高效表達(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表基因高效表達(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表 達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因 表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的

2、表達(dá) 產(chǎn)物。產(chǎn)物。 第三章第三章 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)真核基因在大腸桿菌中的表達(dá) 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2 最佳的基因表達(dá)體系：最佳的基因表達(dá)體系： 目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高; 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定; 生物活性高生物活性高; 表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。 第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3 宿主細(xì)胞的選擇宿主細(xì)胞的選擇 適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞的要求適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞的要求: : 1 1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞；、容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 2 2、能利用易得廉價(jià)原料；、能利用易得廉價(jià)

3、原料； 3 3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 4 4、發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；、發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)； 5 5、容易進(jìn)行代謝調(diào)控；、容易進(jìn)行代謝調(diào)控； 6 6、容易進(jìn)行、容易進(jìn)行DNADNA重組技術(shù)操作；重組技術(shù)操作； 7 7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高， 8 8、產(chǎn)物容易提取純化。、產(chǎn)物容易提取純化。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)4 宿主細(xì)胞分為兩大類(lèi)：宿主細(xì)胞分為兩大類(lèi)： 1 1、原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、 鏈霉菌等；鏈霉菌等； 2 2、真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真

4、菌、哺乳動(dòng)物、真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞等。細(xì)胞等。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)5 一、真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系一、真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系 目前，已被用于表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)系目前，已被用于表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)系 統(tǒng)有細(xì)菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆統(tǒng)有細(xì)菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆 蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。但比較而言，大蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。但比較而言，大 腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)6 大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)越性大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)越性： 1. 1. 對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)（完成基因組對(duì)大

5、腸桿菌的背景知識(shí)（完成基因組 全測(cè)序哦），特別是基因表達(dá)調(diào)控的分全測(cè)序哦），特別是基因表達(dá)調(diào)控的分 子機(jī)理有（乳糖操縱子）深刻的了解；子機(jī)理有（乳糖操縱子）深刻的了解； 2. 2. 是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁 有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載 體；體； 3. 3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿許多克隆的真核基因都可以在大腸桿 菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)； 4. 4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本 低廉，易用于批量生產(chǎn)。低廉，易用于批量生產(chǎn)。 基因

6、工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)7 大腸桿菌中表達(dá)體系的不足大腸桿菌中表達(dá)體系的不足： 1. 1. 真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間 存在著很大的差別。存在著很大的差別。 2. 2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。 細(xì)菌的細(xì)菌的RNARNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟聚合酶不能識(shí)別真核的啟 動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn) 錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。 3. 3. 真核基因真核基因mRNAmRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的 有所差異，影響真核基因有所差異，影響真核基因mR

7、NAmRNA穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)8 4. 4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng) 過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組 裝），而大多數(shù)的這類(lèi)修飾作用在細(xì)裝），而大多數(shù)的這類(lèi)修飾作用在細(xì) 菌細(xì)胞中并不存在；菌細(xì)胞中并不存在； 5. 5. 細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核 基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們 降解掉。降解掉。 6. 6. 大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)存在各種內(nèi)毒素。大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)存在各種內(nèi)毒素。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)9 克隆基因正確表達(dá)的基本條件

8、克隆基因正確表達(dá)的基本條件 最基本條件最基本條件：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄 和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯 后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有 關(guān)。關(guān)。啟動(dòng)子啟動(dòng)子、終止子終止子以及正確以及正確讀碼框讀碼框 （ORF）。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)10 重要條件重要條件： 編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn) 定性。定性。 具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)； 具有強(qiáng)啟動(dòng)子；具有強(qiáng)啟動(dòng)子； 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)11 二、大腸桿菌的表達(dá)載體二、大腸桿菌的表達(dá)載體 1、大腸桿

9、菌表達(dá)載體的基本成分、大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分 TTGACA。TATAAT -35 17 -10 PR TAAGGAGG（N）8 ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%） 編碼序列編碼序列 TAA TGA TAG TTtetrOri RBS 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)12 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 終止子終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子密碼子 質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù) 轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平 翻譯水平翻譯水平 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)13 （1）啟動(dòng)子）啟動(dòng)子 要使克隆的外源基因高水平表達(dá)的最佳要使克隆的外源基因高水平表達(dá)

10、的最佳 啟動(dòng)子，必須具備以下幾個(gè)條件：?jiǎn)?dòng)子，必須具備以下幾個(gè)條件： 1）必須是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。）必須是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。 2）這個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)能呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)表達(dá)）這個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)能呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)表達(dá) 水平。使用高度抑制型的啟動(dòng)子是一種極為水平。使用高度抑制型的啟動(dòng)子是一種極為 重要的條件。重要的條件。 3）這種啟動(dòng)子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的）這種啟動(dòng)子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的 方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)，如物理方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)，如物理 （如熱）和化學(xué)（如（如熱）和化學(xué)（如IPTG）誘導(dǎo)）誘導(dǎo) 。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)14 （2）轉(zhuǎn)錄終止子）轉(zhuǎn)錄終止子 * 當(dāng)上游啟動(dòng)子

11、驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄作用通讀過(guò)下游啟動(dòng)當(dāng)上游啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄作用通讀過(guò)下游啟動(dòng) 子時(shí)，便會(huì)使該啟動(dòng)子的功能受到抑制。子時(shí)，便會(huì)使該啟動(dòng)子的功能受到抑制。啟動(dòng)啟動(dòng) 子封堵作用子封堵作用 * 在克隆基因編碼區(qū)的在克隆基因編碼區(qū)的3-末端接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)末端接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn) 錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀。錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀。 此外，轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)此外，轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)分子的穩(wěn) 定性，從而大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。定性，從而大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)15 （3）翻譯起始序列）翻譯起始序列 mRNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本5端的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征（核糖端的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征

12、（核糖 體結(jié)合位點(diǎn)，體結(jié)合位點(diǎn)，RBS），是決定），是決定mRNA翻譯效率翻譯效率 的主要因素。的主要因素。 至今，仍未鑒定出通用有效的翻譯起始序列的保至今，仍未鑒定出通用有效的翻譯起始序列的保 守結(jié)構(gòu)，但卻已經(jīng)發(fā)展出許多種可以用來(lái)有效地降守結(jié)構(gòu)，但卻已經(jīng)發(fā)展出許多種可以用來(lái)有效地降 低在低在mRNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本5-末端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)方法，末端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)方法， 從而提高克隆的外源基因的表達(dá)效率。從而提高克隆的外源基因的表達(dá)效率。 例如例如: 在在RBS序列中增加序列中增加AT含量；含量；誘發(fā)特異堿基誘發(fā)特異堿基 發(fā)生定點(diǎn)突變；發(fā)生定點(diǎn)突變；以及使用翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基以及使用翻譯

13、偶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基 因的表達(dá)。因的表達(dá)。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)16 （4）翻譯增強(qiáng)子）翻譯增強(qiáng)子 大腸桿菌和噬菌體基因中存在一些特殊的序列元大腸桿菌和噬菌體基因中存在一些特殊的序列元 件，能夠顯著地增強(qiáng)異源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的件，能夠顯著地增強(qiáng)異源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的 表達(dá)效率。這類(lèi)特殊序列元件特稱(chēng)為表達(dá)效率。這類(lèi)特殊序列元件特稱(chēng)為翻譯增強(qiáng)子翻譯增強(qiáng)子。 例如：例如：T7噬菌體基因噬菌體基因10的前導(dǎo)序列（的前導(dǎo)序列（g10-L）、）、 以大腸桿菌以大腸桿菌atpE基因?yàn)榇淼囊恍┗驗(yàn)榇淼囊恍﹎RNA分子分子5- UTR中的富含中的富含U的區(qū)段，以及直接位于的區(qū)段，以及直接位于T

14、7基因起基因起 始密碼子下游的始密碼子下游的“下游元件下游元件”等。等。 分子機(jī)制不明。分子機(jī)制不明。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)17 （5）翻譯終止密碼）翻譯終止密碼 對(duì)對(duì)mRNA翻譯終止而言，一個(gè)必不可少的條翻譯終止而言，一個(gè)必不可少的條 件是必須存在終止密碼子。因此，在構(gòu)建大腸桿件是必須存在終止密碼子。因此，在構(gòu)建大腸桿 菌表達(dá)載體時(shí)，通常安置上全部的三個(gè)終止密碼菌表達(dá)載體時(shí)，通常安置上全部的三個(gè)終止密碼 子，以便阻止發(fā)生核糖體的子，以便阻止發(fā)生核糖體的“跳躍跳躍”現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 已知大腸桿菌格外偏愛(ài)使用終止密碼已知大腸桿菌格外偏愛(ài)使用終止密碼UAA，尤其，尤其 是當(dāng)連上一個(gè)是當(dāng)連上一個(gè)U

15、而形成而形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，四聯(lián)核苷酸的情況下， 翻譯終止的效率進(jìn)一步提高。翻譯終止的效率進(jìn)一步提高。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)18 2、常用的大腸桿菌表達(dá)載體、常用的大腸桿菌表達(dá)載體 迄今為止，基因工程學(xué)家已經(jīng)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了迄今為止，基因工程學(xué)家已經(jīng)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了 一系列的以原核啟動(dòng)子取代真核啟動(dòng)子的質(zhì)粒一系列的以原核啟動(dòng)子取代真核啟動(dòng)子的質(zhì)粒 表達(dá)載體系統(tǒng)。表達(dá)載體系統(tǒng)。 最常用的：最常用的： 噬菌體的噬菌體的PL啟動(dòng)子，大腸桿啟動(dòng)子，大腸桿 菌的菌的Lac啟動(dòng)子、啟動(dòng)子、Trp啟動(dòng)子，以及啟動(dòng)子，以及pBR322 質(zhì)粒的質(zhì)粒的 -內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子等一批強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子等一

16、批強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu) 成的。成的。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)19 三、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法三、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法 1、Cohen轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法 1972年年Cohen改進(jìn)而成，是目前最常用的方法。改進(jìn)而成，是目前最常用的方法。 操作步驟：操作步驟： （1）將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮培養(yǎng)物（）將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮培養(yǎng)物（0.5-0.6OD)，于，于4, 4000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分鐘離心分鐘離心10分鐘，回收細(xì)菌細(xì)胞；分鐘，回收細(xì)菌細(xì)胞； （2）將細(xì)胞用）將細(xì)胞用0的的0.1mol/L CaCl2溶液重新懸浮細(xì)胞沉淀，溶液重新懸浮細(xì)胞沉淀， 以誘導(dǎo)細(xì)胞感受態(tài)產(chǎn)生；以誘導(dǎo)細(xì)胞感受態(tài)產(chǎn)生； （3）加入適量的）加入適量的DN

17、A后，于后，于42 熱處理熱處理90秒；秒； （4）將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，是細(xì)胞冷卻）將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，是細(xì)胞冷卻1-2分鐘，分鐘， 加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在37 培養(yǎng)培養(yǎng)45分鐘，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表分鐘，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表 達(dá)質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因；達(dá)質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因； （5）選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化體。）選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化體。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)20 2、Hanahan轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法 1983年由年由Hanahan設(shè)計(jì)。它的特點(diǎn)是在感受態(tài)細(xì)胞設(shè)計(jì)。它的特點(diǎn)是在感受態(tài)細(xì)胞 的誘導(dǎo)方面，除了用的誘導(dǎo)方面，除了用CaCl2和和MnCl2等二價(jià)離子按一等二價(jià)離子按

18、一 定形式組合方式處理細(xì)胞外，還利用二甲亞砜定形式組合方式處理細(xì)胞外，還利用二甲亞砜 （DMSO）、二硫蘇糖醇（）、二硫蘇糖醇（DTT）和氯化六氨合高鈷）和氯化六氨合高鈷 等進(jìn)一步處理細(xì)胞，其它方面與上法相同。等進(jìn)一步處理細(xì)胞，其它方面與上法相同。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是形成高頻率的感受態(tài)細(xì)胞，可使這種方法的優(yōu)點(diǎn)是形成高頻率的感受態(tài)細(xì)胞，可使 轉(zhuǎn)化效率提高轉(zhuǎn)化效率提高100-1000倍，而且對(duì)大小質(zhì)粒都能進(jìn)行倍，而且對(duì)大小質(zhì)粒都能進(jìn)行 有效的轉(zhuǎn)化。有效的轉(zhuǎn)化。 值得注意的是：值得注意的是：此法要求的條件高，對(duì)外界污染此法要求的條件高，對(duì)外界污染 物極其敏感，對(duì)各方面的要求很高。因此，只在極物極其敏感

19、，對(duì)各方面的要求很高。因此，只在極 少數(shù)情況下才使用此法。少數(shù)情況下才使用此法。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)21 3、電轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)22 電轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖的電轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖的 時(shí)間和時(shí)間和DNA濃度等參數(shù)的影響。濃度等參數(shù)的影響。 轉(zhuǎn)化效率：轉(zhuǎn)化效率：108-109轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化體/g DNA。 當(dāng)電壓和電脈沖時(shí)間的一定方式組合而導(dǎo)致當(dāng)電壓和電脈沖時(shí)間的一定方式組合而導(dǎo)致 50%-70%細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)23 制備用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞相對(duì)容易。制備用于電轉(zhuǎn)

20、化的感受態(tài)細(xì)胞相對(duì)容易。 當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，冷卻、離心，然后用當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，冷卻、離心，然后用 冷卻的去離子水反復(fù)清洗，最后用冷卻的去離子水反復(fù)清洗，最后用10%甘油重甘油重 懸細(xì)胞，使其濃度為懸細(xì)胞，使其濃度為3 1010細(xì)胞細(xì)胞/毫升，在干冰毫升，在干冰 或液氮中速凍后置于或液氮中速凍后置于-70 貯存。貯存。 轉(zhuǎn)化必須在轉(zhuǎn)化必須在0-4 下進(jìn)行。下進(jìn)行。 如果在室溫下操作，轉(zhuǎn)化效率會(huì)大大降低。如果在室溫下操作，轉(zhuǎn)化效率會(huì)大大降低。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)24 四、克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)四、克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá) 1、外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)

21、部位、外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位 * * 克隆在大腸桿菌細(xì)胞中的外源基因的表達(dá)部位：克隆在大腸桿菌細(xì)胞中的外源基因的表達(dá)部位： 細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞周質(zhì)；分泌到細(xì)胞外細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞周質(zhì)；分泌到細(xì)胞外 這三種表達(dá)部位各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，而且對(duì)這三種表達(dá)部位各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，而且對(duì) 表達(dá)量和表達(dá)產(chǎn)物的制備有很大關(guān)系。表達(dá)量和表達(dá)產(chǎn)物的制備有很大關(guān)系。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)25 在大腸桿菌細(xì)胞不同部位表達(dá)外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)在大腸桿菌細(xì)胞不同部位表達(dá)外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn) 表達(dá)部位表達(dá)部位 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì) 1、 形成包涵體形成包涵體 1、蛋白質(zhì)折疊了可能無(wú)法恢復(fù)起生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)折

22、疊了可能無(wú)法恢復(fù)起生物學(xué)活性 （1）蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離）蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離 2、還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成、還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成 （2）蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解）蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解 （3）蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，不會(huì)使細(xì)胞受傷害）蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，不會(huì)使細(xì)胞受傷害 2、表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單、表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單 周質(zhì)周質(zhì) 1、周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類(lèi)較少，純化簡(jiǎn)單、周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類(lèi)較少，純化簡(jiǎn)單 1、信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 2、蛋白質(zhì)酶解程度不嚴(yán)重、蛋白質(zhì)酶解程度不嚴(yán)重 2、有可能形成包涵體、有可

23、能形成包涵體 3、促進(jìn)二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊、促進(jìn)二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊 4、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)真實(shí)末端結(jié)構(gòu)真實(shí) 胞外胞外 1、蛋白質(zhì)的酶解作用程度很底、蛋白質(zhì)的酶解作用程度很底 1、在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白通、在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白通 2、目標(biāo)蛋白的純化容易，由于分泌到胞外的、目標(biāo)蛋白的純化容易，由于分泌到胞外的 常不會(huì)分泌到胞外常不會(huì)分泌到胞外 蛋白種類(lèi)少蛋白種類(lèi)少 2、由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)相當(dāng)于稀釋?zhuān)?、由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)相當(dāng)于稀釋?zhuān)?3、增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用、增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用 此目標(biāo)蛋白的得率較低此目標(biāo)蛋白的得率較低 4、蛋白質(zhì)、蛋

24、白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)真實(shí)末端結(jié)構(gòu)真實(shí) 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)26 * Talmadge和和Gilbert（1982）將外源蛋白質(zhì)在）將外源蛋白質(zhì)在 大腸桿菌細(xì)胞中的不同部位表達(dá)。結(jié)果：大腸桿菌細(xì)胞中的不同部位表達(dá)。結(jié)果： 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的大鼠胰島素原的半衰期僅有細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的大鼠胰島素原的半衰期僅有 2min左右，而表達(dá)在大腸桿菌周質(zhì)中大鼠胰島素左右，而表達(dá)在大腸桿菌周質(zhì)中大鼠胰島素 原的半衰期延長(zhǎng)了原的半衰期延長(zhǎng)了10倍以上。（倍以上。（原因：細(xì)胞周質(zhì)原因：細(xì)胞周質(zhì) 中蛋白酶的含量低中蛋白酶的含量低） 到目前為止，這方面的技術(shù)還很不成熟，外泌率低。到目前為止，這方面的技術(shù)還很不成熟，外泌率低。

25、 * 使克隆基因表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到胞外的使克隆基因表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到胞外的 培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的最佳途徑。培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的最佳途徑。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)27 2、外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性、外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性 當(dāng)一種克隆的外源基因在大腸桿菌中不能實(shí)當(dāng)一種克隆的外源基因在大腸桿菌中不能實(shí) 現(xiàn)其功能表達(dá)時(shí)，我們往往會(huì)認(rèn)為這是由于轉(zhuǎn)現(xiàn)其功能表達(dá)時(shí)，我們往往會(huì)認(rèn)為這是由于轉(zhuǎn) 錄或翻譯過(guò)程發(fā)生了問(wèn)題。其實(shí)在早期的研究錄或翻譯過(guò)程發(fā)生了問(wèn)題。其實(shí)在早期的研究 中就有許多實(shí)驗(yàn)表明，克隆的外源基因即便是中就有許多實(shí)驗(yàn)表明，克隆的外源基因即便是 在

26、大腸桿菌中得到了表達(dá)，也并不一定就意味在大腸桿菌中得到了表達(dá)，也并不一定就意味 著它的多肽產(chǎn)物是穩(wěn)定的。著它的多肽產(chǎn)物是穩(wěn)定的。 影響因素包括：影響因素包括： 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)28 （1）蛋白質(zhì)的降解作用）蛋白質(zhì)的降解作用 在大腸桿菌的細(xì)胞中，含有大量的各種類(lèi)型的蛋白酶，在大腸桿菌的細(xì)胞中，含有大量的各種類(lèi)型的蛋白酶， 廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)、內(nèi)外膜等部位，參與許多方廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)、內(nèi)外膜等部位，參與許多方 面的代謝活動(dòng)，包括選擇性地酶解異常的蛋白質(zhì)。面的代謝活動(dòng)，包括選擇性地酶解異常的蛋白質(zhì)。 已知有許多因素，如已知有許多因素，如不完全多肽不完全多肽、氨基酸取代突變氨基酸取

27、代突變、 多酶復(fù)合體亞基的超量合成多酶復(fù)合體亞基的超量合成、氧化作用或游離自由基的氧化作用或游離自由基的 作用而造成的翻譯后損傷作用而造成的翻譯后損傷，以及以及基因工程技術(shù)的效應(yīng)基因工程技術(shù)的效應(yīng)等，等， 都可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子受損或構(gòu)型變化，形成異常蛋白都可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子受損或構(gòu)型變化，形成異常蛋白 質(zhì)。質(zhì)。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)29 為了避免在大腸桿菌中發(fā)生外源蛋白質(zhì)的降解，為了避免在大腸桿菌中發(fā)生外源蛋白質(zhì)的降解， 或?qū)⒋私到庾饔每刂圃谧畹退剑厌槍?duì)性發(fā)展出或?qū)⒋私到庾饔每刂圃谧畹退?，已針?duì)性發(fā)展出 了許多種不同的技術(shù)方案。主要有：了許多種不同的技術(shù)方案。主要有： 1）讓外源蛋

28、白質(zhì)定位在周質(zhì)或胞外表達(dá)；）讓外源蛋白質(zhì)定位在周質(zhì)或胞外表達(dá)； 2）使用蛋白酶缺陷的大腸桿菌做表達(dá)菌株；）使用蛋白酶缺陷的大腸桿菌做表達(dá)菌株； 3）將轉(zhuǎn)化有克隆基因的寄主菌株放置在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)；）將轉(zhuǎn)化有克隆基因的寄主菌株放置在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)； 4）使目標(biāo)基因以融合蛋白形式表達(dá)；）使目標(biāo)基因以融合蛋白形式表達(dá)； 5）置換多肽鏈中某些氨基酸，消除蛋白酶切點(diǎn)；）置換多肽鏈中某些氨基酸，消除蛋白酶切點(diǎn)； 6）對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)作疏水性修飾。）對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)作疏水性修飾。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)30 （2）結(jié)構(gòu)決定因子與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性）結(jié)構(gòu)決定因子與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)的確切的分子結(jié)構(gòu)特征

29、？與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)的確切的分子結(jié)構(gòu)特征？ 不清楚不清楚 但已經(jīng)明確了若干種影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的結(jié)但已經(jīng)明確了若干種影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的結(jié) 構(gòu)決定因子。構(gòu)決定因子。 其中最重要的：其中最重要的：N-端氨基酸性質(zhì)。端氨基酸性質(zhì)。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)31 N-端氨基酸性質(zhì)端氨基酸性質(zhì) “N-端法則端法則”: 在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)新陳代謝的在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)新陳代謝的 穩(wěn)定性，主要取決于穩(wěn)定性，主要取決于N-端氨基酸的性質(zhì)。端氨基酸的性質(zhì)。 在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，若蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，若蛋白質(zhì)N-端為端為Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和和Trp等殘基，則其穩(wěn)定等殘基，則其穩(wěn)定 性較差；

30、而同樣條件下，若性較差；而同樣條件下，若N-端為除了前述端為除了前述6 種氨基酸之外的其它任何一種氨基酸殘基時(shí)，種氨基酸之外的其它任何一種氨基酸殘基時(shí)， 其穩(wěn)定性則大大提高。其穩(wěn)定性則大大提高。 重組操作時(shí)，重組操作時(shí)， N-端增加一個(gè)增加穩(wěn)定性的氨基端增加一個(gè)增加穩(wěn)定性的氨基 酸酸 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)32 （3）表達(dá)天然的蛋白質(zhì)）表達(dá)天然的蛋白質(zhì) 以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌細(xì)胞中以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌細(xì)胞中 表達(dá)外源真核基因具有許多方面的優(yōu)越性。表達(dá)外源真核基因具有許多方面的優(yōu)越性。 例如，產(chǎn)物比較穩(wěn)定，可以免受胞內(nèi)蛋白酶例如，產(chǎn)物比較穩(wěn)定，可以免受胞內(nèi)蛋白酶 的降解作用

31、，可以獲得較高的產(chǎn)率。的降解作用，可以獲得較高的產(chǎn)率。 Tacon等人在等人在80年代初期，使用大腸桿菌的年代初期，使用大腸桿菌的 trp啟動(dòng)子和與之相連的啟動(dòng)子和與之相連的SD序列，構(gòu)建了兩種序列，構(gòu)建了兩種 有利于表達(dá)天然蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。有利于表達(dá)天然蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。pWT551 和和pWT571 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)33 （4）分子伴侶）分子伴侶（molecular chaperone）穩(wěn)定作用穩(wěn)定作用 分子伴侶：分子伴侶：指一類(lèi)多功能蛋白質(zhì)，它能夠通過(guò)阻指一類(lèi)多功能蛋白質(zhì)，它能夠通過(guò)阻 止諸如聚合作用這樣的副反應(yīng)，來(lái)促使其它蛋白止諸如聚合作用這樣的副反應(yīng)，來(lái)促使其它蛋白 質(zhì)按

32、正確的方式折疊，而其本身卻不是最終形成質(zhì)按正確的方式折疊，而其本身卻不是最終形成 的功能蛋白質(zhì)的組成成分。的功能蛋白質(zhì)的組成成分。 通過(guò)分子伴侶與克隆的外源基因在大腸桿菌通過(guò)分子伴侶與克隆的外源基因在大腸桿菌 寄主細(xì)胞中共表達(dá)是增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性、寄主細(xì)胞中共表達(dá)是增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性、 實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)的有效方法。實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)的有效方法。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)34 （5）大腸桿菌突變體菌株與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性）大腸桿菌突變體菌株與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 通過(guò)產(chǎn)生融合蛋白途徑增加外源多肽穩(wěn)定性的通過(guò)產(chǎn)生融合蛋白途徑增加外源多肽穩(wěn)定性的 方法，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，但此法的一個(gè)突出缺方法，已有許多文獻(xiàn)報(bào)

33、道，但此法的一個(gè)突出缺 點(diǎn)是所產(chǎn)生的融合蛋白并不一定都能夠在體外將點(diǎn)是所產(chǎn)生的融合蛋白并不一定都能夠在體外將 天然蛋白質(zhì)完整無(wú)損地切割下來(lái)。天然蛋白質(zhì)完整無(wú)損地切割下來(lái)。 一種相當(dāng)有效的變通辦法是，使用胞內(nèi)蛋白酶一種相當(dāng)有效的變通辦法是，使用胞內(nèi)蛋白酶 含量很低的大腸桿菌突變株，作為表達(dá)外源蛋白含量很低的大腸桿菌突變株，作為表達(dá)外源蛋白 質(zhì)的寄主細(xì)菌。其中用得最多的是質(zhì)的寄主細(xì)菌。其中用得最多的是缺失缺失lon蛋白蛋白 酶酶的大腸桿菌突變株。的大腸桿菌突變株。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)35 五、影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素五、影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素 啟動(dòng)子的強(qiáng)度、啟

34、動(dòng)子的強(qiáng)度、DNA轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子 的選擇、的選擇、mRNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、 質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞生質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞生 理特征理特征等都會(huì)不同程度地影響克隆基因的表達(dá)等都會(huì)不同程度地影響克隆基因的表達(dá) 效率。效率。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)36 1、啟動(dòng)子對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響、啟動(dòng)子對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響 (1) 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 大腸桿菌啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)保守序大腸桿菌啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)保守序 列，即列，即-35區(qū)（區(qū)（5-TTGAC

35、A）和）和-10區(qū)（區(qū)（5- TATAAT），后者又叫），后者又叫Pribnow盒。盒。 應(yīng)用半乳糖激酶系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明：?jiǎn)?dòng)子應(yīng)用半乳糖激酶系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明：?jiǎn)?dòng)子 序列與上述保守序列之間相似程度越高，其表序列與上述保守序列之間相似程度越高，其表 達(dá)能力也就越強(qiáng)，兩者呈正比關(guān)系。達(dá)能力也就越強(qiáng)，兩者呈正比關(guān)系。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)37 此外，此外，兩個(gè)保守序列之間的距離也影響兩個(gè)保守序列之間的距離也影響 克隆基因的表達(dá)效率，這段間隔距離越接克隆基因的表達(dá)效率，這段間隔距離越接 近于近于17個(gè)堿基個(gè)堿基，啟動(dòng)子的活性就越強(qiáng)。，啟動(dòng)子的活性就越強(qiáng)。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)38 （2）

36、啟動(dòng)子與克隆基因的間隔距離對(duì)表）啟動(dòng)子與克隆基因的間隔距離對(duì)表 達(dá)效率的影響達(dá)效率的影響 Roberts等用等用 plac5.1 DNA的含有的含有l(wèi)ac啟動(dòng)子和啟動(dòng)子和 SD序列與序列與 cro基因表達(dá)序列構(gòu)建了不同間隔距離基因表達(dá)序列構(gòu)建了不同間隔距離 的重組質(zhì)粒載體。從中挑選了的重組質(zhì)粒載體。從中挑選了9種不同的重組質(zhì)粒種不同的重組質(zhì)粒 載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，然后測(cè)定各種克載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，然后測(cè)定各種克 隆所產(chǎn)生的隆所產(chǎn)生的cro蛋白質(zhì)含量，同時(shí)也對(duì)每種質(zhì)粒中蛋白質(zhì)含量，同時(shí)也對(duì)每種質(zhì)粒中 的連接的連接lac-cro基因的結(jié)合區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定?；虻慕Y(jié)合區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定。

37、基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)39 ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATG TGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATAC BamHI從從lac啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄 Cro轉(zhuǎn)譯起始密碼轉(zhuǎn)譯起始密碼 SDlac pTR213 pTR199 pTR214 pTR188 pTR194 pTR210 pTR182 pTR190 1.63 0.085 1.00 0.6

38、5 0.51 0.85 0.0012 0.0006 * 圖中示出圖中示出 pTR161質(zhì)粒的從質(zhì)粒的從lac啟動(dòng)子到啟動(dòng)子到cro基因轉(zhuǎn)譯起點(diǎn)間的堿基序列。還基因轉(zhuǎn)譯起點(diǎn)間的堿基序列。還 示出示出pTR161質(zhì)粒的質(zhì)粒的8種派生質(zhì)粒的序列缺失程度。數(shù)字表示相對(duì)于種派生質(zhì)粒的序列缺失程度。數(shù)字表示相對(duì)于pTR161的蛋的蛋 白質(zhì)合成數(shù)量。白質(zhì)合成數(shù)量。 結(jié)果表明：結(jié)果表明：攜帶不同重組體質(zhì)粒的菌株所合成的攜帶不同重組體質(zhì)粒的菌株所合成的cro蛋白質(zhì)數(shù)量，是同蛋白質(zhì)數(shù)量，是同lac-cro基基 因的結(jié)合區(qū)序列相關(guān)聯(lián)，但這種相關(guān)性并沒(méi)有一定的規(guī)律；因的結(jié)合區(qū)序列相關(guān)聯(lián)，但這種相關(guān)性并沒(méi)有一定的規(guī)律；

39、但但 5端與端與SD序列之序列之 間的距離應(yīng)間的距離應(yīng) 15bp。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)40 （3）提高克隆基因表達(dá)效率的實(shí)驗(yàn)方案）提高克隆基因表達(dá)效率的實(shí)驗(yàn)方案 BamHI EcoRI EcoRI酶切酶切 BamHI 具具EcoRI末端的克隆片段末端的克隆片段 BamHI T4T4連接酶連接酶 EcoRI EcoRI BamHI酶切酶切S1核酸酶消化核酸酶消化 通過(guò)控制消化時(shí)間通過(guò)控制消化時(shí)間 制造不同缺失大小制造不同缺失大小 Lac啟動(dòng)子片段啟動(dòng)子片段 克隆基因克隆基因 T4連接酶連接酶 EcoRI EcoRI Lac啟動(dòng)子片段啟動(dòng)子片段 EcoRI EcoRI EcoRI EcoR

40、I 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)41 2 2、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性與基因表達(dá)效率、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性與基因表達(dá)效率 （1 1）質(zhì)粒的拷貝數(shù)）質(zhì)粒的拷貝數(shù) 由于細(xì)胞中的核糖體數(shù)量與任何一種由于細(xì)胞中的核糖體數(shù)量與任何一種 mRNA分子數(shù)量相比，都是大大超量的。因分子數(shù)量相比，都是大大超量的。因 此，增加此，增加mRNA分子數(shù)量是提高克隆基因表分子數(shù)量是提高克隆基因表 達(dá)效率的有效途徑。達(dá)效率的有效途徑。 增加增加mRNA分子數(shù)量的因素有兩種：分子數(shù)量的因素有兩種：1） 啟動(dòng)子強(qiáng)度；啟動(dòng)子強(qiáng)度；2）基因的拷貝數(shù)，即基因劑）基因的拷貝數(shù)，即基因劑 量；最簡(jiǎn)易的方法是將基因克隆到高拷貝的量；最簡(jiǎn)易的方

41、法是將基因克隆到高拷貝的 質(zhì)粒載體上。質(zhì)粒載體上。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)42 質(zhì)粒的拷貝數(shù)受質(zhì)粒復(fù)制控制區(qū)和宿主質(zhì)粒的拷貝數(shù)受質(zhì)粒復(fù)制控制區(qū)和宿主 菌的遺傳背景影響。迄今所使用的絕大多菌的遺傳背景影響。迄今所使用的絕大多 數(shù)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體，都是由數(shù)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體，都是由ColE1衍衍 生而來(lái)的。生而來(lái)的。 ColE1及其衍生質(zhì)粒的復(fù)制，受兩種及其衍生質(zhì)粒的復(fù)制，受兩種 負(fù)調(diào)節(jié)成分的控制：負(fù)調(diào)節(jié)成分的控制：RNAI和和Rom蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)43 RNAI是由是由ColE質(zhì)粒質(zhì)粒DNA編碼的長(zhǎng)度為編碼的長(zhǎng)度為108 nt 的不翻譯的不翻譯RNA分子，它通過(guò)

42、干擾分子，它通過(guò)干擾RNAII的加工來(lái)的加工來(lái) 抑制質(zhì)粒的復(fù)制。抑制質(zhì)粒的復(fù)制。 Rom蛋白是由蛋白是由ColE質(zhì)粒質(zhì)粒rom基因編碼的一種反基因編碼的一種反 式作用抑制劑，它可形成二聚體增強(qiáng)式作用抑制劑，它可形成二聚體增強(qiáng)RNAI和和 RNAII之間的堿基配對(duì)，從而抑制引物的形成。之間的堿基配對(duì)，從而抑制引物的形成。 因此，因此， rom基因的缺失或基因的缺失或RNAI基因的突變，基因的突變， 都會(huì)引起質(zhì)?？截悢?shù)的增加。都會(huì)引起質(zhì)?？截悢?shù)的增加。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)44 （2）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性是指質(zhì)粒缺陷性分配

43、引質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性是指質(zhì)粒缺陷性分配引 起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。 天然質(zhì)粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細(xì)胞內(nèi)，這天然質(zhì)粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細(xì)胞內(nèi)，這 是由于它們具有一段是由于它們具有一段分配功能區(qū)分配功能區(qū)Par所致。分配所致。分配 功能區(qū)功能區(qū)Par能夠保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中能夠保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中 都能準(zhǔn)確地分離，并均勻地分配到子細(xì)胞中去。都能準(zhǔn)確地分離，并均勻地分配到子細(xì)胞中去。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)45 克服質(zhì)粒丟失的方法：克服質(zhì)粒丟失的方法： 1）將）將Par克隆到表達(dá)載體；克隆到表達(dá)載體； 2）對(duì)無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞進(jìn)行反選擇。）對(duì)無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞進(jìn)行反選擇。大體步

44、驟為：使大體步驟為：使 攜帶目的基因的質(zhì)粒同時(shí)帶上編碼攜帶目的基因的質(zhì)粒同時(shí)帶上編碼 啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的 cl 基因，形成特殊的重組質(zhì)粒。然后用一種啟動(dòng)子基因，形成特殊的重組質(zhì)粒。然后用一種啟動(dòng)子 缺陷的缺陷的 突變體感染攜帶這種重組體質(zhì)粒的大腸突變體感染攜帶這種重組體質(zhì)粒的大腸 桿菌寄主細(xì)胞，使之成為溶源性細(xì)菌。在這種溶桿菌寄主細(xì)胞，使之成為溶源性細(xì)菌。在這種溶 源性細(xì)菌中，重組質(zhì)粒的喪失，伴隨著發(fā)生源性細(xì)菌中，重組質(zhì)粒的喪失，伴隨著發(fā)生 阻阻 遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進(jìn)入溶菌生長(zhǎng) 周期，從而使寄主細(xì)胞裂解死亡。周期，從而使寄主細(xì)胞裂解死亡。 基

45、因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)46 3、mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)錄本的分子特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 （1）翻譯起始系列對(duì)表達(dá)效率的影響）翻譯起始系列對(duì)表達(dá)效率的影響 許多細(xì)菌基因起始密碼子許多細(xì)菌基因起始密碼子5上游都存在上游都存在510個(gè)核苷個(gè)核苷 酸的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（酸的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），特稱(chēng)為），特稱(chēng)為SD序列序列。它包。它包 含含5-UAAGGAGG-3的全部或其中一部分。的全部或其中一部分。 已經(jīng)鑒定出已經(jīng)鑒定出SD序列與序列與16S rRNA分子之間的堿基互分子之間的堿基互 補(bǔ)程度，可明顯地影響補(bǔ)程度，可明顯地影響mRNA的翻譯速率。當(dāng)此序列的翻譯速率。當(dāng)此

46、序列 為為5-GGAGG-3時(shí)，可與時(shí)，可與16S rRNA 3端區(qū)段完全互補(bǔ)，端區(qū)段完全互補(bǔ)， 翻譯效率最高；而當(dāng)該序列發(fā)生單堿基突變時(shí)，翻譯翻譯效率最高；而當(dāng)該序列發(fā)生單堿基突變時(shí)，翻譯 效率便下降效率便下降30倍之多。倍之多。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)47 連接在連接在SD序列后面的序列后面的4個(gè)堿基成分的改變，會(huì)對(duì)個(gè)堿基成分的改變，會(huì)對(duì) 翻譯效率發(fā)生很大影響。翻譯效率發(fā)生很大影響。如果這個(gè)區(qū)域是由如果這個(gè)區(qū)域是由4個(gè)個(gè)A或或 4個(gè)個(gè)T堿基組成，其翻譯最有效；而當(dāng)是由堿基組成，其翻譯最有效；而當(dāng)是由4個(gè)個(gè)C或或4 個(gè)個(gè)G堿基組成，翻譯效率則只及最高翻譯效率的堿基組成，翻譯效率則只及最高

47、翻譯效率的 50%或或25%。 直接位于起始密碼直接位于起始密碼AUG上游的三個(gè)堿基的三聯(lián)上游的三個(gè)堿基的三聯(lián) 體組成，同樣也對(duì)翻譯效率發(fā)生影響。體組成，同樣也對(duì)翻譯效率發(fā)生影響。以以 -半乳糖半乳糖 苷酶苷酶mRNA的翻譯為例，當(dāng)這三聯(lián)體組分為的翻譯為例，當(dāng)這三聯(lián)體組分為UAU或或 CUU時(shí)，翻譯效率最高；而如果是時(shí)，翻譯效率最高；而如果是UUC、UCA或或 AGG時(shí)，翻譯水平下降時(shí)，翻譯水平下降20倍。倍。 基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)48 (2) mRNA的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 mRNA的的穩(wěn)定性穩(wěn)定性是指是指mRNA分子的相對(duì)壽命，或?qū)Ψ肿拥南鄬?duì)壽命，或?qū)?內(nèi)源內(nèi)源RNase降解作用的抵抗能力。降解作用的抵抗能力。 在細(xì)菌細(xì)胞中，有兩類(lèi)不同的核糖核酸酶參與在細(xì)菌細(xì)胞中，有兩類(lèi)不同的核糖核酸酶參與mRNA 降解作用：核糖核酸內(nèi)切酶（降解作用：核糖核酸內(nèi)切酶（RNaseE、RNaseK和和 RNaseIII）和核糖核酸外切酶（）和核糖核酸外切酶（RNaseII和和PNPase polynucleotide phosphorylase）。）。 在不同種類(lèi)的細(xì)菌中，這些核糖核酸酶的含量比例不在不同種類(lèi)的細(xì)菌