Northern雜交試驗指導(dǎo)手冊

1、northern雜交試驗指導(dǎo)手冊（1）rna提取發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):3187 分享 | 收藏 方法一、改良異硫氰酸胍提取法試劑及其配制異硫氰酸胍變性液：貯存液在含484ml 水（經(jīng)depc處理）, 17.6ml 0.75mol/l檸檬酸鈉（ph7.0）和26.4ml10%sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至6065并持續(xù)攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存?zhèn)溆茫ú怀^3個月）。工作液在每50ml貯存液中加入0.35ml2-me即配制成工作液。工作液于室溫下保存不超過1個月。工作液各成分的終濃度為：4mol/l異硫氰酸胍25mol/l檸檬酸鈉ph 7.00.5%(

2、w/v)n-十二烷基肌氨酸(sarkosyl)0.1mol/l巰基乙醇(2-me)其它溶液：2mol/l乙酸鈉 (naac) 緩沖液 (ph 4.0)水飽和酚（ph 3.5）491 (v/v) 氯仿/異戊醇100%異丙醇70%乙醇（用depc處理水配制）depc處理后高壓滅菌水試驗程序1取0.51g左右新鮮植物組織置于研缽中，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末。2將粉末全部移入冰上預(yù)冷的離心管中，并向其中加入5ml異硫氰酸胍變性液，輕輕搖動離心管使混合均勻。3順序加入2mol/l naac 0.5ml、水飽和苯酚5ml、氯仿/異戊醇1ml，每加入一種試劑都輕輕搖動離心管混合均勻，最后將離心管蓋緊，

3、倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15min.。44條件下15000g離心30min.，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于20冰箱冷凍1h.。54條件下13000g離心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml異硫酸胍變型液中（體積為第一次變性液的1/3），再加入等體積的異丙醇，混勻后置于20冰箱冷凍1h.。64條件下13000g離心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于適量體積（50g/100l）的depc處理水中，檢測后分裝，置于70低溫條件下保存。注意事項rna提取過程中，為了保證所提取的rna的純度和完整性，其中有兩個方面的問題需要特別控制，一是去

4、除與rna結(jié)合的蛋白質(zhì)，二避免內(nèi)外源rnase對rna的降解。在rna的提取中，常采用的蛋白質(zhì)變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉（sds）等。為防止外源rnase的污染，所有試驗用品均需用depc處理并高壓滅菌，所有試劑配制均需使用經(jīng)depc處理過的水或滅菌處理。內(nèi)源rnase的抑制采用異硫氰酸胍等強還原劑。為避免人體污染，所有試驗操作均應(yīng)帶手套，避免人體接觸所有用品。方法二、改良krapp提取法試劑及其配制rna抽提掖：母液：4mol 異硫氰酸胍20mmol edta20mmol mesph 7.0工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-me貯存在4條件下備用。rna重懸液：2mol l

5、icl10mmol naac調(diào)整終體積為250ml，ph 5.2，滅菌后貯存在4條件下備用。試驗程序1 取新鮮植物材料0.51g，冷凍干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml rna抽提掖充分混勻。24條件下8000rpm離心10min.，將上層水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿抽提掖，在4條件下8000rpm離心10min.。3上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混勻后，在4條件下8000rpm離心10min.）。4小心將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，加入1/10 vol 3mol naac和2 vol冷無水乙醇，在-8

6、0條件下沉淀2小時。5在4條件下8500rpm離心30min.，小心棄去上清液，沉淀重懸于rna重懸液中，置于4條件下1小時。64條件下8500rpm離心10min.，棄去上清液，沉淀溶于適當(dāng)體積的deoc處理水中。檢測后分裝，置于-70條件下保存。northern雜交試驗指導(dǎo)手冊（2）rna質(zhì)量檢測發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):4180 分享 | 收藏 二、rna質(zhì)量檢測提取的rna需要對其質(zhì)量和數(shù)量進行檢測。實驗室常用的方法有紫外吸收值檢測和電泳檢測兩種。方法一、紫外吸收檢測試劑：te ( 10mmol/l tris, 1mmol/ledta)。dh2o試驗程序1預(yù)熱紫外分光光度計

7、1020min.。2取兩個1ml的狹縫石英杯，一個裝入1mlte溶液作為空白校正液，用來校正分光度計零點及調(diào)整透光度至100。3取4l rna待測樣品加入另一比色杯中，加dh2o至1ml，用無菌石蠟?zāi)ざ伦”?，倒轉(zhuǎn)混勻。4將兩個比色杯置于分光光度計中，調(diào)入射光波長，用空白溶液分別調(diào)整t至100、od至0，然后測定樣品在260nm、280nm、230nm的od值。rna濃度和純度分析濃度計算：對于單鏈rna，od2601.0時，rna濃度為40g/ml，按照上述稀釋方式，即od2600.1時，其rna濃度為1g/ml。純度分析：純凈的rna樣品其od260/od280的比值應(yīng)介于1.72.0，小

8、于此比值說明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0則可能被異硫氰酸胍污染；od260/od230比值應(yīng)大于2.0，如果小于此比值說明有小分子及鹽類污染。方法二、變性瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑及其配制mops緩沖液（10）: 200mmol/l mops ( ph 7.0 )50mmol/l naac10mmol/l edta準(zhǔn)確稱取41.86g mops, 6.8g naac, 3.72g edta，先用適量的用depc處理的水溶解naac，再將mops溶解其中，再加入已用同樣方法處理水溶解的edta，混勻后用2mol/ld naoh將調(diào)整ph 至7.0，最后定溶至1000ml，過濾滅菌后避光保存。

9、上樣染料：50%甘油，1mmol/l edta，0.4%溴酚藍(lán)，0.4%二甲苯藍(lán)其它試劑：甲醛（37%溶液，13.3mol/l）甲酰胺（去離子）將10ml甲酰胺和1g離子交換樹脂混合，室溫攪拌1 小時后用whatman濾紙過濾。等分成1ml于-70貯存。溴化乙錠（eb，10mg/ml）70%乙醇試驗程序1將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。2配制瓊脂糖凝膠：稱取0.5g瓊脂糖，置于干凈的燒瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內(nèi)加熱溶化均勻。3待膠涼至6070時，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10mops緩沖液和0.5l溴化乙錠，混合均勻后立即灌膠（注意避免產(chǎn)生氣泡）。4樣品制備：取dep

10、c處理過的500l小離心管，依次加入10mops緩沖液2l、甲醛3.5l、甲酰胺（去離子）10l、rna樣品4.5l，混合均勻；將離心管置于60水浴中保溫10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3l上樣染料，混勻。5上樣：將制備好的凝膠放入電泳槽中（上樣孔一側(cè)靠近陰極），加入電泳緩沖液（1mops緩沖液），液面高出膠面12mm，小心拔出梳子使樣品孔保持完好。用微量移液器將制備好的樣品加入加樣孔，每孔上樣2040l。6電泳：蓋上電泳槽，接通電源，樣品端接負(fù)極，于7.5v/ml的電壓下電泳2小時左右，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時停止電泳。電泳結(jié)束后，即可在紫外燈下檢測結(jié)果。rna樣品質(zhì)量分析：完

11、整的總rna樣品應(yīng)呈現(xiàn)出三條條帶，分別為28s rrna、18s rrna、5s rrna。其中28s rrna條帶的亮度應(yīng)約為18s rrna條帶亮度的2倍，這表明rna樣品比較完整，基本無降解。如果兩條帶的亮度反過來，則說明rna樣品已發(fā)生降解。如果在點樣槽內(nèi)或槽附近有熒光區(qū)帶，則表明rna樣品中有dna污染。植物總rna中28s rrna及18s rrna在變性膠上的遷移率相當(dāng)于分子量5.1kb及2.0kb rna的遷移率，以此可作為分子量的參考。northern雜交試驗指導(dǎo)手冊（3）為制備rna探針模板的dna片斷亞克隆發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):3545 分享 | 收藏 a

12、 載體選擇為了獲得能夠在體外轉(zhuǎn)錄rna探針的dna模板，其克隆載體必須帶有可供選擇的特異轉(zhuǎn)錄啟動子，同時，為了獲得理想的northern雜交試驗結(jié)果，載體選擇帶有兩種不同類型而方向相反啟動子的載體，以便在rna探針制備時同時得到兩條鏈的轉(zhuǎn)錄探針。常用的這類載體有：pgem-3/pgem-4 ( 2.87kb, sp6/t7 ).pgem-3z ( 2.74kb, t7/sp6 ).pgem-3zf(-) (3.2kb, t7/sp6 ).bluescript m13- (2.96kb, t7/t3 ).按照試驗的經(jīng)濟有效原則，本試驗選用 bluescript m13-。b. 目的dna序列與載

13、體連接從所建立的cdna文庫中挑選出帶有目的dna片斷的克隆，擴增后提取質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶處理或采用pcr特異擴增的方法分離出目的dna片斷；采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒提取方法提取載體質(zhì)粒（見黃健試驗）。然后按下列程序進行連接。試劑及其制備t4 dna連接酶連接緩沖液（可直接購買或配制），10x 緩沖液配方為：0.5 mol/l tris-hcl ph 7.80.1 mol/l mgcl250mmol/l 二硫蘇糖醇（dtt）atp 5mmol/l ( 如果直接購買商品緩沖液，有的已加在緩沖液中，但有些需單獨加入)。bsa 0.25mg/lpeg (35008000均可，在緩沖液中加入2%3% 的peg

14、可提高平端連接效率)。無菌蒸餾水（sdw）試驗程序1 建立以下反應(yīng)體系（終體積20l）：4l 質(zhì)粒 ( 50g/l)6l 目的dna ( 100g/l)2l 10x 連接緩沖液2l dna 連接酶6l 無菌蒸餾水2 反應(yīng)管置于15條件下保溫反應(yīng)24小時，65加熱10min.終止反應(yīng)。3取510l連接反應(yīng)物用微型凝膠電泳檢測連接效果，其余反應(yīng)物于-20保存?zhèn)溆?。注意事?保證連接反應(yīng)中目的dna與質(zhì)粒載體的濃度比例在31，因為高濃度的dna有利于片斷與載體的連接，低濃度的dna則會增加載體自連。2dna連接酶對溫度敏感，在15以上會迅速失活，因此，連接反應(yīng)的溫度控制必須嚴(yán)格。3為了保證rna探針

15、的質(zhì)量，模板dna片斷的完整性和純度十分重要，在dna制備時要嚴(yán)格控制。c感受態(tài)細(xì)胞制備（cacl2法）試劑及其配制lb培養(yǎng)基（200ml）：2g胰蛋白凍、1g酵母浸膏、2g nacl，溶解后調(diào)整ph至78，定溶到200ml混勻，分裝成50ml/瓶后滅菌4保存。cacl2 0.1mol/l，4保存。e. coli菌株：jm105或tg1。試驗程序1將單菌落菌株接種于5ml lb培養(yǎng)基中，在37條件下振蕩培養(yǎng)過夜。2取0.5ml過夜培養(yǎng)的菌液接種于50ml lb培養(yǎng)基中，在37條件下振蕩培養(yǎng)約3小時，用分光光度計檢測od6000.30.4時，取出培養(yǎng)瓶置于冰上完全冷卻。3將菌液轉(zhuǎn)入離心管中，在4

16、條件下，3500rpm離心510min.，棄去上清液。4將沉淀懸浮于預(yù)冷的25ml 0.1mol cacl2中，在冰上放置30min.后，于4條件下，3500rpm離心510min.，棄去上清液。5沉淀重懸于2ml 預(yù)冷0.1mol cacl2溶液中，菌液直接用于轉(zhuǎn)化?；蚣尤?.6ml 80%甘油，按每管200l分裝于2ml的凍存管中，于液氮中速凍后-70保存?zhèn)溆?。d. 質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)化試劑及其配制lb培養(yǎng)基（同c）。氨芐青霉素：用無菌蒸餾水配制成50mg/ml的貯存液。含氨芐青霉素（ap）的lb平板：每升lb培養(yǎng)基中加入15g瓊脂，溶化后高壓滅菌，待稍涼后再加入氨芐青霉素至終濃度為50100g

17、/ml。在超凈工作臺上用9cm滅菌培養(yǎng)皿鋪板。iptg（isopropylthio-d-galactoside 異丙基硫代-d-半乳糖苷）：取2g溶于8ml雙蒸水中，定容至10ml，過濾滅菌后-20保存。x gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-d-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-d-半乳糖苷)：貯存液濃度為20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20黑暗保存。試驗程序1取制備分裝好的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上5min.，加入連接產(chǎn)物10l，輕輕混勻后置于冰上30min.。2然后置于42水浴中熱擊細(xì)胞50s.，再置于冰上2min.。3向各管中加入200l在

18、37下預(yù)熱的lb培養(yǎng)基，37下振蕩培養(yǎng)1小時。4與此同時，將la平板置于37下片刻，每板加入44l iptg/x-gal (4l iptg和40l x-gal )均勻涂布于平板表面放置約10min.使其吸附滲透。5將步驟3中培養(yǎng)的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超凈工作臺中放置片刻）置于37下培養(yǎng)過夜。含有插入片斷的菌落為白色。e. 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的快速檢測試劑及其配制煮沸緩沖液：蔗糖 8triton x-100 1.5%edta(ph 8.0) 50mmol/ltris-hcl(ph 8.0) 10mmol/llb培養(yǎng)基（同c）氨芐青霉素（ap）（同d）試驗程序1選取白色單菌落，接種到3ml含a

19、p的lb液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)過夜。2將培養(yǎng)物等分成2份按菌落編號，每一菌落編號切勿出錯。一份于4下保存?zhèn)溆?，每一菌落編號切勿出錯。另一份轉(zhuǎn)入eppendorf中，7000rmp離心2min.，棄去上清液，吸干殘留液體。3將沉淀菌體細(xì)胞懸浮于350l煮沸緩沖液中，加入25l溶菌酶后，渦旋混合。4將管置于100沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp條件下離心15min.。5取10l上清液，加入溴酚藍(lán)染料后，在0.8%瓊脂糖膠上電泳。6在紫外燈下根據(jù)分子量檢測插入片斷的完整性。如果不能確定轉(zhuǎn)化片斷的大小，則要進一步雜交、測序分析。選取經(jīng)檢測含有完整目的dna片斷的菌落，轉(zhuǎn)接于2ml t

20、b培養(yǎng)基（每升16g胰化蛋白凍/10g酵母提取物/5g氯化鈉）中，37下振蕩培養(yǎng)過夜，取850l菌液加入到一2ml的凍存管中，再加入150l 50%的甘油，混勻后置于液氮中快速冷凍，再置于-70條件下保存。northern雜交試驗指導(dǎo)手冊（4）模板dna的制備發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):3055 分享 | 收藏 a質(zhì)粒dna的小量提取試劑及其配制含ap的lb液體培養(yǎng)基te緩沖液：10mmol/l tris-hcl (ph 8.0) 1mmol/l edta (ph 8.0)溶液i： 25mmol/l tris-cl (ph 8.0) 10mmol/l edta 50mmol/l 葡萄

21、糖 高壓滅菌15min.后，4貯存。溶液ii: 0.2mol/l naoh 1% sds（臨用前現(xiàn)配制）溶液iii（100ml）：5mol/l 乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml dh2o 28.5ml 4貯存。酚氯仿（11）95%和70%乙醇試驗程序1在純凈工作臺上將5ml含ap的lb液體培養(yǎng)基加入到一1015ml通氣良好的試管中，然后將前述經(jīng)鑒定含有目的dna片斷的轉(zhuǎn)化細(xì)菌接種其中，37下振蕩培養(yǎng)過夜。2取1.5ml培養(yǎng)物置于一微量離心管中，在4下12000rpm離心2min.，棄去上清液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。3將細(xì)菌沉淀重懸于100l溶液i中，劇烈振蕩后加入200l新配制的溶液ii

22、，蓋緊離心管口，將其快速顛倒5次（切勿振蕩），再加入150l在冰上預(yù)冷的溶液iii，蓋緊離心管口，將其倒置后輕輕地振蕩使溶液iii在粘稠的裂解物中分散均勻，再將離心管置于冰上35min.。4在4下12000rpm離心5min.，將上清液移至另一離心管中。5加入等量酚氯仿（11），振蕩混勻，在4下12000rpm離心2min.，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。6加入二倍體積95%乙醇，振蕩混勻，室溫放置20min.，在4下12000rpm離心5min.，小心棄去上清液，倒置將液滴除盡。7用70%乙醇洗滌一次，室溫干燥10min.，用50l含20g/ml胰rna酶（無dna酶）的te重新溶解質(zhì)粒dna，

23、取1l 在含溴化乙錠的微型膠上進行電泳檢測，其余置于-20保存?zhèn)溆?。b 質(zhì)粒dna的線性化試劑及其配制not i和sal i內(nèi)切酶及其相應(yīng)的緩沖液酚氯仿（11）3mol/l naac(ph 5.2)100%和70% 乙醇depc-h2o試驗程序1在離心管中依次加入：質(zhì)粒dna 10l (1g/l)10內(nèi)切酶緩沖液 10ldh2o 80lsal i或not i 2l(10u/l)237保溫反應(yīng)2小時以上。3消化液用100l的酚氯仿（11）、氯仿各抽提一次，每次在在4下12000rpm離心5min.4將上清液轉(zhuǎn)入一新的離心管中，加入0.1倍體積3mol/l乙酸鈉和2倍體積乙醇沉淀過夜。54下120

24、00rpm離心20min.，棄去上清液，沉淀用70%乙醇洗滌一次，真空干燥。6線性化質(zhì)粒dna按0.25g/l的濃度重懸于depc-h2o中，取10l電泳檢測線性化質(zhì)量，其余于-20下保存?zhèn)溆胣orthern雜交試驗指導(dǎo)手冊（5）rna探針制備發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):4636 分享 | 收藏 五、rna探針制備（根據(jù)the dig system users guide）a 地高辛標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)錄試劑及其配制（試劑盒提供）：10 ntp標(biāo)記混合物：in tris-hcl (ph 7.5)10mmol atp10mmol ctp10mmol gtp6.5mmol utp3.5mmol

25、dig-utp 10 轉(zhuǎn)錄緩沖液：400mmol tris-hcl(ph 8.0)60mmol mgcl2100mmol dte(dithioerythritol)20mmol亞精胺100mmol nacl1unit/mlrnase抑制劑。10unit/l dnase i (rnase-free)20unit/l rnase抑制劑20unit/l t7 rna聚合酶和t3 rna聚合酶4mol/l licl200mmol/l edtadmpc-h2o 試驗程序（帶手套操作）1在一經(jīng)dmpc處理并高壓滅菌的無rnase污染的微型離心管中依次加入下列反應(yīng)物（離心管置于冰上）：線性化模板dna 4l

26、(1g)10ntp標(biāo)記混合物 2l10轉(zhuǎn)錄緩沖液 2ldmpch2o 10lt3或t7 rna聚合酶 2l2輕輕混勻反應(yīng)物，37保溫反應(yīng)至少2小時。3如果必要，向反應(yīng)體系中加入2l無rnase污染的dnasei，37下再保溫反應(yīng)15min.以除去殘留的dna模板（由于dig標(biāo)記的rna轉(zhuǎn)錄量大大超過dna模板量，因此，這一步有時也可以省略）。4向反應(yīng)體系中加入2l 200mmol/l的edta終止轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。5再向反應(yīng)體系加入2.5l 4mol/l licl和75l冰冷100%乙醇，4下沉淀過夜64下，12000rpm離心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗滌一次，真空干燥。7沉淀按1g/10l的

27、濃度重懸于depc-h2o中（每一反應(yīng)體系約10g），并向其中加入20unit rnase抑制劑，置于-20保存?zhèn)錅y，檢測后按一次雜交使用的體積分裝再置于-70下保存。dig標(biāo)記的rna在-70條件下可以穩(wěn)定地保存至少1年。b. dig標(biāo)記有效性檢測rna轉(zhuǎn)錄物能通過瓊脂糖變性膠電泳檢測其探針完整性。標(biāo)記效果可通過抗dig堿性磷酸酶直接檢測，有兩種方法可以選擇。方法一、用標(biāo)準(zhǔn)dig測試條比較鑒定使用測試條鑒定包括兩個步驟：首先，將轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的rna稀釋成一系列的濃度，并點樣到空白測試條上（對照測試條已用一系列濃度點樣）；其次，將點樣的備測試條與對照測試條一起進行免疫、顯色反應(yīng)，然后根據(jù)對照測試條

28、計算備測樣品的濃度。試劑及其配制20ssc：3mol/ nacl(175g/l)0.3mol/l 檸檬酸三鈉2h2o(88g/l)ph 7.0rna稀釋緩沖液：dmpc-h2o/20ssc/甲醛(5:3:2)anti-dig-apnbt溶液：75mg/ml nbt溶解在dmf（二甲基甲酰胺）中bcip溶液：50mg/ml bcip溶解在dmf中dig空白試劑條：帶正電荷的尼龍膜對照試劑條：在相同膜上已用不同濃度的dig標(biāo)記dna點樣（300,100,30,10,3pg）洗膜緩沖液：100mmol maleic acid150mmol nacl0.3%(v/v) tween20ph 7.5mal

29、eic acid緩沖液：100mmol maleic acid150mmol naclph 7.5封閉液：5% (w/v) sds17mmol/l na2hpo48mmol/l nah2po4室溫保存，如果需要，用0.45m的濾膜過濾除菌。檢測緩沖液：100mmol tris-hcl(ph 9.5)100mmol naclte緩沖液：10mmol tris-cl (ph 8.0)1mmol edta試驗程序（帶手套操作）1將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物稀釋成濃度約為1g/ml，即取前述轉(zhuǎn)錄標(biāo)記物1l加入99lrna稀釋緩沖液，如果轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反應(yīng)正常其濃度應(yīng)大約為1g/ml。2取5支eppendorf管，按a、b、

30、c、d、e順序編號，將1g/ml濃度的rna標(biāo)記物按下列方式稀釋成一系列濃度：編號 rna標(biāo)記物稀釋方法 rna終濃度a 1g/mlrna 10lrna稀釋緩沖液23l 300pg/lb 1g/mlrna 5l + rna稀釋緩沖液45l 100pg/lc a 5l + rna稀釋緩沖液45l 30 pg/ld b 5l + rna稀釋緩沖液45l 10pg/le c5l + rna稀釋緩沖液45l 3 pg/l3將空白測試條置于一聚酯膜上，以每一濃度1l的量在測試條上點樣，在聚酯膜上做好點樣濃度標(biāo)記，切勿直接在測試條上做任何記號，切勿用手接觸測試條。4室溫干燥約2min.，同時制備測試溶液。

31、5在2ml封閉液中加入1l anti-dig-ap。6顯色底物溶液：在2ml檢測緩沖液中加入9l nbt溶液和7l bcip溶液。7準(zhǔn)備5個樣品池（2.5 5ml容量），16順序編號，依次加入2ml以下溶液。. 封閉液；. 抗體溶液（第5項）；. 洗膜緩沖液；. 檢測緩沖液；. 顯色底物溶液（第6項）8將樣品測試條和對照測試條按下列順序在上述準(zhǔn)備的溶液中浸漬處理，兩步驟直接讓多余的溶液滴在吸水紙上。. 封閉， 2min. 抗體結(jié)合， 3min. . 封閉， 1min. 洗膜, 1min. 平衡， 1min. . 顯色反應(yīng)（黑暗），530min.9顯色反應(yīng)30min.即停止反應(yīng)（延長顯色反應(yīng)時間

32、，會增加背景而影響結(jié)果比較），用水漂洗測試條，將其置于3mm whatman濾紙上空氣干燥，然后在光下檢測。結(jié)果評估顯色反應(yīng)進行510min.時，對照測試條中300pg濃度的樣點即會出現(xiàn)顏色，30min.時3pg的樣點也可見顏色，隨即停止顏色反應(yīng)。漂洗后比較對照與待測樣品顏色，根據(jù)對照濃度與待測樣品的稀釋濃度計算標(biāo)記物的數(shù)量。如果標(biāo)記物濃度低于1030pg則不適宜采用這一快速檢測方法。方法二、用dig標(biāo)記的rna對照比較檢測試劑：dig標(biāo)記的對照rna（濃度約為100g/ml）其它試劑同方法一試驗程序1將dig標(biāo)記的對照rna先稀釋成20ng/l（5l對照rna加入20l depc-h2o），

33、取5支eppendorf管以a、b、c、d、e、f順序編號，將對照按下列比例稀釋成一系列濃度：編號 對照rna稀釋方法 終濃度a 20ng/l rna 2lrna稀釋緩沖液38l 1ng/lb a 5lrna稀釋緩沖液45l 100pg/lc b 5lrna稀釋緩沖液45l 10pg/ld c 5lrna稀釋緩沖液45l 1pg/le d 5lrna稀釋緩沖液45l 0.1pg/lf e 5lrna稀釋緩沖液45l 0.01 pg/l* 稀釋后的ae可以在-70下至少貯存一年。2按照同樣的方法將待測的digrna也稀釋成一系列濃度，編號用1、2、3、4、5、6以便于與對照區(qū)別。3取一片尼龍膜，

34、按照前述方法一的方法點樣，第一排點對照，第二排點待測樣，不必從濃度a開始，只需點cf濃度進行檢測。4用uv交聯(lián)方法或尼龍膜也可采用120烘膜30min.的方法使rna固定于膜上，再用洗膜緩沖液洗膜幾秒種。5將膜置于封閉液中，室溫下封閉30min.。6準(zhǔn)備抗體溶液：用封閉液按15000的比例稀釋anti-dig-ap。7將膜置于抗體溶液中，室溫下保持30min.，注意抗體溶液必須沒過膜。8室溫下用洗膜緩沖液洗膜2次，每次15min.。9再將膜置于檢測緩沖液中2min.。10在10ml檢測緩沖液中加入45l nbt和35l bcip配制成顯色底物溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。11除去檢測緩沖液，加入顯色底物溶

35、液，在黑暗下顯色大約16小時（一般幾分鐘即可見開始顯色），注意在顯色過程中，切勿振蕩樣品盤。12當(dāng)顏色沉淀充分后，停止顯色反應(yīng)，用te緩沖液或無菌水洗膜5min.。13比較對照和樣品的顏色測算濃度。northern雜交試驗指導(dǎo)手冊（6）northern印跡雜交發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):4490 分享 | 收藏 a 探針準(zhǔn)備dig標(biāo)記的rna探針與dna探針相比，顯示較強的雜交信號和較地的非特異性背景，因此，只要可能選用rna探針可以比dna探針獲得更好的雜交結(jié)果。如果必須使用dna探針，建議使用高sds雜交緩沖液或dig easy hyb以減少背景。在正式雜交試驗之前，優(yōu)化雜交探針

36、濃度是避免顏色背景所必須的。探針濃度的確定可通過模擬雜交進行。取一小片空白膜，將其浸入不同探針濃度的溶液中（如：1l/ ml、3l/ ml、5l/ ml ），可觀察到背景顏色的濃度即可作為雜交探針濃度。在采用熒光檢測或采用cspd化學(xué)發(fā)光檢測時，建議試驗探針濃度50100ng/ml，如果采用cdp-star化學(xué)發(fā)光檢測，由于靈敏度很高，在此探針濃度下會產(chǎn)生很高的背景，因此，要適當(dāng)降低探針濃度。b. 印跡條件對于1%的變性瓊脂糖膠向尼龍膜上印跡轉(zhuǎn)膜，在10和20的ssc鹽濃度下可以獲得相同的結(jié)果，轉(zhuǎn)膜時間是在4或室溫下過夜。c. 試劑及其配制mops緩沖液（10）: 200mmol/l mops

37、 ( ph 7.0 )50mmol/l naac10mmol/l edta上樣染料：50%甘油，1mmol/l edta，0.4%溴酚藍(lán)，0.4%二甲苯藍(lán)甲醛（37%溶液，13.3mol/l）染液：0.5mol/l naac(ph 5.2)中含0.04%的亞甲藍(lán)甲酰胺（去離子）70%乙醇ssc(20)：3mol/l nacl (175g/l)0.3mol/l 檸檬酸三鈉2h2o (88g/l)用1mol/l hcl調(diào)整至ph 7.0denhardt溶液（100)：10g ficoll 400 + 10g pvp + 10g bsa(penta x組分v)用dspc處理水溶解，定容至500ml，

38、過濾后分裝成每份25ml于-20保存。預(yù)雜交溶液：5 ssc5 denhardt 溶液50%(w/v) 甲酰胺1%(w/v) sds100g/ml 鮭魚精dna（用前加熱變性后加入）雜交溶液：dig-rna探針用預(yù)雜交液稀釋成適當(dāng)濃度2洗膜緩沖液：2ssc 加入0.1% sds0.5洗膜緩沖液：0.5 ssc加入0.1% sds0.1洗膜緩沖液：0.1 ssc加入0.1% sdsd. northern轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜前的rna瓊脂糖凝膠電泳參照rna分離中的電泳方法，根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)?分子量marker.1在一個標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳完成后，凝膠用dmpc-h2o淋洗，以除去甲醛，然后置于 2ssc（20

39、ssc用dmpc-h2o稀釋）中浸泡1530min.。2構(gòu)建轉(zhuǎn)移平臺：在塑料盒上橫放一塊玻璃板，玻璃板應(yīng)比塑料盒長，但比塑料盒窄。剪一塊與盒子等寬但長度是盒子長度2倍的濾紙，將其橫放在玻璃板上，濾紙兩頭垂入盤中，用20ssc浸濕濾紙，并向盤中加入足量的20ssc。3用鋒利的小刀將凝膠邊緣無用部分修去，并在靠加樣孔的一放左上角切去一小塊作為凝膠方位的記號。將凝膠置于平臺中央，用玻棒滾動除去氣泡，然后用石蠟?zāi)し庾∧z四周邊緣，避免覆蓋樣品部位。4剪一片與凝膠暴露面同樣大小的尼龍膜，在無rnase的水中浸泡5min.，然后將其放置在凝膠上面，膜的一條邊緣應(yīng)剛好重疊覆蓋于加樣孔的邊緣。膜置于凝膠表面后

40、即不應(yīng)輕易挪動，膜與凝膠之間不應(yīng)留有氣泡。5取兩張與尼龍膜同樣大小的濾紙，用20ssc浸濕后置于膜的上方，用玻棒趕出氣泡。切一疊略小于濾紙的紙巾，將其置于濾紙上方，在紙巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上壓一重物，室溫下轉(zhuǎn)膜46小時或4過夜。在轉(zhuǎn)膜過程中，要保證塑料盤中有足夠的20ssc，當(dāng)紙巾浸濕后，要及時更換。6拆卸轉(zhuǎn)膜裝置，翻轉(zhuǎn)凝膠和膜使凝膠的一面朝上，置于一張干的濾紙上，用軟鉛筆在膜上標(biāo)記凝膠加樣孔的位置。7取下凝膠，用2ssc洗膜，再置于兩張干濾紙上使膜晾干。8交聯(lián)：方法1. 將膜夾于兩張濾紙之間，在80真空烘烤0.52小時；方法2. 將膜置于一可透過紫外線的塑料保鮮膜中，將有rna的一

41、面朝下，用紫外透射儀照射合適時間。帶正電荷的尼龍膜適度照射可促進rna上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而增強雜交信號。但過度照射確會使rna上更大一部分胸腺嘧啶共價結(jié)合于尼龍膜表面，導(dǎo)致雜交信號減弱。對于濕潤的尼龍膜，總照射劑量為1.5 j/cm2，而干燥尼龍膜總照射劑量為0.15 j/cm2。9轉(zhuǎn)膜效果檢測：如果需要，可對轉(zhuǎn)移上rna的膜進行染色檢查轉(zhuǎn)膜效果。將交聯(lián)后的膜浸入5%冰醋酸中，于室溫浸泡15min.，再將膜轉(zhuǎn)移至亞甲藍(lán)染液中，室溫下浸泡510min.。可見明顯的5s和18s兩條rna帶，mrna呈現(xiàn)模糊帶型。e雜交建議雜交條件：探針濃度50100ng/ml，

42、溫度68過夜。1將印跡膜置于裝有預(yù)雜交液的雜交袋中（每100cm2膜20ml預(yù)雜交液），封好雜交袋，在設(shè)定的雜交溫度下預(yù)雜交至少1小時。2將探針在沸水浴中變性10min.(探針一經(jīng)變性，立即使用)，用預(yù)雜交液稀釋成設(shè)定濃度。3將雜交袋中預(yù)雜交液棄去，加入稀釋好的含有探針的雜交液，在設(shè)定雜交溫度條件下（68）雜交過夜。4雜交完成后，將雜交液回收置于一可耐低溫又可沸水浴的試管中，貯存于-70以備重復(fù)使用。重復(fù)使用時，解凍并在68下變性10min.。5洗膜：雜交膜取出后用2洗膜緩沖液室溫下洗膜2次，每次15min.，除去非結(jié)合探針以減少背景。接下來用0.5洗膜緩沖液洗膜2次，每次15min.，洗膜溫

43、度42，然后再在0.1洗膜緩沖液中洗膜2次，每次15min.，洗膜溫度68。當(dāng)探針長度小于100bp時，最后一次的洗膜溫度要經(jīng)過預(yù)備試驗確定。northern雜交試驗指導(dǎo)手冊（7）雜交結(jié)果檢測發(fā)布日期:2007-3-20熱門指數(shù):3187 分享 | 收藏 方法一、化學(xué)發(fā)光檢測試劑及其配制：洗膜緩沖液：100mmol maleic acid150mmol nacl0.3%(v/v) tween20ph 7.5maleic acid緩沖液：100mmol maleic acid150mmol naclph 7.5封閉液：5% (w/v) sds17mmol/l na2hpo48mmol/l nah2po4室溫保存，如果需要，用0.45m的濾膜過濾除菌。檢測緩沖液：100mmol tris-hcl(ph 9.5)100mmol naclte緩沖液：10mmol tris-cl (ph 8.0)1mmol edtaanti-dig-apcspd: 25mmol cspd（用前稀釋）檢測程序：1雜交洗膜后，將