BD FACSCalibur中文操作手冊DNA分析

1、bd facscalibur 中文培訓手冊 第七章 dna分析7.1 概述流式細胞儀分析大量細胞的細胞周期和dna倍體已經(jīng)成為一種日益重要的腫瘤研究方法，并已廣泛應用于腫瘤基礎和臨床研究中，為腫瘤的診斷，療效評價和預后預測提供了重要的參考指標。7.1.1 細胞周期正常人靜止體細胞有46條染色體，相當于7.10-12 pg dna/細胞核，我們稱之為二倍體細胞，而正常增殖細胞則存在不同的dna含量。在細胞周期（g0，g1，s，g2 ，m）的各個時期，dna的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化：在g1期，細胞開始rna和蛋白質的合成，但dna含量仍保持二倍體；進入s期后，dna開始合成，這時細胞核內d

2、na的含量介于g1和g2期之間；當dna復制結束成為4倍體時，細胞進入g2期，g2期細胞繼續(xù)合成rna及蛋白質，直到進入m期，因此，單純從dna含量無法區(qū)分g2期和m期；一旦有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個子細胞，這兩個子細胞或者進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（g0期），而g0期從dna含量上同樣無法與g1期區(qū)分。因此，整個復制周期可以描述為g0/g1，s，g2/m期。通過核酸染料標記dna，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出g0/g1%，s%及g2/m/%，了解細胞的增殖能力，在腫瘤病理學研究中，通常以s期細胞比率作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標。正常細胞具有較恒定的d

3、na含量，而細胞癌變過程中結構和/或染色體的異常是很常見的。這種變化在流式分析中以dna倍體指數(shù)的形式表現(xiàn)出來，這一指數(shù)對于腫瘤的早期診斷，交界瘤、間葉組織腫瘤的良惡性判斷提供了重要的輔助指標。應該注意的是，只有在染色體數(shù)目的變化帶來的dna含量差異可被檢測時，才可能有dna異倍體的檢出。因此dna含量的不異常不能除外惡性或染色體異常的存在。另外，正常細胞在衰老過程中的多倍體化以及腫瘤治療后導致的dna含量的增加、凋亡和壞死導致的dna含量降低都是在分析dna直方圖時需要考慮的因素。7.1.2 dna檢測的常用術語coefficient of variation（cv）：變異系數(shù)。不同細胞群體

4、dna含量的細微差別可能有生物學上的重要意義，因此dna含量的流式分析中分辨率或精確度尤為關鍵。通常檢測分辨率或精確度由g0/g1峰的cv來反映。 %cv=（sd/mean）x 100。影響cv的因素主要包括兩方面：儀器因素（如液流、光路、機器調試等）和樣本制備及染色過程對標本的人為影響。所謂優(yōu)化dna分析條件就是指最大程度地減少這兩大因素帶來的變異。（參考附錄1）dna index（di）：dna指數(shù)。di指的是腫瘤樣本g0/g1峰的平均道數(shù)與人正常二倍體g0/g1峰的平均道數(shù)之間的比值。di為1 意味著二倍體（2c）。ploidy：倍體。原指染色體數(shù)目。流式中用來描述總的dna含量。二倍體

5、細胞有正常細胞的dna含量但不除外染色體異常。di為1.9-2.1 的細胞為四倍體（cv為5%時）。在二倍體和四倍體區(qū)域之外的統(tǒng)稱異倍體。di值應隨著儀器線性度的任何變化而進行糾正（詳見后述）。7.1.3 影響流式dna分析的因素分辨率（cv）dna流式分析中的分辨率（或精確性）非常重要，因為細胞群體之間dna含量的細微差別可能有顯著的生物學意義。通常，分辨率由標準微球dna分布中的g0/g1峰的變異系數(shù)來反映。%cv=（sd/mean）x100儀器因素（如液流、光路調試和光學元件等）、樣本制備和染色過程帶來的人為因素都可能影響檢測的精確性。評估真正的生物學意義上的dna含量差別因而具有更重要

6、的價值。如何最大限度地減少樣本制備和儀器因素帶來的變異是dna分析條件最佳化的根本所在。dna直方圖中峰的cv越低，質量越好，從圖中可能獲得的信息越多。新鮮標本的cv常比石蠟包埋的標本好。新鮮標本的cv常=3%，而石蠟包埋的標本cv則取決于組織病理實驗室的具體操作方法，通?？傻玫?5%。當g1峰的cv=8%時，不再合適估計s期比例。線性度在dna含量分析中，g2+m峰的道數(shù)值應該是g0/g1峰的兩倍。g0/g1峰和g2+m峰的位置提供了比較其他峰位置的基準。若g2/m 與g1的比值不是1.95-2.05, 放大器的線性度則需要檢查。必要時應進行適當?shù)恼{節(jié)（通常是放大器的offset調節(jié)有誤）。

7、碎片較多的碎片會干擾s期的計算，也會妨礙分析較小的亞二倍體峰。若較多碎片成為一個常規(guī)問題，應重新評估樣本采集和制備過程。有時，大量的壞死或凋亡細胞也會帶來過多碎片。細胞雙粘體雙粘體是指一起通過激光照射區(qū)而被錯誤地記錄為一個細胞的兩個細胞或顆粒。在dna 分析中，兩個具有2n dna含量的細胞同時通過激光照射區(qū)，即被記錄成一個4n的熒光信號，造成4n的細胞增多的假象。bd公司通過專利的雙粘體辨別模式（doublet discrimination module，ddm）來有效地區(qū)分單個細胞和聚集細胞，用設門來排除聚集細胞的干擾。大量的細胞聚集體是較差的樣本制備的指征。應在樣本制備時盡量避免。7.2

8、dna質量控制（dna qc particles）bd的dna質量控制試劑盒為facs系列和其他品牌的流式細胞儀提供了一種檢測和評價儀器性能的方法，尤其適用于dna檢測時的質量控制要求。這個試劑盒包括4種試劑：試劑a是小雞紅細胞核（cen），用于建立測試條件，例如pmt的電壓和放大器的放大倍數(shù)，同時提供有關儀器線性度和分辨率的信息。cen試劑經(jīng)過特殊處理而成，包括單個核，雙聯(lián)體核，三聯(lián)體核和更大的聚集體，用來檢測儀器的線性度和分辨率。pi染色后，由于這些細胞核聚集程度的不同，在fl2-a或fl2-h的直方圖中會出現(xiàn)至少4個峰，而前4個峰分別代表單個核，雙聯(lián)體核，三聯(lián)體和四聯(lián)體。若染色正常，儀器

9、的線性度良好，則后三個峰所在道數(shù)的平均值與第一個峰值的比值應接近于2，3，4。試劑b是小牛胸腺細胞核（ctn），它具有一個完整的細胞周期，因此不僅可以檢查ddm或脈沖處理器是否工作正常，還可作為細胞周期統(tǒng)計分析的質控。ctn具有細胞周期的各個時期，大部分核處于g0/g1期，小部分處于s期和g2/m期。兩個粘連起來的g0/g1期細胞核可以通過ddm與單個g2/m期細胞核區(qū)分開來，ddm的功能就是將雙聯(lián)體細胞核或其它聚集體與單個細胞核區(qū)分開來，以確保g2/m期的比值有意義。試劑c是2um的熒光微球，作為一種穩(wěn)定的非生物標準品來確認儀器的cv。2um的熒光微球在fl1和fl2兩個通道都可接受到光信號

10、，因此它可脫離開染色和樣本制備的過程來檢測儀器的性能，如果cen和ctn的信號峰的cv值大于我們的建議值，最好做2um的微球來確定是生物樣本的問題還是儀器本身的問題。試劑d是核酸染料pi。7.2.1 樣本制備cen輕輕搖勻后，吸取40ul cen到1ml的pi中，混勻，室溫避光放置10分鐘，即可上機。ctn大力震蕩試劑瓶，吸取40ul ctn到1ml pi中，混勻，室溫避光放置10分鐘即可上機檢測。2-um微球大力震蕩試劑，擠一滴微球到1ml 0.2um濾膜濾過的pbs中，混勻后即可上機。7.2.2 上機檢測1) 雙擊dna experiment document file這是一個3頁的doc

11、ument file，第一頁包括一個散點圖（fl2-wfl2-a），兩個直方圖（fl2-a和fl2-w），兩個直方圖統(tǒng)計框，用來獲取分析cen；第二頁包括一個散點圖（fl2-wfl2-a），一個直方圖（fl2-a）和一個直方圖的統(tǒng)計框，用來獲取分析ctn；第三頁是個簡單說明，指導您如何建立獲取dna的條件。需要指出的是，在dna experiment document file中所有的圖都是acquisitionanalasis模式的圖，即獲取一旦結束，自動進入分析模式。如果您找不到dna experiment document file，可以在cellquest中按照上面的描述自己建立。2)

12、 在acquire菜單下選擇connect to cytometer3) 在cytometer菜單下選擇instrument setting，下載合適的獲取條件。路徑為：hdbd applicationdna qc4) 確定文件名及保存位置5) 上cen管，保持低速跑樣，注意觀察fl2-a的直方圖，調節(jié)fl2的電壓，使得cen單個細胞核的dna峰位于2005的道數(shù)上；再看fl2-w的直方圖，調節(jié)fl2-w放大器的倍數(shù)，使得cen單個核峰也為與2005的道數(shù)上。6）收集10000個粒子，取下cen管，放回蒸餾水。7） 調節(jié)fl2-a直方圖中m1，m2的位置，使其剛好位于前兩個峰，通過fl2-a直

13、方圖統(tǒng)計框中m1，m2的平均值來計算m2/m1的比值，應在1.95-2.05之間；而m1的cv值應小于或等于3.00%。8） 同樣條件收集10000個ctn細胞核，注意觀察fl2-wfl2-a散點圖，單個細胞核與雙聯(lián)體細胞核能否區(qū)分，以此來判斷ddm是否工作正常。由于ctn有完整的細胞周期，因此對于不同批號的ctn，我們都附有各個時期的參考標準值，您可用modfit來分析您獲取的ctn，將得出的各個時期的比例與參考值做一比較，樣本的制備，條件的設置和分析方法的不同，都可能帶來結果的差異。9） 如果您得到的任何一個峰的cv值都超過了標準，我們建議您用2-um的微球來檢測儀器的cv是否正常。在ce

14、llquest中建立一個fl2-a的直方圖（acquisitionanalasis模式）及直方圖的統(tǒng)計框，調節(jié)fl2的電壓，使得單個微球的峰值在2005的位置，收集10000個微球，取下bead管，放上蒸餾水；將m1放在第一個峰上，檢查cv是否小于或等于2.3%。10） dna質控做完后，您可將儀器的設置及所用的圖或統(tǒng)計框都保存起來，以便下一次使用。7.2.3 常見錯誤排除問題原因解決方法 計數(shù)率太低儀器堵塞；儀器沒有調試好；樣本過于稀釋實施每日維護；參考儀器使用手冊；準備新的樣本無法設置pmt的電壓和放大器的倍數(shù)cen太多或太少；pi染料變質；cen單個細胞核的門太寬重新制備cen；更換pi

15、染料；重復調節(jié)屏幕以獲得一個新的門cv值增加樣本或pi 變質；流速設成hi；液流中有氣泡制備新的樣本；將流速改回lo；除去空氣泡從fl2-w上看不到單個核與雙聯(lián)體的分界fl2-w太低；樣本或pi變質重新調節(jié)fl2-w的放大倍數(shù)；制備新的cen，ctn或更換pi染料7.3 用cellquest 軟件獲取dna 數(shù)據(jù)7.3.1樣本制備l 樣本收集和制備細胞懸液 從組織培養(yǎng)或體液中獲得的細胞懸液也可用于dna分析1. 將細胞懸液裝入17100-mm的管中2. 室溫300g離心5分鐘3. 吸去上清夜，加入1ml緩沖液重懸細胞4. 室溫300g離心5分鐘5. 重復步驟3，46. 吸去上清夜，加入1ml緩

16、沖液重懸細胞，調整細胞濃度到1.0106細胞/ml7. 染色，上機分析；或冷凍以待日后檢測實體組織 （若是冰凍組織，先復溫到室溫）準備樣本收集管，做好標記，每管加入1ml檸檬酸鹽緩沖液1. 對于小于0.5cm的樣本：將腫瘤組織樣本放入透析袋中，折疊兩次或以上，折疊時注意側線平行，然后將四角折疊用針頭或不銹鋼大頭針固定于聚苯乙烯泡沫塑料盒中。這時腫瘤組織已固定封閉，可以進行抽吸了。2. 對于大于0.5cm的樣本：將腫瘤組織直接黏附于聚苯乙烯泡沫塑料盒中即可。細針穿刺技術在病理學家的指導下選擇適用于細針穿刺的腫瘤組織，對于每一種不同的組織請用新的注射器和針頭以免交叉污染。若樣本不立即處理，請冰凍保

17、存。1. 將注射器安裝在支持物上，并連上25-gauge1.5-inch的針頭。2. 將針尖插入到腫瘤組織中，安置好后，將注射器的活塞輕輕向后拉形成一段真空。對于大的組織，應盡可能多地使針頭穿過組織的不同部位，以保證能收集到不同種類的細胞；而對于小的組織塊，應盡可能多地吸取樣本。3. 當針頭中（不是注射器筒）可看到有物質出現(xiàn)時，抽出針頭。4. 小心地將細胞注入1ml緩沖液中，清洗針頭，盡可能多的回收細胞。清洗時注意緩沖液不要吸入到針筒中。5. 針頭中殘余足夠多的細胞懸液（大約2滴）可用于制作細胞切片，若樣本量允許，還可制作組織病理切片。6. 重復步驟2-4，計數(shù)細胞，使得檸檬酸緩沖液中的細胞濃

18、度達到1.0106細胞/ml，以保證足夠制備測試管和對照管樣本。冷凍技術若樣本不是立即進行染色分析，請將細胞懸液轉移到耐低溫的聚丙烯管中，用帶螺紋的蓋子蓋緊，在干冰和99%酒精的混合物中迅速冷凍，保存于-80中。下次分析時，將樣本取出，37水浴解凍，注意不要讓樣本直接接觸37。l dna 試劑盒組成：試劑a（10ml）含有胰蛋白酶，四氫氯化精胺去污劑，可用于分離實體組織片段，消化細胞膜及細胞骨架。試劑b（8ml）含有胰蛋白酶抑制劑，rna酶，檸檬酸鹽緩沖液，四氫氯化精胺。用于抑制胰蛋白酶的作用并消化rna。試劑c（8ml）含有pi染液，四氫氯化精胺，檸檬酸鹽緩沖液。pi作用時的最終濃度至少有1

19、25ug/ml。緩沖液（3瓶，50ml/vial）含有檸檬酸鈉，dmso用于收集和（或）冷凍細胞懸液l 染色過程1 染色時要求樣本的細胞濃度為5.0105，同時應制備一管待測樣本和外周單個核細胞（pbmc）的混合管作為對照管，腫瘤細胞和pbmcs的比率至少是2：1；2室溫離心細胞懸液，400g，5分鐘，除去上清夜；3每一管加入250ul a液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘；4每一管加入200ul b液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘；5每一管加入200ul c液，輕輕混勻，不要震蕩，低溫（2-8）避光靜置10分鐘；6用50um尼龍網(wǎng)膜或35um細胞過濾器過濾細胞；7低溫避光放置以

20、待上機檢測。建議在加入c液后3小時內上機，上機前輕輕混勻細胞懸液。對照用于對照的細胞是已知dna含量的細胞（例如外周血單個核細胞），它為測試樣本的dna指數(shù)提供了一個參照。對照細胞應在染色前加入到待測樣本中，并與待測樣本染色步驟完全一樣。732用cellquest 軟件上機獲取數(shù)據(jù)做樣本的倍體性和細胞周期分析時，建議做三管平行分析管：一管二倍體標準品，一管未知樣本與二倍體標準品的混合樣本，以及一管未知樣本。對于腫瘤樣本來說，理想的二倍體標準品是與其組織類型相同的正常組織。另一個二倍體標準品是外周血單個核細胞（pbmcs）。在下面的練習里，要求您使用pbmc作為二倍體標準品，檢測一個細胞系，進行

21、實驗的獲取工作。使用pi進行細胞染色，用fl2-a直方圖做dna含量分析。同免疫表型分析一樣，在做dna樣本數(shù)據(jù)獲取之前，先要做儀器獲取條件的優(yōu)化，并執(zhí)行獲取前的步驟。儀器獲取條件的優(yōu)化保證了流式細胞儀獲取條件適合于待測樣本。做優(yōu)化的第一步，使用dna qc文件夾里的pbmc experiment document文件，在fl2-a直方圖中，將pbmc細胞群設定在200道的位置。建議收取dna指數(shù)在0.1c-6c范圍內的細胞，因此，將二倍體標準細胞設定在200道的位置，可以滿足此要求。另外，您需要建立一個點圖，以確定fl2-w的設定達到最佳條件。實際上，您應該保證樣本中的所有細胞的每一個參數(shù)都

22、可以被合理地檢測到。最后，您可以開始獲取樣本數(shù)據(jù)，并將文件自動保存到磁盤上。實驗室練習：dna獲取條件的優(yōu)化以及數(shù)據(jù)的獲取此練習中，假設您已經(jīng)完成了練習1（dna qc實驗），此時，facstation處于連機狀態(tài)，并已加載了儀器獲取條件。1. 打開pbmc experiment document文件。此文件位于dna qc文件夾中。一頁大小的文件包括一個fl2-a直方圖，及直方圖的統(tǒng)計結果。2. 畫一個fl2-w vs fl2-a acquisition-analysis點圖。將統(tǒng)計框拖到直方圖下方，在直方圖右側畫點圖。3. 從acquire菜單上選擇parameter discriptio

23、n（參數(shù)描述）命令。屏幕上顯示parameter discription對話窗口。4. 在parameter discription對話窗口中點擊folder（文件夾）。屏幕上顯示地址對話框。保存文件到您指定的文件夾中。5. 點擊select 文件夾名稱命令。parameter discription對話窗口被激活。6. 在parameter discription對話窗口中點擊file（文件）。屏幕上顯示file name editor（文件名編輯器）窗口。確定file name prefix（文件名前綴）設定為custom prefix（自定義前綴）、file count（文件計數(shù)）設定為

24、1。7. 根據(jù)要求，在第一行custom prefix欄內輸入文件名前綴。8. 點擊ok。9. 關閉parameter discription對話窗口。10. 確定acquisition control窗口中的setup選項已選擇打勾。11. 將流式細胞儀的液流速度置于lo的位置，儀器設定在run模式，將pbmc樣本放在加樣針處，支撐臂處于合位。12. 點擊acquire（獲?。?。此時，您可以檢查上樣情況，如有必要，可以調整獲取條件。13. 在cytometer菜單下選擇detectors/amps，打開detectors/amps窗口。14. 調整fl2 pmt電壓，使pbmc細胞群位于道數(shù)

25、2005的位置。檢查直方圖統(tǒng)計框中的mean值，幫助調整細胞群在直方圖中的位置。如有需要，可以隨時點擊pause（暫停）和restart（重新開始），更新顯示屏幕。15. 將pbmc樣本從上樣針處移下，換上含有未知樣本與pbmc的混合樣本。16. 檢查fl2-w vs fl2-a點圖，改變fl2 pmt電壓，調整待測細胞在圖中的位置。17. 在acquisition control窗口中，先點擊pause，然后再點擊abort（放棄）。18. 將混合樣本從上樣針處移下，換上含有pbmc樣本。19. 在acquisition control窗口中，去除setup選擇?，F(xiàn)在，您可以準備獲取實驗管的

26、細胞數(shù)據(jù)了。20. 點擊acquire（獲?。?。pbmc管的數(shù)據(jù)文件將按照前面的輸入路徑，自動保存到規(guī)定的文件夾下面。注意pbmc實驗的平均熒光強度（mean）和cv。pbmc或其它二倍體標準品是染色過程的質控品，應每天檢查它的cv，確保有較好的精密度，并可以用來評估試劑的一致性。21. 獲取完pbmc管后，獲取pbmc與腫瘤細胞的混合管，最后再獲取腫瘤細胞管。獲取時注意不要改動獲取條件。22. 獲取條件單獨保存為一個文件。733質量控制為了得到可信的結果，bd建議您用dna qc particle來設置pmt的電壓，檢測儀器的分辨率，線性度以及雙聯(lián)體識別器的工作情況，具體內容請參考dna q

27、c particle說明書。bd建議您每測一個樣本都相應地制備一個對照。在做dna分析的獲取時，為了得到較低的cv值，建議您使用低速跑樣，獲取速率至少為60個細胞/秒。更換樣本時，讓儀器保持run的模式，使得進樣針可以反沖；切換到standby模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沉積到流動室中。直方圖必須用專門的分析軟件來分析。bd建議您每一個樣本至少獲取20000個細胞數(shù)，若樣本中含有一些小的細胞群體，則需要更多的細胞數(shù)。734常見錯誤 問題原因 解決方法二倍體g0/g1峰位置突然改變或緩慢漂移液流系統(tǒng)中有氣泡或阻塞物；鞘液和樣本液的彈性不一致；pi染色不夠；pi孵育的時間不夠沖洗管路，清除氣

28、泡檢查鞘液的質量檢查細胞核的濃度并調整增加孵育時間在熒光的直方圖中碎片過多原先的樣本壞死較多；細胞裂解不完全；鞘液中顆粒太多肉眼檢查組織是否壞死太多；檢查懸液是否裂解不徹底；清洗系統(tǒng)，更換鞘液或鞘液濾器峰寬；cv值增大流速太高；液流中有氣泡；樣本中有過多的壞死細胞使用低速跑樣；檢查液流中有無氣泡；檢查是否有壞死細胞的存在，重新準備樣本熒光強度的減弱帶來的峰的漂移太多細胞；dna染色不飽和；進樣針中殘留有漂白劑調整細胞核的濃度到合適的狀態(tài)；選擇合適的pi的濃度和體積，重新制備樣本；確保漂白劑沖洗后，在用蒸餾水徹底清洗細胞數(shù)很少或沒有樣本管不合適上樣；樣本中沒有細胞核；進樣針堵了；流動室中有碎片更

29、換樣本管或檢查樣本管有無裂縫；用顯微鏡檢查樣本中有無細胞核；反沖清洗進樣針；將流式細胞儀從run切換到standby模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沉積到流動室中。74 用modfit 軟件分析dna數(shù)據(jù)modfit 是由美國verity software house公司設計，專門用于流式細胞術中進行細胞周期分析的軟件。它通過對dna含量直方圖進行曲線擬合，能快速計算出各種倍體細胞的含量、細胞周期各時相及亞二倍體細胞所占的比例、dna指數(shù)、g0/g1期峰的變異系數(shù)等。此外，2.0版本還增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分別進行同步化細胞和增殖細胞的研究。7.4.1運用modfit

30、進行自動分析f 從蘋果菜單下進入modfit f 在工具欄中點擊file，選定所要分析的數(shù)據(jù)文件，單擊openf 打開edit菜單，分別對debris，aggregates和fit apoptosis peak進行定義，以便軟件根據(jù)樣本的具體情況選擇合適的分析模式用modfit 進行任何分析之前，都必須定義所要分析的樣本的類型，軟件本身不能得出任何關于樣本的資料，比如說，是新鮮樣本，凍存組織還是石蠟切片？有無聚集體？有無凋亡等。f 在工具欄中單擊auto鍵軟件開始自動分析樣本，尋找峰的位置，確定倍體，選擇合適的分析模式，進行非線性的最小二乘法分析，最后顯示結果，而所有這些分析過程僅須幾秒鐘的時

31、間。f 通過點擊工具欄中的diags鍵，我們可以檢驗這次分析的合理性，評估的標準是根據(jù)dna consensus conference所提出的來確定的。 可使用自動分析的樣本通常比較典型，因此復雜的樣本不適合用自動分析。7.4.2運用modfit 進行手動分析如modfit 在自動分析過程中無法正確確定峰值的位置或樣本的倍型，或者你希望自己選擇分析的模式，那么你可以用手動分析來實現(xiàn)。f 在工具欄中點擊file，選定所要分析的數(shù)據(jù)文件，單擊openf 選擇用于dna分析的參數(shù)：fl2-af 設門。軟件最多允許同時設兩個門，點擊gate 1或2前的小方框，然后單擊define the gate，選

32、擇合適的x軸和y軸，將門移動到所要分析的細胞群上，單擊okf 單擊工具欄中的mod鍵或選擇analysis菜單中的choose model在這個對話窗口中需要你來描述你所得到的樣本的信息，比如說，樣本的類型，有無異倍體等。每一個有關的資料都會影響到最終分析模式的選擇。 選擇碎片擬合的模式：新鮮/凍存，石蠟切片，沒有碎片（不進行碎片分析）； 選擇倍型：異倍體，二倍體，四倍體； 若有異倍體，則須確定是一個還是兩個異倍體； 選擇細胞聚集體分析模式：有聚集體，沒有聚集體，或自動檢測（軟件自行判斷有無需要擬合聚集體）； 選擇是否擬合二倍體的s期：如異倍體的g0/g1期峰與二倍體g0/g1期峰明顯分開,我

33、們對每一個細胞周期的s期都能夠進行擬合，則選擇fit diploid s；如異倍體的g0/g1期峰與二倍體g0/g1期峰靠得非常近，則選擇no diploid s； 選擇能否看得見明顯的g2/m期峰：visible g2/m，indistinct g2/m（軟件將自動把g2/m期峰的位置固定在兩倍于g0/g1期峰的位置； 選擇是否擬合凋亡：fit apoptosis，no apoptosis； 選擇有無標準參照物：no standards，one standard，two standards； 根據(jù)這些資料，軟件選擇分析的模式并將其顯示在對話窗的下部； 單擊ok確認并關掉對話窗。f 軟件打開分

34、析模式，確認每個峰所在的位置，并將range放置于不同的峰上如若軟件對于各個峰的確認不太正確，你需要移動range，將其放在正確的位置：將e1 range放置在碎片峰的起始；確認d1 range是否在二倍體的g0/g1期峰上，這個range不一定將整個峰都包括在內，只要在峰的中心位置即可；移動a1 range將其放置在異倍體g0/g1峰的中心位置；移動d2 range將其放置于二倍體g2/m期峰的中心位置或是兩倍于g0/g1期峰的位置；移動a2 range將其放置兩倍于異倍體g0/g1峰的道數(shù)，即異倍體g2/m期的位置；若t1 range出現(xiàn)，你可以不去移動它的位置，它只是用來激活軟件分析聚集

35、體的功能；最后，需要將e2 range放在這個直方圖的最右邊，用來識別碎片的終止位置；這樣，各個range都各就各位了，可以開始進行分析了。 單擊工具欄中的fit鍵，軟件開始以最小二乘法來擬合曲線，并進行統(tǒng)計。若這個軟件還沒有被實驗室其他人設置過，那么當你進行分析時，將會出現(xiàn)一個關于s期評估的詢問窗口，提供了3個選項：馬上設置s期的臨界值；以后再提醒我設置s期的臨界值；不需要激活s期評估這項功能。若你需要這項評估，你必須輸入你們實驗室獲得的具有統(tǒng)計意義的各種組織的二倍體或者異倍體的s期的臨界值，如沒有，則不必激活這項功能。 分析完畢后，你需要檢查一下分析圖，以確保分析模式很好地擬合你的樣本，如

36、果不是，最好確定你的分析模式選擇是否恰當，以及range的放置是否正確。此外，還可以點擊工具欄中的diags鍵來得到關于當前分析結果的一系列評估指標：1) %cv，指的是g0/g1期峰的cv值，最好8%，對于實體組織來說，這個標準比較難達到，但應該盡可能達到，cv值過大，不僅直接影響到s期所占比率的計算，還會給倍體的分析帶來困難，因為有可能會掩藏了一個不正常的峰2) cell#，指的是用于擬合分析的細胞數(shù)，不能少于10000個3) rcs，是一個統(tǒng)計學上的指標，用來反應你所選擇的這個模式與你的標本的擬合程度，0.9-3.0為比較好的一個范圍，而3.0-5.0為可以接受，小于0.8或是大于5.0，都被視為不可接受4) %b.a.d，指的是背景中的碎