實(shí)驗(yàn)二植物細(xì)胞微核檢測(cè)技術(shù).doc

1、實(shí)驗(yàn)二植物細(xì)胞微核檢測(cè)技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、理解細(xì)胞微核形成的機(jī)理及其形態(tài)特點(diǎn)，2、學(xué)會(huì)培養(yǎng)植物根尖的技術(shù)。3、學(xué)會(huì)植物根尖的微核誘導(dǎo)技術(shù)。3、學(xué)會(huì)習(xí)植物根尖細(xì)胞的微核檢測(cè)技術(shù)。4、了解毒理遺傳學(xué)在實(shí)際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義。二、實(shí)驗(yàn)原理毒理遺傳學(xué)，用遺傳學(xué)方法研究環(huán)境因子對(duì)生殖細(xì)胞或體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的損傷及其毒理效應(yīng)的遺傳學(xué)分支學(xué)科。環(huán)境因素造成的遺傳毒理效應(yīng)包括三個(gè)方面:突變形成、癌形成、致畸效應(yīng)，簡(jiǎn)稱為毒理遺傳的三致效應(yīng)。毒理遺傳學(xué)的應(yīng)用 : 鑒定生殖細(xì)胞、體細(xì)胞致突變物 ; 預(yù)測(cè)潛在的致癌物 ; 環(huán)境遺傳毒物污染的監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)。根據(jù)危害鑒定、描述劑量 - 反應(yīng)關(guān)系、致突變機(jī)制，進(jìn)行危

2、險(xiǎn)度和致癌危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)。微核 (micronuclei) 簡(jiǎn)稱 MCN，是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的。在細(xì)胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核 1/3 以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成 DNA的能力。微核形成 : 有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片不能向兩極移動(dòng)，游離于細(xì)胞質(zhì)中，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核，直徑大約是細(xì)胞直徑的 1/20,1/5 。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑大蒜、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、鑷子、載

3、玻片及蓋玻片、鹽酸、乙醇、石碳酸品紅染液、硫酸銅。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、幼根的培養(yǎng) ( 提前 3 5d 進(jìn)行培養(yǎng) )將大蒜瓣剝?nèi)ネ膺吥べ|(zhì)枯皮，下端可見許多微微凸起的根原體，將蒜瓣架在燒杯 ( 大小與蒜瓣適宜 ) 口上，杯中盛滿清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培養(yǎng)箱中，注意每天換水，經(jīng) 35d 后，即可長(zhǎng)出 1-2cm 的嫩根。2、處理根尖 : 陽性檢測(cè)采用 0.1g/L 硫酸銅，以及自行設(shè)計(jì) ( 或采集 ) 的液體，對(duì)照用自來水處理，處理時(shí)間 24h，處理液浸沒根尖。3、恢復(fù)培養(yǎng) : 處理后的根尖用自來水浸洗 3 次，每次 2-3min ，洗凈后在水中恢復(fù)培養(yǎng) 24h。4、固定 : 切取 1cm左右的

4、根尖，用無水乙醇: 冰醋酸 (3:1) 固定液固定 24h 后棄去固定液，移入70, 酒精中， 4?冰箱保存。5、酸解 : 棄去固定液，用蒸餾水漂洗2-3 次，吸凈水。用 1mol/L HCl在 60?處理根尖 10min 后，水洗 34 次，每次 5min，以徹底洗凈鹽酸。6、染色 : 將洗好的根尖放在載玻片上。將伸長(zhǎng)區(qū)及以上部位切去，截下1-2mm長(zhǎng)的根尖，截去根冠，保留分生組織。將分生組織搗爛，滴加1-2滴石碳酸品紅染液，染色10min。加蓋玻片，壓片觀察，記錄有微核的細(xì)胞數(shù)目。7 、微核識(shí)別:首先在低倍鏡中找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻、分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，找到微核。(1)

5、在主核大小的 1/3 以下，并與主核分離的小核。(2) 小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。(3) 小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。 8 、微核千分率 ( MCN )每一處理觀察 3 個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1000 個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中含的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)，即為該處理的微核千分率。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、被檢測(cè)溶液 ( 標(biāo)明采集方法、地點(diǎn) ):2、實(shí)驗(yàn)過程記錄 :項(xiàng)目名稱開始時(shí)間結(jié)束時(shí)間備注幼根培養(yǎng)試劑處理恢復(fù)培養(yǎng)固定2、將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄在大蒜根尖微核檢測(cè)記錄表中大蒜根尖微核檢測(cè)記錄表片號(hào) 第一片 第二片第三片 各自觀細(xì)胞微核數(shù)細(xì)胞數(shù)微核數(shù) 細(xì)胞數(shù)微核數(shù) 察的細(xì)數(shù)胞數(shù)或微核數(shù)總計(jì)平均微核千分率注 :(1) 微核千分率 (MCN)= 檢出的微核數(shù) / 檢測(cè)細(xì)胞總數(shù) *1000 在 10以下時(shí)，無污染，為環(huán)境本底 ;10- 18時(shí)，有輕度污染 ; 18- 30時(shí)，有中度污染 ;,30 ，有重度污染。(2) 污染指數(shù) (PI