黃曲霉毒素及其檢測(cè)方法整體解決方案

1、黃曲霉毒素及其檢測(cè)方法整體解決方案一、黃曲霉毒素介紹黃曲霉毒素 (aflatoxin, 簡(jiǎn)稱為 AF 是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素。 它可通過(guò)多種途徑污染食品和飼料, 直接或間接進(jìn)入人類食物鏈, 威脅人類健康 和生命安全, 對(duì)人體及動(dòng)物內(nèi)臟器官尤其是肝臟損害嚴(yán)重, 該毒素是黃曲霉和寄 生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物, 普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中。 黃曲霉毒 素比較耐熱,加熱至 230 才能被完全破壞,因此一般烹飪加工也不易消除。 二、黃曲霉毒素對(duì)人體的危害1、 引起急、慢性中毒:黃曲霉毒素是劇毒物質(zhì), 其毒性相當(dāng)于氰化鉀的 10倍, 砒霜的 68倍。 黃曲霉毒 素屬肝臟毒,除抑制

2、DNA 、 RNA 的合成外,也抑制肝臟蛋白質(zhì)的合成,黃曲霉 毒索引起人類的急性中毒事件, 國(guó)內(nèi)外均有許多報(bào)導(dǎo), 最典型的是印度的霉變玉 米事件,該事件直接導(dǎo)致了數(shù)十人喪生,數(shù)百人患上不同類型的肝臟疾病。 2、 致癌性:黃曲霉毒素有極強(qiáng)的致癌性, 長(zhǎng)期攝入黃曲霉毒素會(huì)誘發(fā)肝癌。 它誘發(fā)肝癌的 能力比二甲基亞硝胺大 75倍, 是目前公認(rèn)的致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。 另?yè)?jù)世界衛(wèi) 生組織報(bào)導(dǎo),黃曲霉毒素含量在 3050ug/kg時(shí)為低毒, 50100ug/kg時(shí)為中毒, 1001000ug/kg時(shí)為高毒, 1000ug/kg以上為極毒。鑒于黃曲霉毒素對(duì)人類的巨大 危害性, 我國(guó)對(duì)其在食品中的含量作了嚴(yán)格

3、規(guī)定, 其中, 乳制品中黃曲霉毒素最 高允許量為 5ug/kg(即 5ppb 。三、黃曲霉毒素的種類黃曲霉毒素主要有 4種:即 B 1、 B 2、 G 1、 G 2,其中 B 1被認(rèn)為是主要的有毒物質(zhì), 有 2種這些毒素的代謝產(chǎn)物 M 1和 M 2。 其中黃曲霉毒素 B 1主要存在于農(nóng)產(chǎn)品, 動(dòng)物飼料,中藥等產(chǎn)品中;黃曲霉毒素 M 1 是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素 B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物,一部分從尿和乳汁排出,一部分存在于動(dòng)物的可食部分,如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中,其中以乳最為常見。黃曲霉毒素 M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素 B1的基本相似。 由于牛乳及其制品是人類、 特別是嬰兒的主要食品

4、,所以其危害性更大。四、最新政策及國(guó)標(biāo)(含國(guó)外一些政策1、 自 2003年 8月 1日起,凡在我國(guó)境內(nèi)從事米、面、油、醬油、醋生產(chǎn)加工的企 業(yè),其產(chǎn)品須經(jīng)檢驗(yàn)合格后方可上市。國(guó)家質(zhì)檢總局發(fā)布的關(guān)于印發(fā)小麥 粉等 5類食品生產(chǎn)許可證實(shí)施細(xì)則的通知 中明確規(guī)定, 黃曲霉毒素 B 1必須檢 測(cè)。2、 在第八期 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公報(bào) 中發(fā)布關(guān)于黃 曲霉毒素檢測(cè)方法的最新國(guó)標(biāo):(1、 GB/T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測(cè)定 免疫親和層凈化高效 液相色譜法和熒光光度法(2、 GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定 免疫親和層凈 化高效液相色譜

5、法和熒光光度法以上兩項(xiàng)國(guó)標(biāo)均在 2003年 8月 1日開始實(shí)施3、 2002年 2月 4日歐盟決議對(duì)從中國(guó)進(jìn)口或委托從中國(guó)進(jìn)口的花生和花生制品實(shí) 施黃曲霉毒素強(qiáng)制性檢測(cè)的特殊條件五、中國(guó)及國(guó)際上對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)1、主要國(guó)家: 2、其他(1、 WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際衛(wèi)生組織 (WHO/世界糧農(nóng)組織所屬的食品法典委 員會(huì) (CAC推薦食品、飼料中黃曲霉毒素最大允許量標(biāo)準(zhǔn)為總量 (B1+B2+G1+G2 小于 15g/kg;牛奶中 M 1的最大允許量為 0. 5g/kg(2、南非標(biāo)準(zhǔn)。 1990頒布了黃曲霉毒素的最大允許標(biāo)準(zhǔn):食品中黃曲霉毒素 總量小于 10g/kg,其中黃曲霉毒素 B 1小

6、于 5g/kg。(3、其他標(biāo)準(zhǔn)。印度標(biāo)準(zhǔn)是花生中黃曲霉毒素 B 1小于 30g/kg;越南和阿根廷 的標(biāo)準(zhǔn)為黃曲霉毒素 B 1小于 20g/kg。六、黃曲霉毒素檢測(cè)方法測(cè)定黃曲霉毒素測(cè)定的方法有薄層色譜法、 高效液相色譜法、 酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定法、質(zhì)譜法、放射免疫測(cè)定法。這些方法中,國(guó)標(biāo)方法 “ 免疫親和柱法 ” 是現(xiàn)在 國(guó)際公認(rèn)的比較經(jīng)濟(jì)有效的分析方法。 有著較好的權(quán)威性和通用性, 且為國(guó)外多 個(gè)組織認(rèn)可,被列為標(biāo)準(zhǔn)方法,如:美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC 美國(guó)農(nóng)業(yè)部聯(lián)邦谷物檢測(cè)中心(FGIS 國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC 美國(guó)食品藥品行政署(US-FDA 美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA 同時(shí)

7、在國(guó)內(nèi)被認(rèn)證的機(jī)構(gòu):中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫局(CIQ 七、黃曲霉毒素檢測(cè) “免疫親和柱法”方法有以下特點(diǎn):1、 認(rèn)證機(jī)構(gòu)廣泛,通用性強(qiáng)2、 分析速度快,一個(gè)樣品只需 10-15分鐘,其他傳統(tǒng)的方法要做到定量分 析需要幾小時(shí)至幾天的時(shí)間。3、 靈敏度高,測(cè)定范圍廣泛(0-300ppb , 用熒光計(jì)可以測(cè)定 0.1ppb 的黃 曲霉毒素四種異構(gòu)體,用 HPLC 可以檢測(cè)出 10ppt 的黃曲霉毒素 B1。4、 采用單克隆免疫技術(shù),可以特效性地將黃曲霉毒素和其他真菌毒素分離 出來(lái),分離效率和回收率高,正確性和可靠性強(qiáng)。八、黃曲霉毒素檢測(cè) “免疫親和柱法”方法具體步驟如下:1、試劑配制(1樣品提取溶劑:甲

8、醇 /水(4/1, v/v(2 5mmol 磷酸鹽緩沖溶液(PBS (pH7.2母液配制:1稱取 50.14gNa 2HPO 4.12H 2O 溶解于 700ml 水中。2稱取 9.66gNaH 2PO 4.H 2O 溶解于 350ml 水中。3 將上述兩種溶液進(jìn)行混合并加入 42.5gNaCl , 配制成 pH7.2 5mmol磷酸鹽緩沖溶液(3 1mmol 磷酸鹽緩沖溶液 (PBS(pH7.2工作液配制:取 200ml 的 5mmol 磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2稀釋于 800ml 水中。 (4磷酸鹽緩沖溶液(PBS /吐溫 (Tween配制:取 8ml 吐溫 -20稀釋于 92mlpH7.

9、2磷酸鹽緩沖溶液中(5 HPLC 流動(dòng)相配制:水 /甲醇 /乙腈(60/30/15,v/v2、樣品處理方法:方法一:標(biāo)準(zhǔn)方法該處理程序適用于樣品基質(zhì)中沒有干擾,主要適用于大多數(shù)谷類樣品的處理。 1、取 20g 樣品加入 100ml 提取液(甲醇 /水, 4/1, v/v放入勻漿機(jī)中,并高速 攪拌 5分鐘。2、用濾紙過(guò)濾上述提取液3、取 14ml 過(guò)濾后的提取液加入 86ml 的 1mmolPBS 緩沖溶液(pH 7.2 。如果樣 品量比較少,取樣品體積可以適當(dāng)減少(如 1.4ml+8.6ml緩沖溶液 。如混合過(guò) 程中有沉淀產(chǎn)生,樣品需要用注射過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾或進(jìn)行離心。4、打開凈化柱上密封蓋和下

10、面堵頭后,柱中的緩沖溶液會(huì)排出,直到緩沖溶液 液面達(dá)到柱中填料上層處。5、取 5-50ml 稀釋后的提取液(取樣體積根據(jù)分析方法的靈敏度來(lái)確定上 AflaCLEAN TM 柱。在凈化過(guò)程中可對(duì)柱子進(jìn)行抽真空和加壓;但必須保證過(guò)柱 流速不大于 1-2滴 /秒。盡量讓所有上樣樣品都通過(guò)柱子流出來(lái),即使柱中溶劑 流干了也沒有太大問(wèn)題,但是要避免柱子溶劑完全流干。6、用 10ml 蒸餾水或純化水清洗柱子7、用氣體吹掃或抽真空除去柱子中殘余的水8、每次用 1ml 甲醇洗脫柱子,可洗 2次。第一次加入的甲醇需用堵頭堵住柱子 下端,使甲醇在凈化柱中保持 5min 后,再放出收集。9、根據(jù)分析的需要對(duì)洗脫液進(jìn)

11、行稀釋或濃縮并直接進(jìn)行 HPLC 分析。方法二:標(biāo)準(zhǔn)方法加正己烷分層該樣品處理方法針對(duì)樣品中含有油脂比較多, 如堅(jiān)果類, 一些香料或無(wú)花果醬, 脂肪和樣品中含有一些需要用正己烷去除的雜質(zhì)。1、稱取 20g 樣品并加入 2g 的氯化鈉2、加入 100ml 提取溶劑(甲醇 /水, 4/1, v/v和 50ml 正己烷于勻漿機(jī)中高速攪 拌 5min 。3、靜止分層,取下層液進(jìn)行下一步處理4、取下層液用濾紙過(guò)濾5、取 14ml 過(guò)濾后的提取液加入 86ml 的 1mmolPBS 緩沖溶液(pH 7.2 。如果 樣品量比較少,取樣品體積可以適當(dāng)減少(如 1.4ml+8.6ml緩沖溶液 。如混 合過(guò)程中有

12、沉淀產(chǎn)生,上柱液需要用注射過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾或進(jìn)行離心。6、打開凈化柱上端密封蓋和下端堵頭后，柱中的緩沖溶液會(huì)排出，直到緩沖溶 液液面達(dá)到柱中填料上層處。 7、取 5-50ml 稀釋后的提取液（取樣體積根據(jù)分析方法的靈敏度來(lái)確定）上 AflaCLEANTM 柱。在凈化過(guò)程中可對(duì)柱子進(jìn)行抽真空和加壓；但必須保證過(guò) 柱流速不大于 1-2 滴/秒。盡量讓所有上樣樣品都通過(guò)柱子流出來(lái)，即使柱中 溶劑流干了也沒有太大問(wèn)題，但是要避免柱子完全溶劑流干。 8、用 10ml 蒸餾水或純化水清洗柱子 9、用氣體吹掃或抽真空除去柱子中殘余的水 10、 每次用 1ml 甲醇洗脫柱子，可洗 2 次。第一次加入的甲醇需用堵

13、頭堵住 柱子下端，使甲醇在凈化柱中保持 5min 后，再放出收集。 11、 根據(jù)分析的需要對(duì)洗脫液進(jìn)行稀釋或濃縮并直接進(jìn)行 HPLC 分析。 方法三： 方法三：標(biāo)準(zhǔn)方法加正己烷分層和 PBS/Tween 稀釋 該處理過(guò)程用于樣品含有干擾雜質(zhì)，主要是大部分的香料和中草藥。 1、此處理過(guò)程樣品最大取樣量為 20g（一些樣品需要減少取樣量可以達(dá)到比較 好的提取效果） 。 2、稱取 20g 樣品并加入 2g 氯化鈉 3、樣品先進(jìn)行均質(zhì)化處理，向處理好的樣品中加入 100ml 提取溶劑（甲醇/水， 4/1，v/v）和 50ml 正己烷于勻漿機(jī)中并高速攪拌 5min。 4、提取液靜止分層，取下層溶液進(jìn)行下

14、一步處理 5、取下層溶液用濾紙過(guò)濾 6、取 5ml 濾液加入 35mlPBS/Tween 溶液稀釋。如稀釋混勻中出現(xiàn)沉淀，需用注 射過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾或離心。 7、打開凈化柱上端密封蓋和下端堵頭后，柱中的緩沖溶液會(huì)排出，直到緩沖溶 液液面達(dá)到柱中填料上層處。 8、取 14ml 稀釋后的提取液（取樣體積根據(jù)分析方法的靈敏度來(lái)確定）上 AflaCLEANTM 柱。在凈化過(guò)程中可對(duì)柱子進(jìn)行抽真空和加壓；但必須保證過(guò) 柱流速不大于 2ml/min。盡量讓所有上樣樣品都通過(guò)柱子流出來(lái)，即使柱中 溶劑流干了也沒有太大問(wèn)題，但是要避免柱子完全溶劑流干 9、用 10ml 蒸餾水或純化水清洗柱子 10、 11、 用

15、氣體吹掃或抽真空除去柱子中的殘余的水 每次用 1ml 甲醇洗脫柱子，可洗 2 次。第一次加入的甲醇需用堵頭堵住 柱子下端，使甲醇在凈化柱中保持 5min 后，再放出收集。 12、 根據(jù)分析的需要對(duì)洗脫液進(jìn)行稀釋或濃縮并直接進(jìn)行 HPLC 分析 3、HPLC 分析方法： 黃曲霉毒素檢測(cè)需要一臺(tái)配有熒光檢測(cè)器的 HPLC 系統(tǒng)。 黃曲霉毒素 HPLC 分析檢測(cè)條件可參照以下設(shè)定： 流動(dòng)相：水/甲醇/乙腈 60/30/15 (v/v； 流速：1.2ml/min 進(jìn)樣量：10-100L；柱溫：36 HPLC 黃曲霉毒素專用分析柱：1504.6mm；RP C18（貨號(hào)：10522） 熒光檢測(cè)器設(shè)置：EX

16、.:365nm;Em.:460nm (使用柱后衍生系統(tǒng)， 詳見柱后衍生技術(shù) 或 Em.:430nm 用于黃曲霉毒素 B 類的檢測(cè)和 455nm 用于黃 曲霉毒素 G 類的檢測(cè) 4、柱后衍生技術(shù) 在 HPLC 分析中，為提高一些檢測(cè)痕量目標(biāo)物的靈敏度（如黃曲霉毒素 B1 和 G1） ，需要對(duì)檢測(cè)的目標(biāo)物進(jìn)行衍生化，目前在 HPLC 中，以柱前衍生法和柱后 衍生法居多，但柱前衍生法由于操作過(guò)程較繁瑣，容易影響定量的準(zhǔn)確性，不適 合用于對(duì)大量樣品做常規(guī)檢測(cè)，而柱后衍生法操作簡(jiǎn)單，可連續(xù)反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)自動(dòng) 化分析，適用于大量樣品的連續(xù)的自動(dòng)化操作。LCTech 公司現(xiàn)有 UVETM 光化學(xué) 柱后衍生設(shè)備

17、LCTech 的 UVETM 柱后衍生設(shè)備（如圖 1，P/N 10519）是最簡(jiǎn)單，最便捷和性 價(jià)比高的柱后衍生設(shè)備。 只要將該設(shè)備連接到 HPLC 柱出口和熒光檢測(cè)器的進(jìn)口 之間可以使用。 該設(shè)備不需要任何試劑， HPLC 流動(dòng)相的水就可以作為反應(yīng)試劑。 當(dāng)分析時(shí)不需要使用該設(shè)備， 只要將設(shè)備電源關(guān)閉就可以了， 不需要額外的操作。 圖 1 LCTech 公司的 UVETM 系統(tǒng) 圖 2 Aflatoxin B1 光化學(xué)衍生到 AflatoxinB2a 的過(guò)程 雖然黃曲霉毒素 B2 和 G2 在熒光檢測(cè)器上有很好的響應(yīng)值，但是黃曲霉毒素 B1 和 G1 需要進(jìn)行衍生才可以在熒光檢測(cè)器上有好的響

18、應(yīng)值。這個(gè)過(guò)程可以通 過(guò) UVETM 在 254nm 紫外光照射下進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)完成。 通過(guò)黃曲霉毒素 B1 和 G1 進(jìn)行羥基化（在雙鍵結(jié)構(gòu)上加一分子水，如圖 2） ， 并產(chǎn)生穩(wěn)定可測(cè)的熒光。這個(gè)光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程不影響其他黃曲霉毒素 B2 和 G2 化學(xué)和檢測(cè)性質(zhì)。 一般來(lái)說(shuō)，檢測(cè)方法的檢出限與樣品前處理過(guò)程和熒光檢測(cè)器的性能有關(guān)。如 果儀器靈敏度足夠好，黃曲霉毒素經(jīng) AflaCLEANTM 柱凈化后直接檢測(cè)，其檢測(cè) 限可達(dá)到 ppt 級(jí)。 圖 3 使用 UVETM 柱后衍生化處理黃曲霉毒素 HPLC 檢測(cè)的色譜圖比較 6a 圖是 UVETM 打開的結(jié)果，6b 是 UVETM 關(guān)閉的結(jié)果 5、黃曲霉毒素分析實(shí)驗(yàn)室配置 1、儀器 貨號(hào) 10514：AflaCLEANTM 黃曲霉毒素免疫親和柱 貨號(hào) 10081：三指型燒杯夾，用于固定 120ml 免疫親和柱上樣瓶； 貨號(hào) 10896：120ml 免疫親和柱上樣瓶，DURAN 玻璃，包含蓋和密封墊 貨號(hào) 10519：UVETM 黃曲霉毒素紫外柱后衍生儀，CE 認(rèn)證 貨號(hào) 10522：黃曲霉毒素專用 HPLC 分析柱， 貨號(hào) 10523：預(yù)柱（3 個(gè)/包） ； 貨號(hào) 10750：預(yù)