經(jīng)典色譜法液相

1、1第10章 經(jīng)典液相色譜法 液相色譜法液相色譜法：以液體為流動(dòng)相的色譜法稱。以液體為流動(dòng)相的色譜法稱。經(jīng)典液相色譜經(jīng)典液相色譜：固定相顆粒較固定相顆粒較大大且且不均勻不均勻 常壓常壓下輸送流動(dòng)相下輸送流動(dòng)相 柱效較柱效較低低 分析周期分析周期長長現(xiàn)代液相色譜：現(xiàn)代液相色譜：固定相顆粒固定相顆粒且且高壓高壓下輸送流動(dòng)相下輸送流動(dòng)相 柱效較柱效較高高 分析周期分析周期短短2第第1 1節(jié)節(jié) 液液- -固吸附柱色譜固吸附柱色譜（一）分離原理（一）分離原理（二）常用吸附劑（二）常用吸附劑（三）色譜條件的選擇（三）色譜條件的選擇3 各組分與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑各組分與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑表面活性中心表面活

2、性中心， 利用吸附劑表面的活性吸附中心對不同組分的利用吸附劑表面的活性吸附中心對不同組分的吸附吸附 能力差異能力差異而實(shí)現(xiàn)分離而實(shí)現(xiàn)分離固定相為固體吸附劑，屬吸附色譜固定相為固體吸附劑，屬吸附色譜（一）分離原理（一）分離原理4（二）、吸附劑（二）、吸附劑對吸附劑的要求：對吸附劑的要求：（1 1）具有較大的表面積和一定的吸附能力）具有較大的表面積和一定的吸附能力（2 2）顆粒要有一定的細(xì)度）顆粒要有一定的細(xì)度(d=75-150m(d=75-150m，即，即100-200100-200目目) )，且粒度均勻，且粒度均勻（3 3）與洗脫劑及樣品不起反應(yīng)）與洗脫劑及樣品不起反應(yīng)常用：硅膠、氧化鋁、聚酰

3、胺、活性炭、大孔樹脂常用：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、大孔樹脂5吸附機(jī)制：吸附機(jī)制： 表面的硅醇基，與物質(zhì)形成氫鍵表面的硅醇基，與物質(zhì)形成氫鍵適用范圍：適用范圍：微酸性（微酸性（pH=45），）， 適于酸性和中性物質(zhì)適于酸性和中性物質(zhì)失活：失活：水與硅醇基結(jié)合使其失去活性水與硅醇基結(jié)合使其失去活性活化：活化：105-110105-110加熱加熱30min30min粒度：粒度：100-200100-200目目1. 硅膠（硅膠（SiO2H2O）中等極性吸附劑中等極性吸附劑6 堿性氧化鋁堿性氧化鋁 pH 9pH 910 10 適于分析堿性、中性物質(zhì)適于分析堿性、中性物質(zhì) 如：生物堿如：生物堿 中性

4、氧化鋁中性氧化鋁 pH 7.5 pH 7.5 適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)適于分析酸性堿性和中性物質(zhì) 如：生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸堿中不穩(wěn)定的如：生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸堿中不穩(wěn)定的苷類、酯、內(nèi)酯等化合物苷類、酯、內(nèi)酯等化合物 酸性氧化鋁酸性氧化鋁 pH 4pH 45 5 適于分析酸性、中性物質(zhì)適于分析酸性、中性物質(zhì) 如：酸性色素、氨基酸、對酸穩(wěn)定的中性物質(zhì)如：酸性色素、氨基酸、對酸穩(wěn)定的中性物質(zhì)2. 氧化鋁氧化鋁7硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系 硅膠含水量硅膠含水量%活度級(jí)活度級(jí)氧化鋁含水量氧化鋁含水量%005315625103815活度測定法：活

5、度測定法：BrockmamnBrockmamn法法83 3、聚酰胺、聚酰胺CH 2CH CH CH CH CONH2222n商品名：錦綸、尼龍商品名：錦綸、尼龍-6不溶于水和有機(jī)溶劑，易溶于濃無機(jī)酸不溶于水和有機(jī)溶劑，易溶于濃無機(jī)酸分離機(jī)制：主要是分離機(jī)制：主要是氫鍵吸附氫鍵吸附適用對象：適用對象：黃酮類、鞣質(zhì)、醌黃酮類、鞣質(zhì)、醌粒度：粒度：2020100100目目氫鍵能力氫鍵能力強(qiáng)強(qiáng)組分越后出柱組分越后出柱 9（三）色譜條件的選擇：（三）色譜條件的選擇：1. 1. 被測組分性質(zhì)（極性大小）：被測組分性質(zhì)（極性大?。?烷烴烯烴醚烷烴烯烴醚 硝基化合物硝基化合物 二甲胺二甲胺酯酮酯酮醛醛 胺胺

6、酰胺醇酚羧酸酰胺醇酚羧酸依據(jù)被測組分、吸附劑和流動(dòng)相的性質(zhì)依據(jù)被測組分、吸附劑和流動(dòng)相的性質(zhì)2. 2. 吸附劑的選擇：吸附劑的選擇： 吸附劑的活性吸附劑的活性大，對被測組分的吸附能力大，對被測組分的吸附能力強(qiáng)強(qiáng) 強(qiáng)極性物質(zhì)強(qiáng)極性物質(zhì)選擇弱吸附劑選擇弱吸附劑 弱極性物質(zhì)弱極性物質(zhì)選擇強(qiáng)吸附劑選擇強(qiáng)吸附劑酸性成分：硅膠酸性成分：硅膠 堿性成分：氧化鋁堿性成分：氧化鋁 黃酮類：聚酰胺黃酮類：聚酰胺用量：用量： 化學(xué)分離：化學(xué)分離：30倍倍 除雜：除雜：10倍倍11 “相似相溶相似相溶”原則原則 ：分離分離極性大極性大的物質(zhì)應(yīng)選用的物質(zhì)應(yīng)選用極極性大的溶劑作流動(dòng)相性大的溶劑作流動(dòng)相，分離，分離極性小極

7、性小的物質(zhì)應(yīng)選用的物質(zhì)應(yīng)選用極性小的溶劑作流動(dòng)相，極性小的溶劑作流動(dòng)相，3、流動(dòng)相的選擇、流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相極性：流動(dòng)相極性：烷烴烷烴 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 酯酯 酮酮 醇醇 1.51.5 使待測組分的使待測組分的R Rf f在在0.30.30.50.5 展開后各斑點(diǎn)圓而集中，不拖尾展開后各斑點(diǎn)圓而集中，不拖尾 具有適中的沸點(diǎn)和小的粘度具有適中的沸點(diǎn)和小的粘度 臨用前配制臨用前配制2 2、展開劑、展開劑36展開劑的組成：單一溶劑、多元溶劑展開劑的組成：單一溶劑、多元溶劑 單一溶劑：重現(xiàn)性好，分離能力差單一溶劑：重現(xiàn)性好，分離能力差 多元展開劑：可改善分離效果，重現(xiàn)性差多元展開劑：可改善分離

8、效果，重現(xiàn)性差展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化優(yōu)化原則：優(yōu)化原則：先調(diào)整展開劑極性使待測組分先調(diào)整展開劑極性使待測組分R Rf f值適中，保持這個(gè)極性不變，改變展開劑的值適中，保持這個(gè)極性不變，改變展開劑的選擇性，直至所有組分有合適的分離度選擇性，直至所有組分有合適的分離度Stahl圖解法圖解法展開劑展開劑極性極性非極性非極性V活性活性I吸附劑吸附劑待測物待測物非極性非極性極性極性展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化Rf值的決定因素：值的決定因素：組分極性組分極性展開劑的極性展開劑的極性 吸附劑的活性吸附劑的活性38 加入少量的酸堿加入少量的酸堿常用酸：常用酸：甲酸、冰醋酸甲酸、冰醋酸常用堿：常用堿：濃氨

9、水濃氨水、乙二胺、乙二胺展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化 展開劑用量：展開劑用量：展開劑浸沒薄板下端約展開劑浸沒薄板下端約0.5cm0.5cm39常用展開系統(tǒng)常用展開系統(tǒng)人參皂苷、黃芪甲苷：人參皂苷、黃芪甲苷：氯仿氯仿-甲醇甲醇-水（水（65：35：10，下層），下層）正丁醇正丁醇-醋酸乙酯醋酸乙酯-水（水（4：1：5，上層），上層）黃酮苷：黃酮苷：醋酸乙酯醋酸乙酯-丁酮丁酮-甲酸甲酸-水（水（10：1：1：1）糖：糖：正丁醇正丁醇-冰醋酸冰醋酸-水（水（4 4：1 1：5 5，上層），上層）展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化中等極性：中等極性：甲苯甲苯-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲酸甲酸（1010：3 3：0

10、.5)0.5) 40苯苯醋酸乙酯醋酸乙酯甲醇甲醇異丙醇異丙醇濃氨水濃氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化413 3、展開過程的控制、展開過程的控制（1）展開方式：多次、分步展開）展開方式：多次、分步展開ABAB一次展開一次展開多次展開多次展開原因：低極性低沸點(diǎn)物質(zhì)在薄層板邊緣易揮發(fā)原因：低極性低沸點(diǎn)物質(zhì)在薄層板邊緣易揮發(fā)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)克服辦法：克服辦法： a “預(yù)飽和預(yù)飽和” b 層析缸內(nèi)壁貼浸濕的濾紙條層析缸內(nèi)壁貼浸濕的濾紙條 c 點(diǎn)樣時(shí)不要太靠邊緣點(diǎn)樣時(shí)不要太靠邊緣展開過程的控制展開過程的控制（2 2）溶劑蒸氣的飽和程度）溶劑蒸氣的飽和程度43（3

11、3）濕度）濕度相對濕度硫酸（ml）+水（ml）32%6810042%5710058%39.510065%3410072%27.510088%1.8100（4 4）溫度）溫度展開過程的控制展開過程的控制441、定位方法：日光檢視、定位方法：日光檢視 紫外光紫外光365nm下檢視下檢視 紫外光紫外光254nm下檢視下檢視檢檢 測測熒光淬熒光淬滅斑點(diǎn)滅斑點(diǎn)45a 噴霧顯色噴霧顯色注意：噴霧顯色前展開劑須注意：噴霧顯色前展開劑須揮干揮干 噴霧宜噴霧宜細(xì)而均勻細(xì)而均勻 b 浸漬顯色浸漬顯色注意：注意： 浸漬液溶劑易揮發(fā)，否則斑點(diǎn)擴(kuò)散浸漬液溶劑易揮發(fā)，否則斑點(diǎn)擴(kuò)散 浸漬時(shí)間為幾秒浸漬時(shí)間為幾秒檢檢 測測2

12、 2、顯色劑：與待測物質(zhì)反應(yīng)生成有色化合物、顯色劑：與待測物質(zhì)反應(yīng)生成有色化合物46 1） 加熱加熱 加熱時(shí)應(yīng)把握好時(shí)間和溫度，特加熱時(shí)應(yīng)把握好時(shí)間和溫度，特別在定量時(shí)應(yīng)注意別在定量時(shí)應(yīng)注意(常常510min) 2）防止顯色后褪色）防止顯色后褪色加熱顯色后的板加熱顯色后的板蓋上一潔凈的玻板并封蓋上一潔凈的玻板并封邊，放邊，放置于干燥器中置于干燥器中注意：注意：檢檢 測測47四、高效薄層色譜法（四、高效薄層色譜法（HPTLCHPTLC）高效薄層板：粒度高效薄層板：粒度510m m 普通板：普通板：1040m m特點(diǎn)：點(diǎn)樣量小，展距短，特點(diǎn)：點(diǎn)樣量小，展距短， 斑點(diǎn)集中，分離度好，斑點(diǎn)集中，分離度

13、好， 靈敏度高靈敏度高48五、聚酰胺薄層色譜法五、聚酰胺薄層色譜法聚酰胺色譜是分離黃酮類是最有效的方法聚酰胺色譜是分離黃酮類是最有效的方法常用溶劑系統(tǒng)常用溶劑系統(tǒng)苷元：氯仿苷元：氯仿- -甲醇（甲醇（9696：6 6） 氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -甲酸（甲酸（3030：2020：1 1） 苷：苷： 甲醇甲醇- -水（水（4 4：1 1） 30%30%60%60%醋酸醋酸49六、紙色譜法六、紙色譜法1、載體：紙、載體：紙 固定相：纖維素結(jié)合的固定相：纖維素結(jié)合的水水，屬屬正相正相分配色譜分配色譜 展開劑：有機(jī)溶劑（正丁醇）展開劑：有機(jī)溶劑（正丁醇）2 2、適用：極性化合物（多糖）、適用：極性化合

14、物（多糖）CHOC-OHHCHOH-CH-OHCH-OHCH -OH2CHOCHOH-CH-OHCH-OHOH-CHCH3CHOCH-OHCH-OHCH-OHCH 2CH3葡萄糖葡萄糖鼠李糖鼠李糖毛地黃毒糖毛地黃毒糖極性極性最強(qiáng)最強(qiáng)其次其次最弱最弱Rf值值最小最小其次其次最大最大3、Rf值與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系：值與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系：51樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理七、薄層色譜法的應(yīng)七、薄層色譜法的應(yīng)用用52依據(jù)：固定色譜條件下，相同物質(zhì)的依據(jù)：固定色譜條件下，相同物質(zhì)的Rf值相同值相同1供試品供試品 2對照藥材對照藥材 3對照品對照品4 陰性對照陰性對照1 2 3 4（一）定性鑒別（一）定性鑒別

15、531、 限量檢查限量檢查如：附子中烏頭堿的限量檢查如：附子中烏頭堿的限量檢查1. 烏頭堿對照品烏頭堿對照品2，3，4. 樣品樣品1 2 3 4（二）定量分析（二）定量分析2 2、洗脫測定法、洗脫測定法準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取直線狀點(diǎn)樣，直線狀點(diǎn)樣，置于置于層析缸層析缸中，展至中，展至14cm14cm，取出晾干，于紫外燈下，取出晾干，于紫外燈下，用針將用針將R Rf f值約為值約為0.40.4的鹽酸嗎啉雙胍譜帶劃的鹽酸嗎啉雙胍譜帶劃出，出，用刮刀將譜帶全部刮入用刮刀將譜帶全部刮入100 ml100 ml容量瓶容量瓶中，中，準(zhǔn)確加入準(zhǔn)確加入50ml50ml蒸餾水，振搖蒸餾水，振搖靜置靜置離心。準(zhǔn)確吸取上清液離心。準(zhǔn)確