阿立哌唑微生物限度檢查法驗(yàn)證方案

1、kh1110005-01-2 一清 微生物計(jì)數(shù)方法再驗(yàn)證方案 第3頁 共4頁 阿立哌唑微生物限度檢查法驗(yàn)證方案文件編碼hd1109010-00-2copy 安裝位置房間號(hào)起草人日期驗(yàn)證小組會(huì)簽項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：驗(yàn)證管理員：qc室主任：qa室主任：設(shè)備動(dòng)力室主任：質(zhì)量部經(jīng)理：日期：日期：日期：日期：日期：日期：驗(yàn)證記載 批準(zhǔn)日期 執(zhí)行日期 00分發(fā)單位藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理文件 hd1109009-00-2 阿立哌唑微生物限度檢查法驗(yàn)證方案 第 9 頁 共 9頁 1 主題內(nèi)容 本方案規(guī)定了阿立哌唑微生物限度檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗(yàn)證。2 適用范圍：本方案適用于阿立哌唑微生物限度檢查

2、。3 職責(zé)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)起草驗(yàn)證方案及實(shí)施，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。驗(yàn)證管理員：起草驗(yàn)證方案，負(fù)責(zé)驗(yàn)證協(xié)調(diào)工作，收集驗(yàn)證資料、數(shù)據(jù)并出具驗(yàn)證報(bào)告。qc室主任：負(fù)責(zé)審核驗(yàn)證方案，并監(jiān)督驗(yàn)證方案實(shí)施。qa主任： 負(fù)責(zé)審核驗(yàn)證方案。質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的批準(zhǔn)。4 概述 根據(jù)中華人民共和國藥典2010版的規(guī)定，阿立哌唑需進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌的測(cè)定，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，特制定本方案對(duì)阿立哌唑的微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)中國藥典2010年版一部附錄xc“微生物限度檢查法”指導(dǎo)，驗(yàn)證管理規(guī)程、阿立哌唑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、微生物限度檢查sop，對(duì)阿立哌唑的微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。

3、5 驗(yàn)證目的：通過阿立哌唑微生物限度方法的驗(yàn)證，確保所采用的微生物限度檢查方法適合于阿立哌唑的微生物限度檢查，確保檢驗(yàn)在結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。6 驗(yàn)證內(nèi)容：細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法、控制菌檢查方法 供試液的制備-細(xì)菌（試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組）-霉菌和酵母菌（試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組）-控制菌檢查方法（菌液制備、供試液對(duì)照組、試驗(yàn)組、陰性菌對(duì)照組、陰性對(duì)照組）6.1 菌種驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特征。 大腸埃希菌 （escherichia coli） cm

4、cc（b）44 102 金黃色葡萄球菌 （staphylococcus aureus） cmcc（b）26 003 枯草芽孢桿菌 （bacillus subtilis） cmcc（b）63 501白色念珠菌 （candida albicans） cmcc（f）98 001黑曲霉 （asprgillus niger） cmcc（f）98 0036.2 菌液制備 （見附表一）6.2.1 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)3035培養(yǎng)1824小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml, 分別制成10-1、10-2、10-3、10-4、

5、10-5、10-6、10-7、10-8菌懸液，再分別取各稀釋級(jí)的菌懸液1ml, 注入平皿中,傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 搖勻，凝固,經(jīng)3035培養(yǎng)1824h,取出計(jì)數(shù)。每種菌種各稀釋級(jí)平行制備2個(gè)平皿。取計(jì)數(shù)范圍在50100cfu菌懸液為驗(yàn)證時(shí)的使用菌液。6.2.2 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)2328培養(yǎng)2448小時(shí)，取改良馬丁培養(yǎng)物1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml, 10倍遞增稀釋至每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液為驗(yàn)證時(shí)的使用菌液。6.2.3 接種黑曲霉菌液時(shí),關(guān)掉凈化工作臺(tái)風(fēng)機(jī),操作時(shí)靠近酒精燈,輕拿輕放。將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)2

6、328培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花）至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至每1ml含孢子數(shù)為50100cfu的孢子懸液為驗(yàn)證時(shí)的使用菌液。6.2.4 操作完畢后的菌液和使用過的器具經(jīng)121濕熱滅菌30分鐘，再作清潔處理，并對(duì)操作臺(tái)面進(jìn)行消毒和清潔處理。6.3供試液的制備取阿立哌唑10g，加入在100mlph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中，45水浴保溫，使完全溶化，振搖后，作為1：10供試液。 7 驗(yàn)證方法：進(jìn)行3次獨(dú)立平行試

7、驗(yàn),分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。7.1細(xì)菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（試驗(yàn)組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml大腸埃希菌備用菌液，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組照大腸埃希菌試驗(yàn)組同法制備。（菌液組）取大腸埃希菌菌備用菌液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液組照大腸埃希菌菌液組同法制備。（供試品對(duì)照組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培

8、養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。（稀釋劑對(duì)照組）取ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml大腸埃希菌備用菌液，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌稀釋劑對(duì)照組照大腸埃希菌稀釋劑對(duì)照組同法制備。7.2 霉菌和酵母菌 白色念珠菌、黑曲霉（試驗(yàn)組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml白色念珠菌備用菌液，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。 黑曲霉試驗(yàn)組照白色念珠菌試驗(yàn)組同法制備。（菌液

9、組）取白色念珠菌備用菌液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。 黑曲霉菌液組照白色念珠菌菌液組同法制備。 （供試品對(duì)照組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。（稀釋劑對(duì)照組）取ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml白色念珠菌備用菌液，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。同法再制備1份平行樣。 黑曲霉稀釋劑對(duì)照組照白色念珠菌稀釋劑對(duì)照組同法制備。 7.3 結(jié)果判

10、斷：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70，應(yīng)應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。8 控制菌檢查方法的驗(yàn)證8.1 供試液對(duì)照組：取1:10供試液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置3035培養(yǎng)1824小時(shí)，取培養(yǎng)后的膽鹽乳糖培養(yǎng)基0.2ml，接種至5mlm

11、ug培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366mm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的mug培養(yǎng)基作本底對(duì)照。管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為mug陽性；不呈現(xiàn)熒光，為mug陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入23滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為mug陰性和靛基質(zhì)陰性。若mug、靛基質(zhì)同為陽性，則判檢出；若均為陰性，則判未檢出；若有一項(xiàng)陰性則取膽鹽乳糖的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無菌生長(zhǎng)或與形態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)不符，則判未檢出，若相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色、鏡檢及適宜的鑒定試驗(yàn)。8.2 試驗(yàn)組：取1:10供試

12、液10ml和大腸埃希菌備用菌液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。8.3 陰性菌對(duì)照組：取金黃色葡萄球菌備用菌液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。8.4 陽性菌對(duì)照組：取大腸埃希菌備用菌液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。8.5 陰性對(duì)照組取ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10ml加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。8.6 結(jié)果判斷陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品

13、的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。附表一 菌液制備記錄營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基批號(hào)： 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基批號(hào)： 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基批號(hào)： 氯 化 鈉 批 號(hào)： 改良馬丁培養(yǎng)基批號(hào)： 名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉代數(shù)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)溫度稀釋級(jí)皿號(hào)1皿號(hào)2皿號(hào)1皿號(hào)2皿號(hào)1皿號(hào)2皿號(hào)1皿號(hào)2皿號(hào)1皿號(hào)210-110-210-310-410-510-610-710-8選用稀釋級(jí)檢驗(yàn)人： 復(fù)核人： 日期： 附表二 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄供 試 品 批 號(hào)： 玫瑰紅鈉瓊脂

14、培養(yǎng)基批號(hào)： 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基批號(hào)： 一、大腸埃希菌（選用稀釋級(jí)： ）培養(yǎng)時(shí)間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設(shè)備型號(hào)： 溫度： 試驗(yàn)組菌液組供試液對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組回收率=稀釋劑對(duì)照組/菌液組100%試驗(yàn)組回收率=（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組100%皿號(hào)1皿號(hào)2 平均菌落數(shù)檢驗(yàn)人： 復(fù)核人： 日期： 二、金黃色葡萄球菌（選用稀釋級(jí)： ）培養(yǎng)時(shí)間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設(shè)備型號(hào)： 溫度： 試驗(yàn)組菌液組供試液對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組回收率=稀釋劑對(duì)照組/菌液組100%試驗(yàn)組回收率=（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組100%皿號(hào)1皿號(hào)2 平均菌落數(shù)檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：

15、日期： 三、枯草芽孢桿孢菌（選用稀釋級(jí)： ）培養(yǎng)時(shí)間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設(shè)備型號(hào)： 溫度： 試驗(yàn)組菌液組供試液對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組回收率=稀釋劑對(duì)照組/菌液組100%試驗(yàn)組回收率=（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組100%皿號(hào)1皿號(hào)2 平均菌落數(shù)結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人： 日期： 四、白色念珠菌（選用稀釋級(jí)： ）培養(yǎng)時(shí)間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設(shè)備型號(hào)： 溫度： 試驗(yàn)組菌液組供試液對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組回收率=稀釋劑對(duì)照組/菌液組100%試驗(yàn)組回收率=（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組100%皿號(hào)1皿號(hào)2 平均菌落數(shù)檢驗(yàn)人： 復(fù)核人： 日期： 五、黑曲霉（選用稀釋級(jí)： ）培養(yǎng)時(shí)間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設(shè)備型號(hào)： 溫度： 試驗(yàn)組菌液組供試液對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組回收率=稀釋劑對(duì)照組/菌液組100%試驗(yàn)組回收率=（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組100%皿號(hào)1皿號(hào)2 平均菌落數(shù)結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人： 日期： 附表三：控制菌檢查方法驗(yàn)證記錄供 試 品 批 號(hào)： 膽鹽乳糖培養(yǎng)基批號(hào)： mug培養(yǎng)基批號(hào)： 大腸埃希菌檢查（培養(yǎng)時(shí)間： 年 月 日 至