外源基因在畢赤酵母中表達水平的預測

1、本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!a 外源基因在畢赤酵母中表達水平的預測外源基因在畢赤酵母中表達水平的預測a 表達產(chǎn)物的表達產(chǎn)物的sds聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定 a 分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達的概率分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達的概率綜合性設計性實驗綜合性設計性實驗-2-2本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!1.1. 第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達的預測第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達的預測2.2. 第二部分：畢赤酵母蛋白表達產(chǎn)物的第二

2、部分：畢赤酵母蛋白表達產(chǎn)物的sds聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定胺凝膠電泳分離分析鑒定3.3. 第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達的概率達的概率此實驗共包括如下三個部分此實驗共包括如下三個部分本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!在科研和臨床中需要大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白不可能由人體組織或體外細胞培養(yǎng)而大在科研和臨床中需要大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白不可能由人體組織或體外細胞培養(yǎng)而大規(guī)模的獲得，人們利用一些低等生物的特點，來生成和獲得這些人屬蛋白質(zhì)。規(guī)模的獲得，人們利用一些低等生物的特點，來生成

3、和獲得這些人屬蛋白質(zhì)。酵母菌是單細胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯后加酵母菌是單細胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點，被認為是表達外源蛋白的合適宿主。工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點，被認為是表達外源蛋白的合適宿主。幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母(pichia pastoris, pp)，因具有旺盛的生長力以及其，因具有旺盛的生長力以及其它一些獨特的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達系統(tǒng)。畢赤酵母以甲醇為營它一些獨特的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達系統(tǒng)。畢赤酵母以甲醇為營

4、養(yǎng)來源。養(yǎng)來源。由畢赤酵母表達應用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原由畢赤酵母表達應用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原(hbsag)、腫瘤、腫瘤壞死因子壞死因子(tnf)、表皮生長因子、表皮生長因子(egf)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。、人血清白蛋白，以及多種抗體等。第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達的預測第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達的預測本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!微觀的酵母細胞微觀的酵母細胞本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!5aox1 啟動子片段含有啟動

5、子片段含有aox1啟動子，在甲醇的誘啟動子，在甲醇的誘導下可啟動外源蛋白的表達；導下可啟動外源蛋白的表達； -因子信號肽序列為約因子信號肽序列為約89個氨基酸的信號肽序列，個氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；的純化； 多克隆位點含多個酶切位點，為外源基因的插入提多克隆位點含多個酶切位點，為外源基因的插入提供位點；供位點； tt序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polya修飾信號；修飾信號； his4為營養(yǎng)缺陷型篩選標志；為營養(yǎng)缺陷型篩選標志； 3 aox1 基因片段能夠與基因組基因片段能夠與基因組a

6、ox1基因?qū)偻椿驅(qū)偻粗亟M；重組； 抗抗amp 基因和基因和pbr322能使空載體和構建的表達載能使空載體和構建的表達載體在體在e.coli中篩選和復制。中篩選和復制。畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用載體的基本結構畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用載體的基本結構本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!ppic9載體的信號肽序列和多克隆位點載體的信號肽序列和多克隆位點本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!1. 載體的載體的3 aox1區(qū)與基因組的區(qū)與基因組的aox1基因的末端發(fā)生整合重組基因的末端發(fā)生整合重組表達載體與畢赤酵母基

7、因表達載體與畢赤酵母基因組發(fā)生重組的兩種方式：組發(fā)生重組的兩種方式：2. 載體的載體的his4區(qū)與基因組的區(qū)與基因組的his4基因的末端發(fā)生整合重組基因的末端發(fā)生整合重組本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素載體穩(wěn)定性：是整合還是粘附到酵母染色體上基因劑量：單/多拷貝甲醇利用表型：muts(利用甲醇慢型)， mut+ (利用甲醇快型)mrna5端：應盡量避免在utr區(qū)出現(xiàn)aug和次級結構at含量：at含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的結構表達產(chǎn)物穩(wěn)定性：分泌表達時，胞外蛋白酶是要影響因素本文由探

8、生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!外源基因的外源基因的3末端的最低自由能穩(wěn)定性對于實現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中成功高效表達是比末端的最低自由能穩(wěn)定性對于實現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中成功高效表達是比較重要的因素，汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民教授課題組聯(lián)合北京較重要的因素，汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民教授課題組聯(lián)合北京軍事醫(yī)學科學院李伍舉教授課題組建立了一個針對軍事醫(yī)學科學院李伍舉教授課題組建立了一個針對ppic9表達載體在畢赤酵母中高效表達表達載體在畢赤酵母中高效表達的數(shù)學模型。的數(shù)學模型。本文由探生科技技術人員提供,fanti

9、body全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!模型構建原理模型構建原理收集收集40例應用例應用ppic9載體在畢赤酵母載體在畢赤酵母gs115株中表達目的基因的數(shù)據(jù)。擬定以表達量株中表達目的基因的數(shù)據(jù)。擬定以表達量100 mg/l為界限，將為界限，將40例目的基因表達水平分為高例目的基因表達水平分為高/低兩組。低兩組。確認表達載體的翻譯終止密碼子前后各確認表達載體的翻譯終止密碼子前后各100bp的序列，據(jù)此對每個數(shù)據(jù)構建的序列，據(jù)此對每個數(shù)據(jù)構建200bp的片段。的片段。從上述每個基因的從上述每個基因的200bp片段，截取片段，截取9,000個區(qū)間，截取方式為個區(qū)間，截取方式為x, y, x和和

10、y在在200bp片段的片段的范圍為范圍為1x100, 和和111y200。使用使用rnafold軟件對每個區(qū)間計算最低自由能，構建最低自由能矩陣。軟件對每個區(qū)間計算最低自由能，構建最低自由能矩陣。使用使用tclass程序?qū)ψ畹妥杂赡芫仃囘M行程序?qū)ψ畹妥杂赡芫仃囘M行t檢驗及判別分析，得到理論上可以判別表達水平高檢驗及判別分析，得到理論上可以判別表達水平高低的低的6個區(qū)間組合。個區(qū)間組合。本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!我們將我們將40例數(shù)據(jù)按例數(shù)據(jù)按75的比例隨機分成兩組，多數(shù)組應用上述的比例隨機分成兩組，多數(shù)組應用上述6個區(qū)間來建立判別函數(shù)，個

11、區(qū)間來建立判別函數(shù)，如此重復如此重復1,000次，這樣我們得到了次，這樣我們得到了1,000個判別函數(shù)，如第一個判別函數(shù)為：個判別函數(shù)，如第一個判別函數(shù)為： heg1=20.202030.52552x12.35843x21.53122x32.24870x41.19898x51.53908x6 (1) leg1=14.370280.00749x10.04135x20.87256x32.02204x40.15215x5 0.74495x6 (2)這里的這里的x1, x2, x3, x4, x5 和和x6分別代表區(qū)間分別代表區(qū)間18,123，31,140，35,150，90,118，90,151和和

12、95,135的用的用rnafold軟件計算的最低自由能（計算溫度參數(shù)設為軟件計算的最低自由能（計算溫度參數(shù)設為30）。）。對于每個新數(shù)據(jù)，為了預測該基因是否能在酵母中高效表達（表達水平大于對于每個新數(shù)據(jù)，為了預測該基因是否能在酵母中高效表達（表達水平大于100 mg/l），可先計算這），可先計算這6個區(qū)間的最低自由能，然后運算上述的個區(qū)間的最低自由能，然后運算上述的1,000個判別函數(shù)，來評個判別函數(shù)，來評估該基因高效表達的概率。如果在這估該基因高效表達的概率。如果在這1,000次的判別分析中，有次的判別分析中，有500次或以上的次或以上的heg1大大于于leg1，那么這個外源基因為一個表達水

13、平大于，那么這個外源基因為一個表達水平大于100 mg/l的基因，否則就是個表達的基因，否則就是個表達水平低于水平低于100 mg/l的基因。的基因。 本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!外源基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達預測的網(wǎng)頁服務器外源基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達預測的網(wǎng)頁服務器http:/ 本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!分析流程：分析流程：1.在在“sequence”方框中輸入由目的基因末端方框中輸入由目的基因末端100bp及其后面的載體及其后面的載體100bp組成的組成的200bp

14、序列片段；序列片段；2. 點擊底下的點擊底下的“evaluation”按鈕，在按鈕，在“evaluation”方框中顯示預測的結果；方框中顯示預測的結果；3.如果結果顯示低于如果結果顯示低于0.5，則可點擊，則可點擊“design”這個按鈕，則顯示根據(jù)密碼子使用改造后的序列。這個按鈕，則顯示根據(jù)密碼子使用改造后的序列。本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!用該軟件來預測用該軟件來預測ngal在畢赤酵母高效表達的概率在畢赤酵母高效表達的概率截取截取ngal cdna 3末端最后末端最后100bp堿基（包括終止密碼子堿基（包括終止密碼子tga），與），與

15、ppic9載載體體ecor i位點后位點后100bp堿基（包括堿基（包括ecor i位點）組成位點）組成200bp的序列片段，的序列片段，用用rnafold軟件計算軟件計算18,123, 31,140, 35,150, 90,118, 90,151和和95,135 六個六個區(qū)間的最低自由能（區(qū)間的最低自由能（rnafold的溫度參數(shù)設為的溫度參數(shù)設為30）。）。其數(shù)值運算于其數(shù)值運算于1,000個判別函數(shù)，結果表明個判別函數(shù)，結果表明ngal在畢赤酵母中高效表達的概率在畢赤酵母中高效表達的概率為為0.512，雖然，雖然0.512僅略高于僅略高于0.5，但我們?nèi)韵胪ㄟ^表達這個基因來驗證酵母高效，

16、但我們?nèi)韵胪ㄟ^表達這個基因來驗證酵母高效表達的數(shù)學模型。表達的數(shù)學模型。本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!學習學習sds-page測定蛋白質(zhì)分子量的原理測定蛋白質(zhì)分子量的原理掌握垂直板電泳的操作方法掌握垂直板電泳的操作方法 了解蛋白印跡技術原理和方法了解蛋白印跡技術原理和方法實驗目的實驗目的第二部分，畢赤酵母蛋白表達產(chǎn)物的第二部分，畢赤酵母蛋白表達產(chǎn)物的sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定凝膠電泳分離分析鑒定 本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這

17、種現(xiàn)象稱為電泳。帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（page）和瓊脂糖凝膠。）和瓊脂糖凝膠。電泳的概念和分類電泳的概念和分類本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱acr)和交聯(lián)

18、劑n,n-甲叉雙丙烯酰胺(n,n-methylene-bisacylamide，簡稱bis)在加速劑n,n,n,n-四甲基乙二胺(n,n,n,n-tetramethyl ethylenedia mine，簡稱temed)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (nh4)2s2o8，簡稱ap)或核黃素(ribofavin即vita min b2，c17h20o6n4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱page)。單體丙烯酰胺和單體丙烯酰胺和n,n-甲叉雙丙

19、烯酰胺的聚合甲叉雙丙烯酰胺的聚合催化劑催化劑acrbis本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷。sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進sds（十二烷基硫酸鈉）。1967年，shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（sds），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。sds-page的原理的原理sds的分子式的分子式本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!sds是

20、一種陰離子去垢劑，so32-帶負電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強還原劑的sds溶液中與sds分子結合時，可形成sds-蛋白質(zhì)復合物。這種復合物由于結合大量帶負電荷的sds，好比蛋白質(zhì)穿上帶負電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用。sds能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，使蛋白復合物分解成多個亞基。因此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)（亞基）分子大小。使聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應。sds的作用的作用本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體

21、專家!當分子量在當分子量在15kd到到200kd之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：logmw=k-bx式中：式中：mw為分子量，為分子量，x為遷移率，為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。移率即可在標準曲線上求得分子量。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白

22、）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在在sds和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量。的亞基或單條肽鏈的分子量。分子量分子量相對遷移率相對遷移率本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!被分離物質(zhì)分子量與凝膠濃度的選擇分子量范圍 適用的凝膠濃度(%)蛋 白 質(zhì)104 20-301-410415-201-5104-110510-1511055

23、-1051052-5核 酸(dna/rna) 104 15-201041055-10 105-21062-2.6本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!按照緩沖液的ph值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類： 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液ph值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應分離。 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、ph、凝膠濃度以及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳分類：聚丙烯酰胺凝膠電泳分

24、類：本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由ap催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為ph6.7的tris-hc1。分離膠是由ap催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為ph8.9 tris-hc1。電極緩沖液是ph8.3 tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種ph值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、ph值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。不連續(xù)系統(tǒng)的特點不連續(xù)系統(tǒng)的特點本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!濃縮膠的作用濃縮膠的作用

25、濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當樣品液和濃縮膠選tris/hcl緩沖液，電級液選tris/甘氨酸。電泳開始后，hcl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區(qū)，而電場強度與低電導區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索

26、引擎，您身邊的抗體專家!a. 為電泳前為電泳前2層凝膠排列順序，層凝膠排列順序，2層膠中均有快離子，慢離子層膠中均有快離子，慢離子b. 顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。c. 顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。電泳中離子運動示意圖電泳中離子運動示意圖本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種用抗原抗體的特異性結合來檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學技術方法。 蛋白質(zhì)印跡（蛋白質(zhì)印跡（western

27、 blotting）的概念）的概念本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素/pvdf膜上，然后與能特膜上，然后與能特異性識別待檢測蛋白的一抗（針對待測分子的單克隆抗體或多克隆抗體）進行反應；異性識別待檢測蛋白的一抗（針對待測分子的單克隆抗體或多克隆抗體）進行反應；洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入二抗（針對一抗的抗體，標記有放射性同位洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入二抗（針對一抗的抗體，標記有放射性同位素或生物素）；素或生物素）；反應一段時間后

28、再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。行特異性蛋白的半定量。蛋白印跡基本步驟蛋白印跡基本步驟本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!1.固體相上的蛋白質(zhì)固體相上的蛋白質(zhì)2.針對蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗針對蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗3.帶上辣根過氧化物酶針對一抗的抗體，稱為二抗帶上辣根過

29、氧化物酶針對一抗的抗體，稱為二抗4.加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!垂直電泳系統(tǒng)垂直電泳系統(tǒng)本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!陽極陽極陰極陰極濾紙濾紙凝膠凝膠膜膜多孔墊片多孔墊片轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)各組件及其位置轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)各組件及其位置本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!ngal（neutr

30、ophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運）即中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白，是脂質(zhì)運載蛋白（載蛋白，是脂質(zhì)運載蛋白（lipocalin) 家族的一個成員。家族的一個成員。ngal基因的蛋白產(chǎn)物具有保護調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶基因的蛋白產(chǎn)物具有保護調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，作為小分子鐵配合的活性，作為小分子鐵配合物結合蛋白參與機體鐵代謝和天然免疫反應等功能。另外，物結合蛋白參與機體鐵代謝和天然免疫反應等功能。另外，ngal作為一種早期標作為一種早期標志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。 ngal的

31、的mrna信息在信息在ncbi核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本，包含核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本，包含完整編碼區(qū)的有完整編碼區(qū)的有bc033089和和nm_005564等，編碼區(qū)長為等，編碼區(qū)長為597 bp，編碼，編碼198個氨基酸，個氨基酸，包含了包含了n端前部長為端前部長為20個氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的個氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的1-60 bp）。）。ngal基因的簡介基因的簡介本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!ngal核酸編碼區(qū)序列及其相應的蛋白序列：核酸編碼區(qū)序列及其相應的蛋白序列：本文由探生科技技

32、術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!由由n 端的端的310螺旋、螺旋、c 端的端的螺旋和中間的八段反平行式螺旋和中間的八段反平行式折疊構成了一個折疊構成了一個折疊桶折疊桶結構；結構；在在折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個疏水核折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個疏水核或疏水內(nèi)部，為結合親脂性配體提供了位點；或疏水內(nèi)部，為結合親脂性配體提供了位點；ngal 在其在其折疊桶封閉端的折疊桶封閉端的4-5 環(huán)上有游離的巰基環(huán)上有游離的巰基(c87)，這可使，這可使ngal 與一與一些蛋白質(zhì)分子，如些蛋白質(zhì)分子，如mmp

33、-9，形成分子間二硫鍵，并以此來調(diào)節(jié)這些蛋白的功能或，形成分子間二硫鍵，并以此來調(diào)節(jié)這些蛋白的功能或活性。活性。ngal的蛋白三級結構（圖為的蛋白三級結構（圖為ngal蛋白的同源二聚體）：蛋白的同源二聚體）：本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!以往，汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民教授課題組利用大腸桿菌原以往，汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民教授課題組利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得了核表達系統(tǒng)獲得了ngal蛋白，但是由原核表達系統(tǒng)對外源蛋白沒有類似真核細胞中的蛋白，但是由原核表達系統(tǒng)對外源蛋白沒有類似真核細胞中的蛋白修飾，

34、如磷酸化和糖基化，有可能影響這些蛋白在功能研究實驗中的效果，為此，蛋白修飾，如磷酸化和糖基化，有可能影響這些蛋白在功能研究實驗中的效果，為此，我們選擇了畢赤酵母這種真核表達系統(tǒng)來表達我們選擇了畢赤酵母這種真核表達系統(tǒng)來表達ngal蛋白。蛋白。由大腸桿菌表達獲得的由大腸桿菌表達獲得的ngal蛋白蛋白本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!實驗步驟實驗步驟 獲得含目的蛋白的酵母上清獲得含目的蛋白的酵母上清 sds-page電泳電泳 蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!利用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行

35、利用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行ngal蛋白外源表達進行驗證的蛋白外源表達進行驗證的實驗技術路線：實驗技術路線：構建表達載體構建表達載體轉(zhuǎn)化至酵母菌中轉(zhuǎn)化至酵母菌中篩選陽性轉(zhuǎn)化單克隆篩選陽性轉(zhuǎn)化單克隆篩選高篩選高表達單克隆表達單克隆本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!挑單克隆挑單克隆于培養(yǎng)液于培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)3 35 5天，加甲醇天，加甲醇誘導目的蛋白的表達誘導目的蛋白的表達離心離心酵母上清酵母上清本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準備2個干凈的小燒杯；2.把玻璃板在灌膠

36、支架上固定好，放好密封條和隔離板, 固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板;3.按照下表配制12分離膠與4濃縮膠；4.樣品的制備：樣品和標準蛋白分別與5倍上樣緩沖液按5：1的比例混勻，并在100度沸水浴中煮5min，取出待用；sds-page凝膠的制作凝膠的制作本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!分離膠(12%)濃縮膠(4%)超純水3.3 ml3 ml30% acr/bis4 ml0.66mlbuffer1.5mol/l ph=8.8 tris-hcl 2.5ml0.5mol/l ph=6.8 tris-hcl 1.25ml10% sds

37、100 l50 l10% ap50 l25 ltemed5 l5 l 凝膠的成分凝膠的成分聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!5.按比例配好分離膠,用移液管快速加入，大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡），靜置至膠凝固；凝膠配制過程要迅速, 催化劑temed要在注膠前再加入，否則凝結無法注膠。注膠過程 最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡；水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡；膠凝好的標志：膠與水層之間形成清晰的界面；6.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠

38、，連續(xù)平穩(wěn)加入縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入梳子，靜置到膠凝固。 梳子需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡,梳底需水平。本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!7.拔出樣梳后,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液；8.上樣： marker 5 l 樣品20 l + 5上樣buffer 5l 共25l 上樣時要記清上樣的順序 微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高, 樣品下沉時易發(fā)生擴散，溢出加樣孔本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!10. 接通電源，100v恒壓電泳，至溴酚藍距凝膠邊緣約0.51cm時，約2.5

39、h，停止電泳；11. 凝膠的處理：剝離與染色：電泳結束后，撬開玻璃板，剝膠時要小心,保持分離膠完好無損,將分離膠做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍染色染色液，染色約4h；染色后的凝膠板用脫色液脫色0.5h，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。蛋白質(zhì)印跡操作本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!將將pvdf膜先置于膜先置于100%甲醇中浸濕甲醇中浸濕15s，然后移至超純水中浸泡，然后移至超純水中浸泡2min，最后轉(zhuǎn)，最后轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中至少平衡至轉(zhuǎn)移液中至少平衡5min；電泳完畢的凝膠，剝落到轉(zhuǎn)移液中平衡電泳完畢的凝膠，剝落到轉(zhuǎn)移液中平衡30min，將轉(zhuǎn)印用的濾紙和

40、海綿墊均用，將轉(zhuǎn)印用的濾紙和海綿墊均用轉(zhuǎn)移液浸濕；轉(zhuǎn)移液浸濕；將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒搟走里面的將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒搟走里面的氣泡，在墊子上墊氣泡，在墊子上墊2張張1010 cm的濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡；的濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡；從轉(zhuǎn)移液中取出平衡好的分離膠蓋于濾紙上，用玻棒搟去氣泡，將平衡好的從轉(zhuǎn)移液中取出平衡好的分離膠蓋于濾紙上，用玻棒搟去氣泡，將平衡好的pvdf膜蓋于膠上，并去除氣泡；膜蓋于膠上，并去除氣泡；在膜上蓋在膜上蓋2張張7.08.0 cm的濾紙并除去氣泡，最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下的濾紙并除去氣泡，最

41、后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子；就可合起夾子；將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，60v轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移2h，將膜用超純水漂洗一下，室溫晾干，將膜用超純水漂洗一下，室溫晾干；蛋白質(zhì)印跡操作步驟蛋白質(zhì)印跡操作步驟本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!蛋白印跡系統(tǒng)蛋白印跡系統(tǒng)本文由探生科技技術人員提供,fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫檢測的操作免疫檢測的操作將膜用100甲醇浸濕5min，再用超純水漂洗一下，移至含有50ml封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h；將一抗（大鼠抗人ngal單克隆抗體）用封閉液1：200稀釋；鋪保鮮膜于實驗臺面，將抗體溶液（每張膜500l液體）加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育2h；用pbst在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次5min，再用pbs漂洗一次，5min；二抗（山羊抗大鼠igg hrp）用封閉液1：2000稀釋并與膜蛋白面接觸（每張膜500l液體），室溫下孵育2h；用pbs