組織制片技術(shù)原理與流程及切片機的使用

1、組織制片技術(shù)原理與流程及切片機的使用組織制片的特點 組織制片是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科觀察和研究組織、細胞的正常形態(tài) 和病理變化的常用方法。 其基本原理是用固定劑固定組織、 細胞以及各種亞細胞器， 保持組 織的微細結(jié)構(gòu)，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在顯微鏡下觀察組織、 細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)， 或利用化學(xué)或物理方法顯示組織、 細胞內(nèi)的某些化學(xué)成分， 并可進行形態(tài) 和化學(xué)成分的定量分析。 隨著細胞和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 組織制片也為原位顯示細胞內(nèi) 基因表達提供了基礎(chǔ)。一 石蠟包埋切片制作 石蠟不溶于水而溶于二甲苯等有機溶劑， 故固定好的組織須先用乙醇、 丙酮、 正丁醇等

2、脫水劑脫去組織中的水， 后用二甲苯等透明劑置換出乙醇，此過程即脫水、 透明。 再用石蠟 滲入組織塊，冷凝后變硬，即浸蠟、包埋，就可在切片機上切片了。1. 固定 細胞、組織離體后要迅速用相應(yīng)的固定劑固定，使蛋白質(zhì)沉淀、變性、凝固，保持組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性。一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4C并向固定過夜。2. 脫水與透明 固定后的組織須由低濃度到高濃度的乙醇逐級脫水，一般為50%、 70%、 85%、 95%、和 100%（ 3 次）3. 滲蠟與包埋滲蠟是石蠟置換組織塊中透明劑的過程，一般用熔點為52-60 C的石蠟。透明后的組織塊先于1/1體積的二甲苯與石蠟中37C滲透過夜，

3、后溫度調(diào)至58C換入純石蠟繼續(xù)滲透，一般每間隔 3h 換一次純石蠟，直到無二甲苯氣味即可進行包埋。4. 切片與展片先用刀片修去組織塊周圍多余的石蠟，一般保留 2mm 左右的石蠟，修整成梯形的組織 塊，以便于展片時蠟帶的分離。先加熱刀片，后把修好的組織塊快速粘到方形的小木塊上， 冷凝后即可進行切片。一般組織切片的厚度為 6-12um，切片速度以40-50次/min為宜，用毛筆托起蠟帶，分 割后依次放到潔凈的載玻片上， 蠟帶的光滑面朝下放， 后滴上適量的蒸餾水放至展片臺上于 37-40 C烤片過夜。5. 染色、脫水、透明與封片染色一般是雙重染色或單染， 番紅與固綠是常用雙重染色法， 而蘇木精是最優(yōu)

4、良的核染 色劑。具體流程如下所示：番紅-固綠雙重染色法：純二甲苯（20min）宀純二甲苯（20min）1/2酒精+1/2二甲苯（2-3min100%酉精（2-3min95%酉精（2-3min85%酒精（2-3min75%酒精（2-3min50 酒精（2-3min 番紅染液（30-1h50%酒精（30s75%酒精（30s）t85%酒精（30s）t 95%酒精（30s固綠染液（7s） 95%酒精（30s100%酉精（30s）T1/2酒精+1/2二甲苯（30s）7純二甲苯（30s）t純二甲苯（30s風(fēng)干宀封片宀鏡檢 拍照素木精單染法：二甲苯脫蠟至蒸餾水t4%鐵磯（20min ）t水洗4-5次（5mi

5、n/per ）t蒸餾水數(shù)次（2-3min/per ）t 0.5%蘇木精（30min ）t水洗去余色t 2%鐵磯分色t流水沖洗（30-60min ）t 50%酒精（2h）T 70%酒精（1h）T 85%酒精（2h）T 95%酒精（20s ）t 100% 酒精（1-5s ）t 100%酉精（5s）t 1/2 酒精 +1/2 二甲苯（5s）t二甲苯（5s）t二甲苯（5s） T通風(fēng)櫥風(fēng)干T中性樹膠封片T鏡檢番紅 （safranin） 染色液： 堿性染料，染木化、角化、栓化細胞壁及染色體、核仁等。（1）番紅水溶液：配方：番紅1 g ;蒸餾水100m1 用于臨時制片染色，可使木質(zhì)化、栓質(zhì)化的細胞壁及細胞核

6、染成紅色。（2）番紅酒精溶液：配方：番紅 0.5g 或 1g; 50酒精 100ml在植物永久制片中常與固綠、亮綠、苯胺藍做二重染色，或與結(jié)晶紫、橘紅G三重染色，可使木質(zhì)化、角質(zhì)化、栓質(zhì)化的細胞壁及細胞核等呈現(xiàn)不同程度的紅色，效果甚好。固綠（fast green） 染色液：又名快綠。酸性染料，使纖維素細胞壁和細胞質(zhì)呈藍綠色。染 色快，通常1030s即可，不易褪色。配方：固綠 0.5I g ; 95%乙醇100m1番紅 -固綠對染效果：根、莖、葉等組織切片染色后，番紅使細胞核、木質(zhì)化細胞壁呈鮮紅色， 角質(zhì)化細胞壁呈透明粉紅色， 木栓化壁呈褐紅色； 固綠使細胞質(zhì)和具纖維素的細胞 壁呈藍綠色。蘇木精

7、 （hematoxyIin） 染色液： 天然染料，提取自蘇木的心材。經(jīng)其染色，因細胞中結(jié)構(gòu)的 不同而呈現(xiàn)不同深淺顏色“多色性” ，但由于蘇木精與組織親和力差，染色時需加金屬 鹽媒染 （如鐵磯 ）。配方（鐵磯-蘇木精）：甲液：蘇木精 0.5g ;蒸餾水100ml乙液：硫酸鐵銨（鐵磯）24g；蒸餾水100ml可進行細胞學(xué)、 胚胎學(xué)染色，使細胞分裂時期的染色體呈深藍色， 細胞質(zhì)呈淺藍色，細 胞壁介于二者之間。色澤保持長久。二 樹脂包埋切片制作 樹脂包埋切片原用于電鏡切片， 20 世紀 50 年代始用于光鏡切片，樹脂包埋的組織塊硬 度高，可切出 50-80A 的超薄切片和 2-5um 的半超薄切片，切

8、片的質(zhì)量優(yōu)于石蠟切片，細胞 以及亞細胞器結(jié)構(gòu)清晰，輔助于透射電鏡（TEM與光學(xué)顯微鏡能更好的觀察組織器官的細胞以及微管、葉綠體、線粒體、核酸與蛋白顆粒的細微形態(tài)。1. 半超薄切片制作：半超薄切片的厚度一般控制在 2-5um之間，用普通的光學(xué)顯微鏡即可 清晰的觀察組織器官的細胞形態(tài)，具體制作流程如下：取材t固定（戊二醛、FAA多聚甲醛）過夜t 0.1M PBSPH7.2 ）清洗3次（15-20mi n/per ）t 1%我酸固定過夜t 0.1M PBS ( PH7.2 )清洗 3 次(15-20min/per30%丙酮(15-20min )t50%丙酮(15-20min ) t 70%丙酮(15

9、-20min ) t 80儷酮(15-20min ) t90酮(15-20min ) t95%丙酮(15-20min )t 100%丙酮(15-20min )t 100緬酮(15-20min )t 100%丙酮(15-20min ) t2/3 丙酮 +1/3 Spurr s 樹脂(1h)T 1/2 丙酮 +1/2 Spurr s 樹脂(1h)T 1/3 丙酮 +2/3 Spurr s樹脂(1h)T純樹脂滲透過夜t包埋t聚合過夜( 70 C恒溫箱)t切片(2-5um) T展片T染色(甲苯胺藍、亞甲基藍或曙紅對染)T水洗去余色T烤片T鏡檢2. 超薄切片制作：超薄切片是通過透射電鏡(TEM)來觀察組

10、織器官的細胞及亞細胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)，切片厚度一般在 40-100nm 之間，可借助切片在水中的反光判斷其厚薄，以銀白色 至金黃色切片為佳， 藍紫色和紅色的切片過厚，電子速易被吸收， 不利于電鏡觀察，而淺灰 色或透明感的超薄切片， 電子速容易穿透，反差低，電鏡下難以區(qū)分各種細微構(gòu)造，所以超 薄切片技術(shù)是TEM最關(guān)鍵和最基本的技術(shù)，它的制作同石蠟切片相似，亦要經(jīng)過固定、脫水、 浸透、包埋、切片、染色、噴炭等步驟，每步驟的嚴格認真操作是獲得理想結(jié)果的前提，制 作流程如下：取材t 2.5%戊二醛固定過夜t 0.1M PBS( PH7.2 )清洗3次(15-20min/per )t 1%我酸 固定過夜t

11、0.1M PBS ( PH 7.2 )清洗 3 次(15-20min/per )t 30%丙酮(15-20min )t 50% 丙酮(15-20min )t 70%f酮(15-20min )t 80%f酮(15-20min )t 90%酮(15-20min ) t95%丙酮(15-20min )t 100%丙酮(15-20min )t 100%丙酮(15-20min )t 100%丙酮(15-20min ) t2/3 丙酮 +1/3 Spurr s 樹脂(1h)T 1/2 丙酮 +1/2 Spurr s 樹脂(1h)T 1/3 丙酮 +2/3 Spurr s樹脂(1h)T純樹脂滲透過夜t包埋(

12、2-3個樣/包埋膠囊)t聚合過夜(70C恒 溫箱)t修塊(體式鏡下將包埋塊用雙面刀與單面刀修成梯形，可稍大于0.5-1mm左右)t切片(50A)(玻璃刀或鉆石刀)t撈片(將銀白色至金黃色切片移至有支持膜的載網(wǎng)上)T 醋酸鈾電子染色(避光 10-30min )T迅速水洗去余色t硝酸鉛/檸檬酸鈉電子染色(避光2-8min )t水洗t鏡檢三組織器官掃描電鏡(SEM制作與TEM標本不同，SEM羊品不經(jīng)過樹脂包埋和超薄切片等，可直接干燥，導(dǎo)電處理后上 鏡觀察，但SEM羊品的觀察亦要求在真空狀態(tài)下進行，無論是水還是脫水媒介都會防礙微細構(gòu)造的觀察，因此，在 SEM觀察前，樣品必須干燥處理。一般的細胞、組織、

13、器官的SEM觀察標本均須經(jīng)過取材、固定、脫水、干燥、組織導(dǎo)電染色、鍍膜，具體制作流程如下：取材(同TEM比，一般組織塊較大)t 2.5%戊二醛固定過夜t 0.1M PBS( PH7.2 )清洗 3 次(15-20min/per )t 1%我酸固定過夜t 0.1M PBS ( PH 7.2 )清洗 3 次(15-20min/per ) t30%丙酮(15-20min ) t 50%丙酮(15-20min ) t 70%f酮(15-20min ) t80%f酮(15-20min ) t90%丙酮(15-20min )t95%酮(15-20min )t 100%f酮(15-20min )t 100%

14、丙酮(15-20min ) t 100%丙酮(15-20min )t真空金屬鍍膜(樣品周圍的金屬膜以10-20nm為宜)t SEM鏡檢四 冷凍超薄切片制作該法是將液氮快速冷凍的組織塊直接進行冷凍超薄切片，主要用于負染色的超微結(jié)構(gòu)如細胞骨架微管的蛋白運輸、 酶細胞化學(xué)、 抗原定位以及各種化學(xué)元素分析等， 該法的關(guān)鍵是 要掌握在冷凍概況下作好超薄切片的技術(shù)。 冷凍超薄切片在抗原的保存、 細胞超微結(jié)構(gòu)的定 位以及蛋白等生物大分子的免疫分析方面具有獨特優(yōu)勢， 而超薄冷凍切片通常在具備液氮制 冷系統(tǒng)的超薄切片機上進行。制作流程如下：取材t固定(預(yù)冷EAA或2.5%戊二醛)t真空抽氣 10mint4C置1

15、-2ht 10%蔗糖(冰浴真空抽氣10min）t4C置1h 15%蔗糖（冰浴真空抽氣10min4C置1hOCT包埋劑包埋液氮快速冷凍t冷凍切片（-20 C）t鎳網(wǎng)拈片t免疫染色t鏡檢五 HM325 Microw 旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機使用程序1. 將石蠟塊固定在臺木上，修整蠟塊，后將其裝在切片機的夾物部分。2. 將刀片小心放入刀架上，避免磨損，刀口向上并保持水平，調(diào)整刀片的角度10-12，最后固定刀片。3. 移動刀片固定裝置， 將夾刀部與夾物部之間的距離調(diào)整到以石蠟塊的表面剛貼近刀口為 準，后旋緊固定器的旋鈕。4. 調(diào)整切片厚度至 6-12um。5. 右手握旋轉(zhuǎn)輪之柄，均勻搖動切片，開始可先按下粗切

16、旋鈕，進行修片，后可進行精細 切片，切片速度以40-50次/min為宜。6. 用毛筆托起蠟帶，分割后依次放到潔凈的載玻片上，滴入適量蒸餾水于38度展蠟臺進行站片。7. 切片結(jié)束后，將切片用具擦拭干凈，刀片取下，氯仿擦洗干凈，置于刀片盒中。套上外 罩以防灰塵。注意事項：1. 切片進行過程中，周圍環(huán)境溫度的設(shè)定以20-25 C為宜2. 切片機表面且勿沾染有機溶劑（二甲苯等） ，以免腐蝕儀器3. 新刀片應(yīng)從異端開始使用，切片進行過程沖謹防一用鑷子等器具碰損4. 每更換一個樣品時，切記隨手縮定旋輪固定裝置，并扳上護刀架，以防意外事故發(fā)生。六 Leica EM UC6 超薄切片機的使用程序1. 打開控制

17、面板側(cè)面的主開關(guān)，系統(tǒng)開始自動檢測。2. 依次打開控制面上的三個指示燈，并調(diào)整體式鏡的粗細旋紐，至視野中樣品清晰。3. 將樣品固定到修塊平臺上，在體式鏡下進行粗修片，修成梯形為宜4. 粗修好的樣品固定到切片機上，用單面刀和雙面刀在體式鏡下進行精細修片，樣品周圍 的樹脂不宜過多。5. 將玻璃刀或?qū)Ｓ勉@石刀固定到刀架上并固定， 后在狹槽中加入蒸餾水， 不宜過多或過少， 以體式鏡下視野中出現(xiàn)一亮的白色條帶為宜。6. 通過W E以及N S鍵調(diào)整刀片與樣品之間的水平距離7. 調(diào)整刀片與樣品的角度至 68. 通過 SPEED 鍵設(shè)定切片的速度。9. 分別按下CUT START與CUT END 鍵設(shè)定切片的行