細(xì)胞生物學(xué)研究方法1

1、c第一章第一章 緒論緒論第二章第二章 細(xì)胞基本知識概要細(xì)胞基本知識概要 第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法第四章第四章 細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞表面細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞表面第五章第五章 物質(zhì)跨膜運輸與信號傳遞物質(zhì)跨膜運輸與信號傳遞第六章第六章 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與內(nèi)膜系統(tǒng)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與內(nèi)膜系統(tǒng)第七章第七章 細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換第八章第八章 細(xì)胞核與染色體細(xì)胞核與染色體第九章第九章 核糖體核糖體第第 十十 章章 細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架第十一章第十一章 細(xì)胞增殖及其調(diào)控細(xì)胞增殖及其調(diào)控第十二章第十二章 細(xì)胞分化與基因表達(dá)調(diào)控細(xì)胞分化與基因表達(dá)調(diào)控第十三章第十三章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞衰老與凋亡methods

2、and techniques第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識caenorhabditis elegansdrosophila melanogasterarabidopsis thaliana生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機(jī)制l第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)的觀察方法顯微技術(shù)顯微技術(shù) 一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù)l第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)l第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù)l第

3、四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交l光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。l電子顯微鏡：以電子束為光源。l1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng):光源、折光鏡和聚光鏡，有時附加濾光片控制光的波長。 光學(xué)放大系統(tǒng):目鏡和物鏡組成。 機(jī)械裝置l2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。light pathway of microscope3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 l光學(xué)顯微鏡的分辨力光學(xué)顯微鏡的分辨力 r=0.61/na 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長； na為鏡口率為鏡口率 sin/2， n=介質(zhì)折射率； =鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。l顯微鏡的幾個光學(xué)特點

4、：顯微鏡的幾個光學(xué)特點： 介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin /2的最大值小于1；油鏡介質(zhì)為香柏油，鏡口率可接近1.5。 普通光線的波長為400700nm，光鏡分辨力約為0.2m，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000x。光鏡樣本制作樣品 固定 包埋 切片 染色（如伊紅和美藍(lán)能與蛋白質(zhì)結(jié)合；品紅能與dna結(jié)合）l特點：光源為短波光；特點：光源為短波光；l有兩個特殊的濾光片；有兩個特殊的濾光片；l照明方式通常為落射式。照明方式通常為落射式。原理原理fluorescence image, dna in blue and microtubules in g

5、reenl用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。觀察、基因定位、疾病診斷。l用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描,形成立體圖像，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。l能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。l分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。l用途類似熒光顯微鏡，但可以排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率。laser confocal scanning microscope, lcsm激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖(原理)lcsm image of a xenopus melanophore (爪蟾黑色素細(xì)胞） microtubule cyto

6、skeleton (green) and the nucleus (blue) /l把透過標(biāo)本的可見光的光程差光程差或相位差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見?？捎糜谟^察活細(xì)胞?？捎糜谟^察活細(xì)胞。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。1.環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。2.相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4?？捎糜谟^察活細(xì)胞可用于觀察活細(xì)胞l1952年nomarski發(fā)明，

7、利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。l偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。微分干涉顯微鏡原理微分干涉顯微鏡原理（六）錄像增差顯微鏡技術(shù)（六）錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopy） 計算機(jī)輔助的微分干涉顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運動l聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的。l可觀察 4200nm的微粒子

8、，分辨率比普通顯微鏡高50倍。l用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。l光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。l載物臺是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉l采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、dic、攝影裝置于一體。l自動化與電子化。（一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, teml以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50120kv)的平方根成反比。l由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。l分辨力0

9、.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。l用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡transmission electron microscope，tem c cw v 電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造tem light pathway電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別 分 辨 本 領(lǐng) 光 源 透 鏡 真 空 成 像 原 理 人 眼 0.2mm 可 見 光 光 學(xué) 顯 微 鏡 200nm 可 見 光 (波 長400 700nm) 利 用 樣 本 對 光 的 吸 收 形成 明 暗 反 差 和 顏 色 變 化 100nm 紫 外 光 （ 波 長

10、約200nm） 玻 璃 透 鏡 不 要 求 真 空 電 子 顯 微 鏡 接 近0.1nm 電 子 束 (波 長0.01 0.9nm) 電 磁 透 鏡 1.33 10-3 1.33 10-5pa 利 用 樣 品 對 電 子 的 散 射 和透 射 形 成 明 暗 反 差 電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較l(1) 超薄切片超薄切片l用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。l通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。l用重金屬鹽(如磷鎢酸或醋酸雙氧鈾) 染色；吸去染料

11、干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。negative stained archaebacteria 金屬投影金屬投影l(fā)亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。）。冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。技術(shù)示意圖技

12、術(shù)示意圖an onion root tip cell with no etching.l斷面的三種處理方法：l蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep etching ，主要用于觀察細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示 clathrin衣被快速冷凍深快速冷凍深度蝕刻技術(shù)度蝕刻技術(shù)(4) 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與x-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（structural biology,主要

13、研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系)的主要實驗手段。l20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。l分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000x。l電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。 co 2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。scanning electron microscope（ sem）l工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，并經(jīng)閃爍器轉(zhuǎn)變成光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變成電壓信號來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。l為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。sem light pathway人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞酵母酵母人類精子人類精子l原理：根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)設(shè)計，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mv2v），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中