熒光分光光度計的原理及應(yīng)用

1、2021-10-10熒光分光光度計的原理熒光分光光度計的原理熒光分光光度計的原理熒光分光光度計的原理熒光分光光度計的原理熒光分光光度計的原理及應(yīng)用及應(yīng)用及應(yīng)用及應(yīng)用及應(yīng)用及應(yīng)用2021-10-10一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生1. 1.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度單重激發(fā)態(tài)單重激發(fā)態(tài)s：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電：電子自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子配對。子配對。第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié) 熒光分光光度法原理熒光分光光度法原理熒光分光光度法原理熒光分光光度法原理熒光分光光度法原理熒光分光光度法原理三

2、重激發(fā)態(tài)三重激發(fā)態(tài)t：電子：電子自旋方向和處于基態(tài)自旋方向和處于基態(tài)軌道的電子平行。軌道的電子平行。2021-10-102. 2. 分子能級與躍遷分子能級與躍遷基態(tài)基態(tài)( (s0)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)( (s1、s2激發(fā)態(tài)振動能級激發(fā)態(tài)振動能級) )：吸收特吸收特定頻率的輻射。定頻率的輻射。激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式基態(tài)：多種途徑和方式( (見能級圖見能級圖) )；速度最；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越延遲熒光傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光振動弛預(yù)無輻射躍遷2021-10-10s2s1s0t1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系

3、間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2t2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2021-10-10二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜二、激發(fā)光譜與熒光光譜1. 1.熒光的激發(fā)光譜曲線熒光的激發(fā)光譜曲線 固定測量波長固定測量波長( (選最大發(fā)射波長選最大發(fā)射波長), ),化合物發(fā)射的熒化合物發(fā)射的熒光光( (磷光磷光) )強度與激發(fā)光波長的關(guān)系曲線強度與激發(fā)光波長的關(guān)系曲線 （圖中曲線（圖中曲線i ） 。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；多，熒

4、光強度最大；2021-10-102. 2. 2. 2. 2. 2.熒光光譜熒光光譜熒光光譜熒光光譜熒光光譜熒光光譜 固定激發(fā)光波長固定激發(fā)光波長, , 化合物發(fā)射的熒光強化合物發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關(guān)系度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線曲線( (圖中曲線圖中曲線ii) )。問題：熒光問題：熒光( (磷光磷光) )的的激發(fā)光波長如何選擇激發(fā)光波長如何選擇？stokes位移位移：激發(fā)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值的波長差值。發(fā)射光發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜譜的波長比激發(fā)光譜的長的長。2021-10-10三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三

5、、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系1 1 定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強度熒光強度 if正比于正比于吸收的光量吸收的光量ia和熒光量子效率和熒光量子效率 ： if = ia 由朗由朗- -比耳定律：比耳定律： ia = i0(1-10- l c ) if = i0(1-10- l c ) = i0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時，將括號項近似處理后：濃度很低時，將括號項近似處理后： if = 2.3 i0 l c = kc （濃度高時（濃度高時如何？）如何？）2021-10-10標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強

6、度，繪制標(biāo)配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法定量：比較法定量： 在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強度，比在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強度，比較。較。2 2 定量方法定量方法三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系三、熒光強度和溶液濃度的關(guān)系2021-10-10四、熒光、磷光分析方法的特點四、熒光、磷光分析方法的特點四、熒光、磷光分析方法的特

7、點四、熒光、磷光分析方法的特點四、熒光、磷光分析方法的特點四、熒光、磷光分析方法的特點（1 1）靈敏度高）靈敏度高 比紫外比紫外- -可見分光光度法高可見分光光度法高2 24 4個數(shù)量級；為什個數(shù)量級；為什么？么？ 分光光度法所檢測的是兩個較大的信號的微小差分光光度法所檢測的是兩個較大的信號的微小差別，熒光光度法檢測的是很小背景值上的熒光強度別，熒光光度法檢測的是很小背景值上的熒光強度。（2 2）選擇性強）選擇性強 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3 3）試樣量少）試樣量少（4 4）可提供比較多的物理參數(shù)）可提供比較多的物理參數(shù) 缺點：應(yīng)

8、用范圍小缺點：應(yīng)用范圍小。2021-10-10第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié) 熒光分光光度計的組成熒光分光光度計的組成熒光分光光度計的組成熒光分光光度計的組成熒光分光光度計的組成熒光分光光度計的組成 測量熒光的儀器主要由測量熒光的儀器主要由四個部分四個部分組成：激發(fā)光源、樣品組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。 特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器成直角。特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器成直角。 基本流程如圖：基本流程如圖：單色器單色器：選擇激發(fā)光波長：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射的第一單色器和選擇發(fā)射光光( (測量測量) )波長的第二單色器波

9、長的第二單色器；光源光源：氙燈：氙燈? ?和高壓汞燈，和高壓汞燈，染料激光器染料激光器檢測器檢測器：光電倍增管：光電倍增管。2021-10-10儀儀儀儀儀儀器器器器器器光光光光光光路路路路路路圖圖圖圖圖圖問問題題：參參考考光光電電管管作作用用？2021-10-10第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié) 熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用(1)(1)無機化合物的分析無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量；可測量約與有機試劑配合物后測量；可測量約6060多種元素。多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾