第八章 基因的表達(dá)與調(diào)控(上)1

1、第八章 基因的表達(dá)與調(diào)控( (上) )原核基因表達(dá)調(diào)控模式自然選擇傾向于保留高效率的生命過(guò)程。在每30分鐘增殖一次的109細(xì)菌群體中，若一個(gè)細(xì)菌變成29.5分鐘增殖，經(jīng)過(guò) 80天 的連續(xù)生長(zhǎng)后，這個(gè)群體中的99.9%都將具有29.5分鐘增殖一倍的生長(zhǎng)速度。原核生物細(xì)胞的基因和蛋白質(zhì)種類較少，如大腸桿菌基因組約為4.20106bp共有 4 288個(gè)開(kāi)放讀碼框 。據(jù)估計(jì)，一個(gè)細(xì)胞中總共含有107個(gè)蛋白質(zhì)分子。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞有約15 000個(gè) 核糖體，50種 核糖體蛋白、糖酵解體系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代謝過(guò)程中必需的，其合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，這一類蛋白質(zhì)被稱為永久

2、型（constitutive）合成的蛋白質(zhì)。另一類則被稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型(adaptive or regulated)，因?yàn)檫@類蛋白質(zhì)的合成速率明顯地受環(huán)境的影響而改變。如大腸桿菌細(xì)胞中一般只有15個(gè)-半乳糖苷酶 ，但若將細(xì)胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每細(xì)胞中這個(gè)酶的量可高達(dá)幾萬(wàn)個(gè)分子。隨著生物個(gè)體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息，通過(guò)密碼子-反密碼子系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)，執(zhí)行各種生理生化功能?？茖W(xué)家把從DNA到蛋白質(zhì)的過(guò)程稱為基因表達(dá)（gene expression），對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控（gene regulation或gene control）。8. 1 原核基因

3、表達(dá)調(diào)控總論圖8-1 基因表達(dá) DNA分子有序地將其所承載的遺傳信息，通過(guò)密碼子-反密碼子系統(tǒng)，轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子，這個(gè)過(guò)程稱為基因表達(dá)?；虮磉_(dá)的第一步是由RNA聚合酶拷貝DNA雙鏈中的模板鏈，生成與該序列完全互補(bǔ)（除了T被置換成U之外）的RNA鏈?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方面：轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控( transcriptional regulation)；轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控(post-transcriptional regulation)，包括mRNA加工成熟水平調(diào)控(differential processing of RNA transcript)以及翻譯水平調(diào)控(differentia

4、l translation of mRNA)。細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程幾乎發(fā)生在同一時(shí)間間隔內(nèi)，轉(zhuǎn)錄與翻譯相耦聯(lián)（coupled transcription and translation）。真核生物中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary transcript）只有從核內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)（圖8-2）。原核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)其作用特征又分為負(fù)控誘導(dǎo)和負(fù)控阻遏二大類。在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)

5、物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。根據(jù)其作用特性分為正控誘導(dǎo)系統(tǒng)和正控阻遏系統(tǒng)。在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。因子 在結(jié)構(gòu)上具有同源性，所以統(tǒng)稱 70家族，含有4個(gè)保守區(qū)（圖8-4），其中第2個(gè)和第4個(gè)保守區(qū)參與結(jié)合啟動(dòng)區(qū)DNA，第2個(gè)保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈DNA 解開(kāi)成單鏈的過(guò)程。參與大腸桿菌中基因表達(dá)調(diào)控最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)可能是因子圖8-4 大腸桿菌中的因子大腸桿菌中的因子（以 70 為例）主要包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域，其

6、中 第2個(gè)和第4個(gè)保守區(qū)參與結(jié)合啟動(dòng)區(qū)DNA，第2個(gè)保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈DNA解開(kāi)成單鏈的過(guò)程 。 因子特異性結(jié)合DNA上的-35區(qū)和-10區(qū)。 70因子特異性結(jié)合DNA上的 -35區(qū)和-10區(qū) ，而 54因子識(shí)別并與DNA上的 -24和-12區(qū)相結(jié)合。在與啟動(dòng)子結(jié)合的順序上，70類啟動(dòng)子在核心酶結(jié)合到DNA鏈上之后才能與啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合，而54則類似于真核生物的TATA區(qū)結(jié)合蛋白（TBP），可以在無(wú)核心酶時(shí)獨(dú)立結(jié)合到啟動(dòng)子上。原核基因表達(dá)調(diào)控的主要特點(diǎn)主要分為：可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和可阻遏調(diào)節(jié)可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)： 是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來(lái)關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，及在某些物質(zhì)的誘

7、導(dǎo)下使基因活化。 大腸桿菌的乳糖操縱子可阻遏調(diào)節(jié)： 這類基因平時(shí)都是開(kāi)啟的，處于產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作工程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)。 大腸桿菌的色氨酸操縱子弱化子對(duì)基因活性的影響 當(dāng)操縱子被阻遏，RNA合成終止時(shí)，起終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)作用的那一段核苷酸被稱為弱化子 特殊負(fù)載的氨基酰-tRNA降解物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié) 有葡萄糖存在的情況下，即使在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入乳糖，半乳糖，阿拉伯糖或麥芽糖等誘導(dǎo)物，與其相對(duì)應(yīng)的操縱子也不會(huì)啟動(dòng)，產(chǎn)生出代謝這些糖的酶來(lái)。這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng) 細(xì)菌有時(shí)會(huì)碰到緊急狀況，比如氨基酸饑餓，及氨基酸全面匱乏，為了緊縮開(kāi)支，渡過(guò)

8、難關(guān)，細(xì)菌將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng)，包括生產(chǎn)各種RNA，糖，脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程均被停止。信號(hào)是：鳥(niǎo)苷四磷酸（ppGpp）和鳥(niǎo)苷五磷酸（pppGpp）8. 2 乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)大腸桿菌乳糖操縱子（ lactose operon）包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動(dòng)區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。3個(gè)結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶，是一種-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷） ；Y編碼-半乳糖苷透過(guò)酶，它能使外界的-半乳糖苷透過(guò)大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；A編碼-半

9、乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶，把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。8. 2. 1 酶的誘導(dǎo)lac體系受調(diào)控的證據(jù)一般情況下，lac + 基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi) -半乳糖苷酶和透過(guò)酶的濃度很低，每個(gè)細(xì)胞只有12個(gè)酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，超過(guò)105個(gè)酶分子/細(xì)胞。在無(wú)葡萄糖有乳糖的培養(yǎng)基中，lac + 細(xì)菌中將同時(shí)合成-半乳糖苷酶和透過(guò)酶。用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進(jìn)行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖12分鐘 后，編碼-半乳糖苷酶和透過(guò)酶的lac mRNA量就 迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量 立即下降。圖8-7實(shí)驗(yàn)室常用兩種

10、乳糖類似物異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因?yàn)樗鼈兌疾皇前肴樘擒彰傅牡孜?，所以又稱為安慰性誘導(dǎo)物（ gratuitous inducer）。圖88用35S標(biāo)記大腸桿菌細(xì)胞（培養(yǎng)基中沒(méi)有半乳糖），將這些帶有放射性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S的培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)物后-半乳糖苷酶便開(kāi)始合成。分離純化-半乳糖苷酶， 發(fā)現(xiàn)這種酶無(wú)35S標(biāo)記，說(shuō)明這種酶是加入誘導(dǎo)物后新合成的。8. 2. 2 操縱子模型及其影響因子Jacob和Monod認(rèn)為 誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問(wèn)題，而且可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，他們通過(guò)大量

11、實(shí)驗(yàn)及分析，建立了現(xiàn)在已經(jīng)被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。1. Z、Y、A基因 產(chǎn)物由同一條多順?lè)醋?mRNA分子所編碼。2. 該mRNA分子的 啟動(dòng)區(qū)(P)位于阻遏基因( I )與操縱區(qū)( O ) 之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苷酶和透過(guò)酶基因的高效表達(dá)。3. 操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是 阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。4. 當(dāng) 阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合 時(shí)，lac mRNA的 轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。5. 誘導(dǎo)物通過(guò)與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象， 使之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，誘發(fā)lac mRNA的合成。這就是說(shuō)，有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱區(qū)沒(méi)有被阻遏物占據(jù)，所以 啟動(dòng)子能夠順利起始mRNA的轉(zhuǎn)錄。阻遏

12、物lacI基因產(chǎn)物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動(dòng)子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基均含有347個(gè)氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合,每個(gè)細(xì)胞中有510個(gè)阻遏物分子。如果將葡萄糖和乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會(huì)誘發(fā)lac操縱子（圖7-11）。某大腸桿菌突變體，它不能將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該細(xì)菌的lac基因能在葡萄糖存在時(shí)被誘導(dǎo)合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解產(chǎn)物抑制lac mRNA的合成 ，科學(xué)上把葡萄糖的這種效應(yīng)稱之為代謝物阻遏效應(yīng)（cataboliterepression）。cAMP與代謝物激活蛋白cAM

13、P是在 腺苷酸環(huán)化酶的作用下由ATP 轉(zhuǎn)變而來(lái)的，在真核生物的激素調(diào)節(jié)過(guò)程中也起著十分重要的作用。將細(xì)菌放在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，cAMP的濃度就低；如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度就會(huì)很高 。大腸桿菌中的代謝物激活蛋白，由Crp 基因編碼，能與cAMP形成復(fù)合物 。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP 是一個(gè)不同于阻遏物的正調(diào)控因子，而lac操縱子的功能是在這兩個(gè)相互獨(dú)立的調(diào)控體系作用下實(shí)現(xiàn)的。半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解過(guò)程中均轉(zhuǎn)化成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產(chǎn)物，這些糖代謝中有關(guān)的酶都是由 可誘導(dǎo)操縱子控制

14、的，只要有葡萄糖存在，這些操縱子就不表達(dá)，被稱為 降解物敏感型操縱子(catabolite sensitive operon），實(shí)驗(yàn)證明這些 操縱子都是由cAMP-CRP 調(diào)控。圖7-13gal，lac和ara操縱子上游啟動(dòng)子區(qū)與CRP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)位置分析CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的， cAMP-CRP復(fù)合物 是激活lac的重要組成部分。細(xì)菌對(duì)于此復(fù)合物的需要是獨(dú)立的，轉(zhuǎn)錄必須有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合在DNA的啟動(dòng)子區(qū)域上 。凡Crp及腺苷酸環(huán)化酶基因突變的細(xì)菌都不能合成lac mRNA 。cAMP-CRP是一個(gè)不同于阻遏物的正調(diào)控因子， lac操縱子的功能

15、是在這兩個(gè)相互獨(dú)立的調(diào)控體系作用下實(shí)現(xiàn)的。圖 7-15 CRP-cAMP 與上游DNA位點(diǎn)結(jié)合后造成模板DNA沿對(duì)稱序列中央發(fā)生90的彎曲cAMP-CRP復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是lac mRNA合成起始所必需的，因?yàn)檫@個(gè)復(fù)合物結(jié)合于 啟動(dòng)子上游，使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲 ，有利于形成穩(wěn)定的開(kāi)放型啟動(dòng)子-RNA聚合酶結(jié)構(gòu)。8. 2. 3 lac操縱子的調(diào)控區(qū)域P、O區(qū)P區(qū)（即啟動(dòng)子區(qū)）一般是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游510bp ，而 O區(qū)（即阻遏物結(jié)合區(qū)）位于-7+28 位，該區(qū)的堿基序列有對(duì)稱性，其對(duì)稱軸在+11位堿基對(duì)。圖8-16 不同操縱子啟動(dòng)區(qū)及O區(qū)相對(duì)位置的比較。實(shí)驗(yàn)表明，阻

16、遏物與O區(qū)的結(jié)合影響了RNA聚合酶與啟動(dòng)區(qū)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的效率。1、lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較在完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中， -半乳糖苷酶、透過(guò)酶及乙?；D(zhuǎn)移酶 的拷貝數(shù)比例為1：0.5：0.2 ，這個(gè)比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作為唯一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。8. 2. 4 lac操縱子中的其他問(wèn)題lac mRNA可能與翻譯過(guò)程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。因此，存在著從mRNA的5 末端到3末端的蛋白質(zhì)合成梯度，這對(duì)于多順?lè)醋觤RNA分子具有普遍性。在lac mRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，因此，在

17、任何時(shí)候Z基因的完整拷貝數(shù)要比A基因多。2、操縱子的融合與基因工程負(fù)責(zé)嘌呤合成的pur操縱子 在染色體上位于lac操縱子沿轉(zhuǎn)錄方向的下游，中間只隔了一個(gè)控制細(xì)胞對(duì)T6噬菌體敏感性的tsx基因。 pur操縱子被“嫁接”到lac啟動(dòng)子上，形成融合基因。因?yàn)閘ac啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，通過(guò)它可以使較弱啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。8. 3 色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)trp體系參與生物合成，它 不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個(gè)基因 參與整個(gè)合成過(guò)程。色氨酸的合成分5步完成，有7個(gè)基因參與：trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，trpF編碼異構(gòu)酶，trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB則分別編碼色氨酸合酶的和亞基。在許多細(xì)菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分別融合成一個(gè)基因，產(chǎn)生具有雙重功能的蛋白質(zhì)。圖8-17細(xì)菌中色氨酸生物徑。在色氨酸的合成過(guò)程中，細(xì)菌中還有pabA，pabB 基因分別編碼ADC合酶