生物分離工程 細胞分離與破碎

1、生物分離工程生物分離工程細胞分離與破碎細胞分離與破碎總體學習目的和要求總體學習目的和要求 通過本章學習，要求掌握解通過本章學習，要求掌握解細胞分離細胞分離和和目標產物目標產物的釋放的的釋放的原理原理和方法，熟和方法，熟知各種方法的知各種方法的優(yōu)缺點優(yōu)缺點和應用范圍。和應用范圍。 目錄目錄n重力沉降重力沉降n離心沉降離心沉降n細胞破碎與胞內物釋放細胞破碎與胞內物釋放細胞分離學習要點細胞分離學習要點n識記：識記：重力沉降、離心沉降和過濾的概念。重力沉降、離心沉降和過濾的概念。n理解：理解：重力沉降、離心分離與過濾原理、理重力沉降、離心分離與過濾原理、理論；掌握論；掌握StokesStokes沉降公

2、式沉降公式 。n應用：應用：常用離心方法及優(yōu)缺點；利用掌握的常用離心方法及優(yōu)缺點；利用掌握的提高分離效率的方法分析決實際問題提高分離效率的方法分析決實際問題 細胞分離重力沉降定義細胞分離重力沉降定義 重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有固體顆粒的流體中將顆粒分離出來的操作。固體顆粒的流體中將顆粒分離出來的操作。 重力沉降重力沉降是利用流體與顆粒間的密度差，是利用流體與顆粒間的密度差，在重力的作用下使顆粒與流體之間產生在重力的作用下使顆粒與流體之間產生相對運動，從而實現(xiàn)兩者的分離。相對運動，從而實現(xiàn)兩者的分離。 在生物分離過程中，定義中顆粒為細胞、在生物分離過

3、程中，定義中顆粒為細胞、細胞碎片等有形物細胞碎片等有形物千姿百態(tài)的微生物世界千姿百態(tài)的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture細胞分離重力沉降理論細胞分離重力沉降理論n理論假設理論假設n細胞或細胞碎片按照球形顆粒處理；細胞或細胞碎片按照球形顆粒處理；n顆粒在無限稀釋的溶液中進行沉降，顆粒顆粒在無限稀釋的溶液中進行沉降，顆粒之間無相互干擾之間無相互干擾 n受力分析受力分析 球形顆粒重力球形顆粒重力fg 液體的浮力液體的浮力fb 顆粒運動方向相反的阻力顆粒運動方向相反的阻力 fs細胞分離重力沉降理論細胞分離重力沉降理論gd

4、fspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：重力：浮力：浮力：阻力：阻力：細胞分離重力沉降理論細胞分離重力沉降理論當球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力當球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力達到平衡時，達到平衡時， bSgfffgdvpLLSg342則則細胞分離重力沉降理論細胞分離重力沉降理論1Re103當球形顆粒處于滯流區(qū)（當球形顆粒處于滯流區(qū)（ ）時）時 Re24gdvLLSpg182Stokes公式公式當球形顆粒處于過渡區(qū)（當球形顆粒處于過渡區(qū)（ ）時）時 310Re15 . 0Re105 . 06 . 0Re27. 0LLSpggdvAllen公式公式當球形顆粒處于

5、湍流區(qū)（當球形顆粒處于湍流區(qū)（ ）時）時53102Re1044. 05 . 074. 1LLSpggdvNewton公式公式千姿百態(tài)的微生物世界千姿百態(tài)的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture球形顆粒？無限稀釋溶液？無限稀釋溶液？細胞分離重力沉降理論細胞分離重力沉降理論n模型校正模型校正n形態(tài)校正：顆粒的形狀系數(shù)顆粒的形狀系數(shù)n速度校正：空隙率函數(shù)空隙率函數(shù) n提高重力沉降的途徑提高重力沉降的途徑n加入中性鹽：雙電層排斥電位降低雙電層排斥電位降低n加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝圖架橋作用形成大絮凝圖n引入外力引

6、入外力PSAA)(F細胞分離重力沉降理論細胞分離重力沉降理論n模型校正模型校正 形態(tài)校正形態(tài)校正 速度校正速度校正n提高重力沉降的途徑提高重力沉降的途徑 加入中性鹽；加入中性鹽； 加入高分子絮凝劑加入高分子絮凝劑 引入外力引入外力細胞分離離心沉降定義細胞分離離心沉降定義離心沉降離心沉降是利用沉降設備使流體和顆粒旋是利用沉降設備使流體和顆粒旋轉，在離心力的作用下，由于顆粒和流體轉，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產生相對運動，從而使顆粒和流體分離。生相對運動，從而使顆粒和流體分離。 細胞分離離心沉降理論細胞分離離心沉降理論rd

7、vLLSPS2218)(離心沉降速度離心沉降速度 令：令：LLSPdS18)(2rSvS2gdvLLSpg182細胞分離離心分離方法細胞分離離心分離方法n差速離心分級差速離心分級n區(qū)帶離心區(qū)帶離心 差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心 平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心 差速離心分離差速離心分離 差速離心是以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離方法，應用某一特定顆粒沉淀的離心力在預定的離心時間內得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒的上清液。差速離心分離應用實例差速離心分離應用實例600g10 min15000g10 min100000g60 min300000g120 minnucleiMitochondrial

8、ysosomesPlasma membraneRiosomal subunitshomogenateFiltered homogenateSoluble part of cytoplasmSedimentation區(qū)帶離心分離前提區(qū)帶離心分離前提 在離心管內的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同濃度（密度）的梯度介質（蔗糖等），按照濃度從大到小的原則，依次層層加入。加入離心管中的梯度介質經高速離心或靜置后可形成連續(xù)的密度梯度。 操作過程操作過程區(qū)帶離心種類區(qū)帶離心種類n差速區(qū)帶離心(速度區(qū)帶離心）n平衡區(qū)帶離心（等密度離心）差差速速區(qū)區(qū)帶帶離離心心差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心n基于顆粒的大小、形狀

9、的分離n梯度液的最大密度不能超過所分離顆粒的最大密度n離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等n動態(tài)離心分離方法平平衡衡區(qū)區(qū)帶帶離離心心平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心n梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度n離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等n平衡離心分離方法梯度液的種類和應用梯度液的種類和應用細胞分離區(qū)帶離心異同細胞分離區(qū)帶離心異同區(qū)帶離心種類區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心共同點共同點事先在離心管內用低分子量溶質調配好密度梯度事先在離心管內用低分子量溶質調配好密度梯度梯度介質梯度介質常用蔗糖常用蔗糖常用氯化銫常用氯化銫密度梯度密度梯度最大的

10、密度梯度低于最大密最大的密度梯度低于最大密度的沉降樣品度的沉降樣品最大的密度梯度大于最大密最大的密度梯度大于最大密度的沉降樣品度的沉降樣品區(qū)帶形成條件區(qū)帶形成條件根據(jù)各個組分沉降系數(shù)的差根據(jù)各個組分沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶別，形成各自的區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶離心條件離心條件在最前的沉降物質達到管底在最前的沉降物質達到管底前停止，短時間，低速度前停止，短時間，低速度使各組分沉降到其平衡的密使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度度區(qū)，長時間，高速度 細胞分離離心設備分類細胞分離離心設備分類分類方法分類方法名稱名稱處理量處理量實驗室用離心機，工業(yè)用離心機實驗

11、室用離心機，工業(yè)用離心機溫度溫度常溫離心機、冷凍離心機常溫離心機、冷凍離心機轉速轉速低速離心機、高速離心機、超速離心機低速離心機、高速離心機、超速離心機轉子結構轉子結構管式、碟式管式、碟式細胞分離常用離心設備細胞分離常用離心設備Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation 細胞分離常用離心設備細胞

12、分離常用離心設備Decanter centrifuge Multichamber bowl, vertical cut 細胞分離管式離心設備細胞分離管式離心設備A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper細胞分離碟片離心設備細胞分離碟片離心設備(a) Solids-retaining disk bowl, (b) Radial solids-ejecting disk bowl, top feed. (c) Radial solids-ejecting disk bowl, hermetic f

13、eed.(d) Axial solids-ejecting disk bowl. (e) Nozzle bowl with pressurized solids discharge. (f) Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.細胞分離離心設備比較細胞分離離心設備比較管式離心機管式離心機優(yōu)點優(yōu)點結構簡單，轉速和離心力較大結構簡單，轉速和離心力較大缺點缺點沉降面積小、處理能力低；沉降面積小、處理能力低；碟式離心機碟式離心機優(yōu)點優(yōu)點轉子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大轉子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大缺點缺點結構復雜、轉速較低；結構

14、復雜、轉速較低；細胞分離離心機處理能力細胞分離離心機處理能力粒子在徑向上的沉降速度粒子在徑向上的沉降速度 grvdtdrvgs2軸向移動速度軸向移動速度 2122rrQdtdzuz完全沉降的邊界條件完全沉降的邊界條件 0z1rr Lz 2rr 1222122lnrrgrrLvQg細胞分離離心機處理能力細胞分離離心機處理能力影響因素影響因素 處理樣品的特性，如密度、粒徑等處理樣品的特性，如密度、粒徑等 溶液的特性，如密度、粘度等溶液的特性，如密度、粘度等 離心機機械結構，如離心機機械結構，如r1和和r2 操作條件，操作條件， 細胞分離過濾定義細胞分離過濾定義過濾是利用多孔性介質（如濾布）截留過濾

15、是利用多孔性介質（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法。離的方法。 過濾本身是一種膜分離技術。在分離細胞、菌體或過濾本身是一種膜分離技術。在分離細胞、菌體或它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術也是它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術也是一種常備的分離方法。一種常備的分離方法。細胞分離過濾過程受力分析細胞分離過濾過程受力分析推動力：推動力：過濾操作以壓力差為主要推動力；過濾操作以壓力差為主要推動力； 阻阻 力：力：過濾過程的阻力來自多孔性過濾介過濾過程的阻力來自多孔性過濾介 質和介質表面不斷堆積形成的濾餅質和介質表面不斷堆積形成

16、的濾餅 細胞分離過濾速率細胞分離過濾速率cmLRRpAdtdQRm表示介質的阻力；表示介質的阻力；Rc表示濾餅的阻力；表示濾餅的阻力；L為濾液的粘度為濾液的粘度 細胞分離恒壓過濾方程細胞分離恒壓過濾方程Ruth恒壓過濾方程恒壓過濾方程 020ttKQQ其中，其中，K為為Ruth恒壓過濾系數(shù)，表示為恒壓過濾系數(shù)，表示為SLLSccpAK122細胞分離細胞分離提高過濾速度的途徑提高過濾速度的途徑n采用絮凝或凝聚的方法預處理改變料液采用絮凝或凝聚的方法預處理改變料液的性質，降低濾餅阻力的性質，降低濾餅阻力n加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，提高過濾速度提高過濾速度

17、胞內產物釋放胞內產物釋放學習要點學習要點n理解：理解：各種細胞破碎方法原理、優(yōu)缺點各種細胞破碎方法原理、優(yōu)缺點及其適用范圍。及其適用范圍。 n應用：應用：采用不同的細胞破碎方法對不同采用不同的細胞破碎方法對不同細胞進行不同程度的破碎。細胞進行不同程度的破碎。 胞內產物釋放胞內產物釋放細胞結構（真核細胞與原核細胞）細胞結構（真核細胞與原核細胞）動物細胞動物細胞沒有細胞壁，只有由脂質和蛋白質組成的細胞膜沒有細胞壁，只有由脂質和蛋白質組成的細胞膜植物細胞植物細胞細胞膜外有一層堅固的細胞壁細胞膜外有一層堅固的細胞壁酵母細胞酵母細胞細胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質構成，更加難以破碎細胞壁由葡聚糖、甘露聚

18、糖和蛋白質構成，更加難以破碎真核細胞真核細胞原核細胞原核細胞革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌細胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約細胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約1550 nm，肽聚糖含量為肽聚糖含量為4090%，細胞壁較革蘭氏陰性菌堅固。，細胞壁較革蘭氏陰性菌堅固。革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌細胞壁在肽聚糖的外側還有分別由（細胞壁在肽聚糖的外側還有分別由（1）脂蛋白和（）脂蛋白和（2）磷脂和脂多）磷脂和脂多糖構成的兩層外壁層，外壁層厚度越糖構成的兩層外壁層，外壁層厚度越810 nm。胞內產物釋放胞內產物釋放細胞膜組成細胞膜組成（A）（B）胞內產物釋放胞內產物釋放影響產物釋放的環(huán)境因素影響產物釋放的環(huán)境因素在復雜在復雜

19、培養(yǎng)基培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞其破碎較單中生長的大腸桿菌細胞其破碎較單一培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞更難；一培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細胞更難；對數(shù)對數(shù)生長期生長期的細胞會表現(xiàn)得更加脆弱。的細胞會表現(xiàn)得更加脆弱。從連續(xù)從連續(xù)培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程中獲得的、具有較高比生長速率中獲得的、具有較高比生長速率的念珠菌的細胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠的念珠菌的細胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠菌體則有更加充裕的機會構建更加堅固的細胞壁。菌體則有更加充裕的機會構建更加堅固的細胞壁。酵母細胞壁的厚度和破碎阻力隨酵母細胞壁的厚度和破碎阻力隨年齡年齡增長而增加增長而增加經常在幼酵母細胞中出現(xiàn)的經常在幼酵母細胞中出現(xiàn)的芽痕

20、芽痕（Bud scars）可引起酵母細胞局部細胞壁強度的降低可引起酵母細胞局部細胞壁強度的降低 胞內產物釋放胞內產物釋放細胞破碎原理細胞破碎原理細胞細胞破碎破碎機械破碎機械破碎高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波破碎破碎非機械破碎非機械破碎物理法物理法滲透壓沖擊、凍結滲透壓沖擊、凍結-融化、融化、（超聲波）（超聲波）化學法化學法酸堿處理、化學試劑處理酸堿處理、化學試劑處理生物法生物法酶溶、自溶、噬菌體酶溶、自溶、噬菌體胞內產物釋放胞內產物釋放機械破碎之高壓勻漿機械破碎之高壓勻漿細胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可細胞懸浮液在高壓的作用下從閥

21、座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可達到達到450 m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。用下破碎。 胞內產物釋放胞內產物釋放機械破碎之珠磨機械破碎之珠磨珠磨機的破碎室內填充有珠磨機的破碎室內填充有8085（v/v）的玻璃（密度為的玻璃（密度為2.5 g/ml）或氧化鋯（密度為或氧化鋯（密度為6.0 g/ml）的微球（粒徑約的微球（粒徑約0.11.0 mm）。）。在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球與微球在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球與微球之間以及微球和細胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細之間以及微球和細胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。 胞內產物釋放胞內產物釋放機械破碎之撞擊破碎機械破碎之撞擊破碎撞擊破碎