基因重組分析軟件RDP4分析演示

1、.1、 要分析一個重組事件，首先需要一些基礎(chǔ)軟件的支持，其中最重要的是mega。2、 打開一個 .meg 格式的文件：左擊鼠標(biāo)open 按鈕。3、 點(diǎn)擊頁面頂端options 按鈕，進(jìn)入 General 頁面選擇一系列參數(shù)：選擇你的序列是環(huán)狀還是線性，檢測所需要的方法，建議選擇默認(rèn)的選項（RDP, GENECONV and MAXCHI）你選擇的方式越多，消耗時間越長。如果你分析的是小型數(shù)據(jù)（小于50 個序列），你還可以選擇 CHIMAERA，BOOTSCAN 和 SISCAN 。一般不使用 LARD方法，除非在驗證重組時間或檢測小于 20 個序列的數(shù)據(jù)時。再看右邊的選項，在你第一次分析數(shù)據(jù)時

2、，應(yīng)該選上 disentangle overlapping events 選項，如果分析時卡住了再取消分析，把這個選項刪掉就可以了。其他選項選擇默認(rèn)就可以了4、 一旦所有選項都調(diào)試好之后，左擊主界面上的X-over 按鈕開始進(jìn)行重組分析。如果你認(rèn)為耗費(fèi)的時間超出了你的預(yù)期， 你可以點(diǎn)擊 stop 按鈕，如果你不想分析其中的某個序列，可以點(diǎn)擊 Sequence display 界面中右側(cè)序列的名字， 左擊一下名字變灰， 為 mask 這個序列，即對這個序列不進(jìn)行重組分析，但依然作為參考序列在做樹中顯示出來；左擊兩下名字變白， disable 這個序列，即完全除去這個序列。這樣的處理可以提高分析重

3、組的能力，集中精力分析你需要的序列。5、 分析完畢后出現(xiàn)四個界面，順時針方向依次為Sequence display，Therecombinationinformation display.，Schematic sequence display 以及 Plot display。下面分四個部分具體講解。1. The Sequence Display：;.左擊序列中的部位可以顯示不同顏色代表的含義鼠標(biāo)懸空在某個核苷酸上會顯示出該核苷酸處于何序列的具體位置。右擊鼠標(biāo)可以保存不同形式你想要的序列。Save entire alignment.：保存整個比對結(jié)果，可以保存成多種形式。Save alignme

4、nt with recombinant sequences removed：保存沒有重組序列的比對結(jié)果。即在 plot display 板塊中為一個完整的長條的序列。Save alignment with recombinant columns removed.：將去除所有與重組相關(guān)的序列，如果一個比對結(jié)果中與重組相關(guān)的序列太多，很可能結(jié)果是一個空白或接近于空白。Save alignment with recombinant regions removed.：所有與重組相關(guān)的核苷酸將被取代為或 .;.Save alignmnet with recombinant regions seperat

5、ed.重:組序列將被分割成兩部分，一部分與重組無關(guān)， 一部分是重組部分。 可以分別與其他序列進(jìn)行比對。 Split alignment into common mosaics：.具有同一重組鑲嵌體的序列和其余的非重組序列被分裂為兩個單獨(dú)的比對結(jié)果。Save only enabled sequences：.只有被 enable的序列才會保存。這個選項有助于手動將同一組的序列保存成新的比對結(jié)果。Save only disabled sequences：.只有 mask 和 disable 的序列被保存下來如果你想單獨(dú)分析某一組序列， 右擊鼠標(biāo)選擇 select groups，點(diǎn)擊你想選擇的序列，變

6、為藍(lán)色即為選中，未選中的為黑色。如果你想專門看某個序列， 右鍵點(diǎn)擊 go to ，然后在 schematic sequence display 中會顯示這個序列。5、The Recombination Information Display這些信息包括用于檢測的方法 , 重組事件的編號 , 可能的斷點(diǎn) , 序列的名字 , 可能的突變位點(diǎn)，與該重組毒株密切相關(guān)的 , 可能父母代的序列名字 ( 主要和次要的父母 ) 和次要父母代毒株比主要父母代毒株與重組序列的關(guān)系更密切的概率，以及P值的大小。如果出;.現(xiàn)以下情況，該界面還會出現(xiàn)warning 標(biāo)示（紅色）：（ 1） 在比對序列中只有一個可能為父母

7、代毒株的序列（ 2）有可能 ( 約30%或更大的可能 ) 誤認(rèn)為重組序列 ( 即實際上父母代的序列中的某個才是真正的重組毒株)如果是這樣會在后面顯示出實際上可能為重組毒株的父母代毒株的名字。（ 3）無法識別出一個或全部兩個突變位點(diǎn)。（ 4）一個或兩個突變位點(diǎn)是錯位的。（ 5）重組信號微弱（ 6）如果復(fù)合信號可能是一個分析錯誤的人工制品?！?confirmation table 部”分表明了用不同方法檢測出發(fā)生該重組事件的毒株數(shù)和關(guān)于目前檢測到的重組事件的符合程度Confirmation table下面是一個總結(jié)性的柱狀圖，對于99%的用戶來說前三條柱狀圖代表的是有用的信息。柱狀圖下面的分?jǐn)?shù)大于

8、60 分代表這該毒株幾乎確定為重組毒株。大于40 小于 60 的分?jǐn)?shù)代表軟件可能犯了錯誤，但也可能沒有。小于40 表示該毒株很可能不是重組毒株。BackgroundsequenceRecombinantregionSave sub-alignmentCycle throughdisplay optionsCurrent viewFigure 2.The schematic sequence display6、Schematic sequence display每一個長條都代表一個重組序列。不同的顏色可以代表不同的意思：1.每一個最可能為重組事件供體的序列被賦予獨(dú)一無二的顏色。2.用于檢測重組序

9、列的方法。3.他們相關(guān)的P 值4.它們與推測的父母代序列之間的關(guān)聯(lián)性大小?？梢酝ㄟ^cycle through displayoptions ” button選項改變顏色。而這些顏色代表的意思可以通過左擊擊灰色部分看到。;.右擊鼠標(biāo)灰色部分可以將該圖拷貝到剪貼板或保存成.emf 文件。該圖表可以轉(zhuǎn)換三種模式(1)“Show all events for sequence X” (sequence X 是你的鼠標(biāo)距離最近的序列 ) (2) Show“ only best events for all sequences , ” and (3)Show“ all events forall sequ

10、ences. ”就是有的重組事件可能用所有方法都可以檢測到，而有的重組事件只有一到兩種方法可以檢測到。如果你選擇（2）的話只有最優(yōu)的重組事件會顯示出來（即P值最低）。你可以通過鍵盤上的pgDn 和 PgUp 瀏覽重組事件。在序列彩色條上右擊鼠標(biāo)會出現(xiàn)一系列的選項，你可以通過 “接受或不接受該重組事件”選項來人為修改你認(rèn)為RDP出現(xiàn)的錯誤， 也可以將父母代供體和重組毒株相互調(diào)換，但必須慎重，因為這個調(diào)換是不可恢復(fù)的，如果你要取消調(diào)換只能重新分析。而且，盡管RDP可能出現(xiàn)錯誤，但它至少是一個客觀的判斷方法，沒有人的主觀性。所以，除非你有充足的理由，否則不要隨便調(diào)換。在你瀏覽這些重組序列的時候，應(yīng)該

11、時刻 accept 你認(rèn)為正確的重組序列，這樣有利于你記錄自己的進(jìn)度，也有利于修改RDP 的錯誤，因為一旦RDP 在這里出現(xiàn)錯誤，那么它在后面出現(xiàn)錯誤的幾率也會增大。所以，在accept之后就選擇選項欄的Re-Identifyrecombinant sequences for all unaccepted events ，或者點(diǎn)擊下面的 “Re-scan”按鈕重新進(jìn)行分析。檢測 RDP的誤差可以通過選擇show all evidences 選項 來觀察不同方法檢測到的重組事件的 breakpoints 是否不同， 如果不同的話就值得你人工去觀察到底哪個是正確的。如果你認(rèn)為兩個重組事件來源于一個

12、祖代毒株，可以選擇通過 Merge events 選項將其合并為一個重組事件7.The Plot DisplayKeyPress to abort a checkPlot displayPress to select methodP-value cutoffX and Y coordinatesof the mouse pointerFigure 4.The plot display.See section 8 for details on what is plotted.雙擊這個區(qū)域的任何位置都會在上方的sequence display panel 顯示出相應(yīng)的序列。鼠標(biāo);.移動到任何位置都

13、會顯示出X 軸和 Y 軸的數(shù)值。5.5 The Tree Displays如果你按下“tree ”按鈕 ,一系列表示該重組毒株與其他毒株關(guān)系的樹將會以兩種不同的方式展示如 果 單 擊 屏 幕 頂 部 在 命 令 面 板 的 “tree ”按 鈕 兩 棵 樹 將 會 并 排 顯 示 。 而 如 果 你 按 下recombination information display 上方的 “Tree ”按鈕則會在該區(qū)域顯示一株進(jìn)化樹。點(diǎn)擊右上角的“cycle through trees ”按鈕即可以用該序列的不同部分進(jìn)行做樹分析。包括：（ 1）根據(jù)重組序列的不同部分分別作樹（ 2）只有已確認(rèn)的重組區(qū)域

14、做樹（即用 minorparent部分）（3）只用已確認(rèn)的非重組區(qū)域做樹（即major parent 部分）（4）忽略重組的所有區(qū)域做樹。在同一個頁面顯示兩棵樹可以追蹤一個序列在不同區(qū)域做樹后的變化， 左擊樹上的某個序列可以標(biāo)記這個序列在樹上的位置。 在樹的部位右擊會出現(xiàn)一系列的選項，比如“清除顏色”“自動選擇顏色”“自主選擇顏色”等，可以把樹上的序列分別弄上不同的顏色。你還可以選擇不同方法做樹，包括：neighbourjoining, least squares, maximum likelihood , and Bayesian trees.“Mark sequence name as a

15、lso having evidence of this event”和 “Mark sequence name asnot having evidence of this event . ”項可以使你在樹上手動修改你認(rèn)為選RDP所犯的錯誤，就是如果你認(rèn)為這個序列不屬于這個重組事件你可以把它從該事件中剔除，或這個序列本應(yīng)屬于該重組事件，但RDP把他排除在外了，你可以認(rèn)為把它加進(jìn)去。“Go to sequence name ”選項可以指引你在 schematic sequence display 板塊看到這個序列?！盧echeck plot with sequence name as recomb

16、inant/minor parent/major parent”選項可以使你看到如果你替換了重組序列/ 次要母本 / 主要母本 （即樹中的紅色、藍(lán)色和綠色序列）其中的一個序列后，進(jìn)化樹會變成什么樣子。The Matrix Display點(diǎn)擊主面板上的Matrix 選項，就會顯示出矩陣圖像，有好多種矩陣的顯示方法供你選擇。;.右擊鼠標(biāo)或者點(diǎn)擊主面板上的下拉三角都可以選擇。如果你確定一個重組事件真的發(fā)生了， 這時你就要仔細(xì)檢查 RDP有沒有準(zhǔn)確判斷出重組發(fā)生的位點(diǎn)， 和有沒有夸大或過小分組的現(xiàn)象， 你就要用其他 RDP提供的附加應(yīng)用進(jìn)行驗證。AAAGGCGATAGCAGGTAGGCTTATATTA

17、CGGCATGAGATGTTATCInformation-richAACGCGATTGCAGGAAGGCATATGTTATGGCATCTGAAGATGTTsub-sequenceAAGGCGATTCCTGGAAGCCTTACGTAATGGCATGTCTACTCGATAAGGTGATAGCAGGTAGCCTTACATAATCGCATSelect three sequencesAAGGCGATAGCAGGTAGGCTTACGTTATCGCATand discard allAAGGCGATAGCAGGTGGCCTTACATTATGGCATnon-informative sitesMultiple s

18、equence alignmentMove a sliding window acrosssub-sequence and calculatepairwise identitiesRecord significant evidenceRepeat with the nextof recombinationthree sequencesNN!LP= G X( m!(N-m)!)pNX (1-p) N-mXN m=MCalculate significance where:G is the total number of of possible sequence tripletsCheck for

19、 evidence of recombinationL is the Length of the sequenceN is the length of the putatively recombinant regionm is the proportion of nucleotides in common between the putativerecombinant and parental sequences in the recombiant regionp is the proportion of nucleotides in common between the putativere

20、combinant and parental sequences in the entire sequence.BPotential recombinant region可使用的方法簡介：1.0Positions of informative sitesRDP method, GENECONV, Bootscanning, MaxChi, Cimaera, 3SEQ and SiScan是. 7 種基本驗證ytit程序， LARD, PHYLPRO, distance plots and TOPAL是.四種附加驗證程序。Major parent : recombinant plotnedi R

21、DP：1.07 X 10 -6P-Valuee8.1siGENECONV0.5wrMinor parent : recombinant plotiaPMinor parent : major parent plot0.01760152122823043Position in alignmentFigure 8. The original RDP method. A The analysis procedure. B An example pairwise identity plot.;.AAAGGCGATAGCAGGTAGGCTTATATTACGGCAT AACGCGATTGCAGGAAGGC

22、ATATGTTATGGCAT AAGGCGATTCCTGGAAGCCTTACGTAATGGCAT AAGGTGATAGCAGGTAGCCTTACATAATCGCAT AAGGCGATAGCAGGTAGGCTTACGTTATCGCAT AAGGCGATAGCAGGTGGCCTTACATTATGGCATMultiple sequence alignmentRecord significantfragmentsCalculate significance of fragmentscores by permutation testing and/or calculation of Karlin-Alt

23、shulBLAST-like P-valuesB.Discard monomorphic sitesGCAGATAGTTATCGCCTGAAAGATGTTGGCTCTAACTCGATGSelect 2 sequencesGTAGATACTCAATCGCAGATAGTCGTTCfrom the polymorphicGCAGATGCTCATTGsite alignmentGCAGATAGTTATCGCCTGAAAGATGTTGSelect the nextUsing“ fragment scores”two sequenceslook for regions in the pairwiseali

24、gnment where sequenceshave unusually high similarityFragment score = I -D x NTx GN DWhere:I is the number of identical sites in a fragmentD is the number on non-identical sites in a fragmentN T is the total number of polymorphic sites in the original alignment N D is Total number of non-identical si

25、tes in the sequence pairG is the G-scale value.Potential recombinant region)eulaV-PAK(goL-C)eulaV-PAK(goL-3.7Global P-Value cutoff1.8Local P-Value cutoffHigh scoring aligned pair (HSAP)0.01760152122823043Position in alignmentPotential recombinant region3.3Global P-Value cutoffMinor parent : recombin

26、ant HSAP1.6Local P-Value cutoffMajor parent : recombinant HSAP0.0Minor parent : major parent HSAP1760152122823043Position in alignmentFigure 9.The GENECONV method.AThe analysis procedure.BAnexample plot of high scoring aligned pairs (HSAPs or fragments).C Anexample plot in which GENECONV is used to

27、check the RDP derived result in Fig 8 B.8.2 Bootscanning8.3;.注意事項： RDP4只是一種檢測手段，也會出現(xiàn)很多的錯誤，不能完全依賴RDP4來判斷重組。我們可以從以下幾方面入手來減少RDP4 發(fā)生錯誤的概率：1、盡量多收集與你最感興趣的序列同源性大于50%的序列，盡可能搜集全。ASelect 3 sequences anddiscard monomorphic sitesAAGGCGATAGCAGGTAGGCTTATATTACGGCATGAGATGTTATCAACGCGATTGCAGGAAGGCATATGTTATGGCATCTGAAG

28、ATGTTSelect 2 sequencesAAGGCGATTCCTGGAAGCCTTACGTAATGGCATGTCTACTCGATAAGGTGATAGCAGGTAGCCTTACATAATCGCATfrom the polymorphicAAGGCGATAGCAGGTAGGCTTACGTTATCGCATAAGGCGATAGCAGGTGGCCTTACATTATGGCATsite alignmentMultiple sequence alignmentGAGATGTTATCCTGAAGATGTTRepeat with the nextMove a sliding window with athr

29、ee sequencescentral partition across the pair-wise alignment and calculate aRecord significant evidence2 of the difference between2x2of recombinationthe proportions of sites occupiedby the same and different baseson either side of the partitionRepeat with the next 2sequences or proceedto the next stepWhen all three pairwise scans are completecheck significance of peaks using2P-value and/or a permutation test andmatch peaks to find recombinant regionsCheck for evidence ofrecombination breakpointsBPo