微生物英文文獻(xiàn)及翻譯—翻譯

1、微生物英文文獻(xiàn)及翻譯翻譯A/O法活性污泥中氨氧化菌群落的動(dòng)態(tài)與分布摘要：我們研究了在厭氧好氧序批式反應(yīng)器（SBR）中氨氧化菌群落（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌群落（NOB）的結(jié)構(gòu)活性和分布。在研究過程中，分子生物技術(shù)和微型技術(shù)被用于識別和鑒定這些微生物。污泥微粒中的氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)大體上與初始的接種污泥中的結(jié)構(gòu)不同。與顆粒形成一起，由于過程條件中生物選擇的壓力，AOB的多樣性下降了。DGGE測序表明，亞硝化菌依然存在，這是因?yàn)樗鼈兡苎杆俚倪m應(yīng)固定以對抗洗滌行為。DGGE更進(jìn)一步的分析揭露了較大的微粒對更多的AOB種類在反應(yīng)器中的生存有好處。在SBR反應(yīng)器中有很多大小不一的微粒共存，顆粒的直徑影響這

2、AOB和NOB的分布。中小微粒（直徑0.9mm）可以使含氧量降低從而限制NOB的生長。所有這些研究提供了未來對AOB微粒系統(tǒng)機(jī)制可能性研究的支持。關(guān)鍵詞：氨氧化菌（AOB），污泥微粒，菌落發(fā)展，微粒大小，硝化菌分布，發(fā)育多樣性 簡介在濃度足夠高的條件下，氨在水環(huán)境中對水生生物有毒，并且對富營養(yǎng)化有貢獻(xiàn)。因此，廢水中氨的生物降解和去除是廢水處理工程的基本功能。硝化反應(yīng)，將氨通過硝化轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，是去除氨的一個(gè)重要途徑。這是分兩步組成的，由氨氧化和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌完成。好氧氨氧化一般是第一步，硝化反應(yīng)的限制步驟：然而，這是廢水中氨去除的本質(zhì)。對16S rRNA的對比分析顯示，大多數(shù)活性污泥里的氨氧

3、化菌系統(tǒng)的跟-變形菌有關(guān)聯(lián)。然而，一系列的研究表明，在氨氧化菌的不同代和不同系有生理和生態(tài)區(qū)別，而且環(huán)境因素例如處理常量，溶解氧，鹽度，pH，自由氨例子濃度會(huì)影響氨氧化菌的種類。因此，廢水處理中氨氧化菌的生理活動(dòng)和平衡對廢水處理系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和運(yùn)行是至關(guān)重要的。由于這個(gè)原因，對氨氧化菌生態(tài)和微生物學(xué)更深一層的了解對加強(qiáng)處理效果是必須的。當(dāng)今，有幾個(gè)進(jìn)階技術(shù)在廢水生物處理系統(tǒng)中被用作鑒別、刻畫微生物種類的有價(jià)值的工具。目前，分子生物技術(shù)的應(yīng)用能提供氨氧化菌群落的詳細(xì)分類說明。如今，主要由于其細(xì)胞固定策略，好氧污泥顆粒處理已經(jīng)成為傳統(tǒng)廢水處理的替代工藝。顆粒有更加徹底的緊密結(jié)構(gòu)和快速適應(yīng)速率。因此，顆

4、粒污泥系統(tǒng)比傳統(tǒng)活性污泥法有更高的混合懸浮固體濃度濃度(MLSS)和更長的污泥齡(SRT)。更長的污泥齡能提供足夠長的時(shí)間讓時(shí)代時(shí)間長的微生物生長(例如氨氧化菌)。有些研究表示，硝化顆粒可以在富銨離子廢水中培養(yǎng)出來，并且顆粒的直徑很小。其他研究報(bào)告說，大直徑顆粒已經(jīng)在序批式反應(yīng)器(SBR)中人工合成的有機(jī)廢水里培育出來了。污泥顆粒里的大量不同微生物共存，并去除COD和氮磷。然而，對于直徑大于0.6mm的大顆粒來說，由于氧傳遞被限制不能到達(dá)顆粒核心，外部好氧殼和內(nèi)部厭氧地帶共存。這些特性表明，大顆粒污泥內(nèi)部環(huán)境不適合氨氧化菌的生長。有些研究表明，顆粒大小和密度導(dǎo)致了氨氧化菌、亞硝酸氧化菌和反硝化

5、菌的分布和優(yōu)勢種群。雖然不少研究力求評估廢水處理系統(tǒng)中氨氧化菌的生態(tài)生理，但是至今仍然被污泥顆?；^程的水力學(xué)、分布、氨氧化菌群落的數(shù)量化限制著。 原理和方法 反應(yīng)器設(shè)置和操作污泥顆粒被接種在有效體積為4L的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的SBR里。反應(yīng)器有效直徑和高度分別為10cm和51cm。水力停留時(shí)間設(shè)為8h。來自全尺寸污泥處理設(shè)置(中國天津污水處理廠)的活性污泥被作為反應(yīng)器的種污泥，其MLSS初始濃度為3876mg/L。反應(yīng)器操作6小時(shí)為一循環(huán)，由2分鐘的進(jìn)水時(shí)間，90分鐘厭氧混合，240反正拋棄階段和5分鐘出水階段組成。在20天80個(gè)SBR循環(huán)后，污泥沉降時(shí)間逐漸從10分鐘降到5分鐘，并且只有沉降速度大

6、禹4.5m/h的顆粒才能在反應(yīng)器中停留。入流中的主要化合物包括NaAc(450mg/L)，NH4Cl(100mg/L)，(NH4)2SO4(10mg/L)，KH2PO4(20mg/L)，MgSO47H2O(50mg/L)，KCl(20mg/L)，CaCl2(20 mg/L)，F(xiàn)eSO47H2O(1mg/L)，pH 7.0-7.5，and 0.1 mg/L元素示蹤劑。分析方法-TOC、TN、TP、MLSS、SVI都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法定期檢測。污泥大小分布由篩法決定。4個(gè)干凈的直徑為5cm鋼制篩，篩孔直徑分別0.9,0.6,0.45,和0.2mm，這4個(gè)篩子被全程監(jiān)控。用友刻度的圓柱從反應(yīng)器中取100m

7、L的污泥，然后放到0.9mm篩孔的篩子上。隨后用蒸餾水沖洗，直徑小于0.9mm的顆粒通過這個(gè)篩子，到達(dá)篩孔更小的篩子上。沖洗過程要重復(fù)幾次，以分開污泥團(tuán)。不同面上收集到的顆?；謴?fù)用蒸餾水反沖洗。每一部分都手機(jī)在不同的燒杯里，然后用量化的濾紙過濾來測定TSS。一旦留在各個(gè)篩子上TSS的數(shù)量確定了，就可以確定不同大小的顆粒占污泥總重的比例了。 DNA提取和PCR-DGGE來自大約8mg的MLSS種的污泥被轉(zhuǎn)化成1.5mL的Eppendorf管，然后在14000g條件下離心10分鐘。移除上清液，向其中加入1mL磷酸鈉緩沖液，然后在無菌條件下研磨以分離顆粒。使用E.Z.N.A.Soil DNA工具，離

8、心物種DNA染色體被分離。為了放大氨氧化菌特征16s rRNA來進(jìn)行DGGE，一個(gè)巢式PCR被用為先前描述。30l的巢式PCR放大劑被加載并被在聚丙烯酰胺凝膠上的加了線性分布為35%-55%的變性劑DGGE分開。這個(gè)膠體在維持60度、140V、1TAE緩沖液中(通用突變檢測系統(tǒng))運(yùn)行6.5h。電泳結(jié)束后，銀染色和膠體的發(fā)展表現(xiàn)正如Sanguinetti所表述。接下來是空氣干燥和用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。凝膠掃描圖像用Quantity One分析，版本號4.31。成對群落相似性的色子指數(shù)是計(jì)算評估氨氧化菌群落在DGGE中線路相似性的。這個(gè)用Quantity One測出的指數(shù)范圍從0%(無共同頻帶)

9、到100%(頻帶相同)。Shannon多樣性指數(shù)（H）是用來衡量將一個(gè)菌群中每個(gè)菌種的豐富度和比例加入考慮的微生物多樣性。H用下列等式計(jì)算：其中，ni/N表示i菌種占總?cè)郝涞谋壤?i條帶亮度在條帶總亮度中的比例)。微生物系統(tǒng)樹圖模板相似性使用Quantity One不用非加權(quán)配對組算術(shù)平均數(shù)（UPGMA法）算法就能計(jì)算出來。突出的DGGE條帶被切除并溶解在30mL Milli-Q水中過夜，溫度維持4攝氏度。在冷凍解凍3次后凝膠中的DNA被回收。目標(biāo)DNA片段的克隆及測序按照既定的方法（Zhang等，2010）進(jìn)行。 硝化細(xì)菌的分布為了調(diào)查AOB和NOB在顆粒中的空間分布，3種大小(0.2-0.

10、45,0.45-0.6,0.9 mm)的顆粒在第180天被選定做FISH分析。2mg的污泥樣品被固定在在4攝氏度下的4多聚甲醛溶液16-24 h，然后用磷酸鈉緩沖液沖洗兩次；樣本分別在在50%，80%和100%的乙醇中脫水10分鐘。在室溫下，將顆粒在乙醇二甲苯體積比分別為3:1，1:1，1:3然后100%二甲苯的溶液中連續(xù)浸泡，每次10分鐘后，顆粒中的乙醇然后完全被二甲苯取代。隨后，將顆粒在二甲苯與石蠟體積比為1:1的60度溶液中浸泡30分鐘，接著再在100%石蠟溶液中浸泡30分鐘，顆粒被石蠟嵌入。在石蠟固化后，切為8mm厚的片，放置在涂了明膠的顯微鏡上。將切片在二甲苯和乙醇中各浸泡30分鐘，

11、石蠟被去除，然后將切片干燥。三個(gè)寡核苷酸探針被用于雜交：FITC標(biāo)記為Nso190，指明了大多數(shù)AOB；TRITC標(biāo)記為NIT3，指明了硝化sp。所有的探針序列，雜交條件，以及洗滌條件都在表1中給出。寡核苷酸的合成以及熒光標(biāo)記都來自Takara公司。雜交是在包含了各個(gè)標(biāo)記了的探針(5ng /L)的46攝氏度度雜交緩沖液(0.9M NaCl,甲酰胺的百分比見表1，20mM Tris/ HCl，pH值8.0，0.01% SDS)下進(jìn)行了2小時(shí)。雜交后，未被結(jié)合的寡核苷酸由一個(gè)嚴(yán)格的洗滌步驟去除：在48度與洗滌液含有相同化合物的緩沖液中洗滌15分鐘。為了所有DNA的探測，DAPI被用甲醇最終稀釋到濃

12、度為1ng /L。將切片用DAP-Iemethanol覆蓋并保持恒溫37度15分鐘。然后將切片用甲醇清洗一次，再用蒸餾水簡單清洗，完了立刻空氣干燥。使用Vectashield(媒介實(shí)驗(yàn)室)以防止照片變白。使用激光共聚焦顯微鏡來抓拍雜交圖像(CLSM,Zeiss 710)。每種顆粒大小的每個(gè)探頭都各自一共拍了10張圖像。最后使用Adobe PhotoShop選出代表圖像和最終圖像的評價(jià)。表1：用于不同大小顆粒的寡核苷酸探針圖1：生物量和SVI10在整個(gè)操作過程中的變化 結(jié)果 SBR性能及顆粒特征在啟動(dòng)階段，反應(yīng)器能高效去除TOC以及氨氮。98%的氨氮和100%的TOC分別在第3天和第5天從入流中

13、被去除(圖S2，S3)。這一期間總氮和總磷的去除率不高，雖然總磷的去除率逐漸提高，在第33天達(dá)到100%(圖S4)。為了確定污泥顆粒的污泥體積指數(shù)，沉淀時(shí)間由10分鐘代替30分鐘，因?yàn)轭w粒污泥在60分鐘和5分鐘后有一個(gè)相似的SVI數(shù)值。接種污泥的SVI值是108.2Ml/g。在連續(xù)操作中MLSS和SVI10的變化如圖1所示。污泥沉降性在設(shè)置階段明顯提升。圖2反應(yīng)了污泥顆粒的慢速形成，從流動(dòng)態(tài)到顆粒狀態(tài)。 DGGE技術(shù)分析：AOB的群落結(jié)構(gòu)在污泥顆?；械淖兓彩絇CR的結(jié)果在圖S1中顯示。在GSBR的操作中，較好顯示的DGGE條帶被在代表性點(diǎn)上得到，那些條帶揭示AOB群落的結(jié)構(gòu)在污泥顆?；头€(wěn)

14、定化過程中是動(dòng)態(tài)的(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的菌群結(jié)構(gòu)與初始接種污泥的菌群結(jié)構(gòu)是不同的。AOB群落在第一天和GSBR操作的最后僅有40%的相似度，指明接種污泥和形成的顆粒污泥中AOB群落有重大變化。通過計(jì)算Shannon指數(shù)H分析DGGE模板得出的生物多樣性見圖5.圖2：污泥中顆粒大小分布在操作過程中的變化圖3：AOB群落在污泥顆?；^程中DGGE分析(頂部表示取樣時(shí)間)。主要條帶已用數(shù)字標(biāo)出(條帶1-15)在污泥接種階段(在第38天前)，指數(shù)H由于反應(yīng)器中一些菌種的消失明顯下降。雖然幾種接種污泥中的優(yōu)勢菌種(條帶2,7,10,11)得以保留，但是許多條帶削弱或消失了(條帶3,4,6,8,13,14

15、,15)。在第45天后，多樣性指數(shù)趨于穩(wěn)定，并且顯示流動(dòng)性變小(從0.72到0.82)。模板條帶相似性利用UPGMA程序分析。UPGMA分析顯示三個(gè)組菌落群相似度約為67%-78%，群體內(nèi)部約為44%-62%。一般來說，第一組與污泥接種和沖刷有關(guān)，第二組與污泥顆?；癝VI10值下降有關(guān)，第三組和穩(wěn)定系統(tǒng)及優(yōu)良的生物沉淀性有關(guān)。圖4：AOB菌落DGGE條帶的UPGMA分析樹圖。羅馬數(shù)字顯示主要集群。在圖3中，占優(yōu)條帶被從膠體中切除。這些條帶中的DNA被再次放大，克隆及排序。對這些部分的16S rRNA排序(表2和圖S6)的比較分析揭露了補(bǔ)償了的13序列的系統(tǒng)附屬樹。在接種污泥中，細(xì)菌大多由亞硝

16、化菌和亞硝化螺菌組成。隨著污泥顆?；M(jìn)行，大多數(shù)亞硝化菌(條帶2,5,7,9,10,11)仍然保留或者最終變?yōu)镚SBR的主導(dǎo)；然而，所有的亞硝化螺菌(條帶6,13,15)都從反應(yīng)器中逐漸消失。 AOB和NOB在不同尺寸顆粒中的分布我們使用FISH來確定AOB和NOB在不同尺寸污泥顆粒中的分布，得出的圖像并沒有進(jìn)一步分析得出細(xì)胞數(shù)量。如圖6所示，在小顆粒(0.2 mmd0.45 mm)中，AOB主要分布在顆?？臻g的外部。在中等顆粒(0.45 mmd0.9 mm)中，AOB和NOB大都處于顆粒的表面，更有甚者，NOB開始變得稀有。 討論 污泥顆粒形成與反應(yīng)器性能之間的關(guān)系在第32天后，SVI10穩(wěn)

17、定在20-35mL/g，相對于測得的活性污泥的SVI10(100-150 mL/g)，這是一個(gè)非常低的數(shù)值。然而，在第32天測得的顆粒大小分布(圖2)表面僅有22%的生物量是由直徑大于0.2mm的顆粒污泥組成的。這些結(jié)果表面污泥沉降性提升提前于顆粒的形成，并在GSBR操作過程中不受不同污泥顆粒大小的影響。然而我們觀察到，顆粒直徑在較長時(shí)間內(nèi)一直波動(dòng)。大顆粒由于生物內(nèi)部呼吸趨于不穩(wěn)定，并分裂成可以再次形成大顆粒的小種子顆粒。Pochana和Keller報(bào)告說，通過物理破碎形成的污泥絮體有助于降低反硝化速率，因?yàn)槠錅p少的缺氧空間。所以，在這次試驗(yàn)過程中，總氮的去除率也是波動(dòng)的。一些先前研究已經(jīng)證明

18、，更大體積、更大密度的顆粒青睞于富裕的PAO。因此，在第77天后，總磷的去除率變得更高并相對穩(wěn)定，這是由于顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上了，并且有更大的顆粒形成了。 AOB群落動(dòng)態(tài)與污泥顆?；年P(guān)系為了顆粒形成，我們設(shè)定了小段的沉淀時(shí)間，并且僅有沉淀速度大于4.5m/h的顆粒才會(huì)在反應(yīng)器中去除。而且正如圖1所示，SVI10值的變化在第41天前很大(從108.2mL/g-34.1 mL/g)。在這一期間，大量微生物不能再反應(yīng)器中生存。我們觀測到一個(gè)明顯的菌數(shù)量增長，與第8天與第18天(表S1)有58%的相似性。在用基于醋酸合成廢水喂養(yǎng)的SBR系統(tǒng)中，非自養(yǎng)菌能比自養(yǎng)菌產(chǎn)生大量更多的胞外多糖。一些研究

19、者發(fā)現(xiàn)，微生物在高剪切力的環(huán)境中會(huì)粘附胞外聚合物質(zhì)以抵抗由于環(huán)境壓力導(dǎo)致的懸浮細(xì)胞的傷害。而且，已經(jīng)被證明的是，接種污表2：選中的DGGE條帶的微生物種類鑒別泥中的優(yōu)勢異養(yǎng)菌在我們先前的研究中得以保存。眾所周知，AOB是生長緩慢的化能自養(yǎng)菌，因此，大量數(shù)量和密度不能變的足夠大以快速沉淀的群落被從系統(tǒng)中洗出去。作為結(jié)果，AOB在污泥接種階段的變化很明顯，多樣性指數(shù)快速下降。在第45天后，由于污泥穩(wěn)定性的發(fā)展和更多微生物的保留，AOB群落的結(jié)構(gòu)變的穩(wěn)定。這些結(jié)果表明，短沉淀時(shí)間(選擇壓力)表面上能給微生物加壓，導(dǎo)致AOB群落處于暴力動(dòng)態(tài)中。這些結(jié)果更進(jìn)一步說明，特定數(shù)目的微生物可能歸功于GSBR操

20、作上的成功，而且能得以持續(xù)，不管在群體相似性方面波動(dòng)有多大。這些細(xì)菌群體的不穩(wěn)定性，加上一般可接受的生物反應(yīng)器性能，是符合從處理灰水的MBR所得到的結(jié)果的。亞硝化螺菌屬和亞硝化菌屬是廢水處理系統(tǒng)中AOB群落的主體。一個(gè)新先前研究揭露，AOB群落的主導(dǎo)群體十余多種污水處理過程不同的。一些研究者發(fā)現(xiàn)，在MBRs中是亞硝化菌為菌落主體，而在生物濾池中則是亞硝化螺菌屬為菌落主體。在現(xiàn)今的研究中，序列分析表明選擇壓力明顯對顆粒污泥中的亞硝化菌生存有影響。幾乎所有的亞硝化菌一開始就被洗出，他們沒有機(jī)會(huì)跟著環(huán)境變化進(jìn)化。然而，一些亞硝化螺菌屬的成員能產(chǎn)生更多兩的EPS，特別是處于氨被限制的條件下；而且這種特

21、性也同一條帶上的其他成員身上觀察到。由此，這些EPS對群落細(xì)胞之間以及顆粒污泥是有幫助的。因此，大多數(shù)亞硝化螺菌能適應(yīng)這一挑戰(zhàn)(體積和密度變得足夠大以快速沉淀)并在反應(yīng)器中保存。在反應(yīng)器操作的最后(第180天)，不同大小的顆粒被過濾出來。我們研究了污泥顆粒大小變化對AOB群落組成的影響。如圖5所示，不同大小顆粒的AOB群落結(jié)構(gòu)不同。雖然集中主導(dǎo)條帶(條帶2，5，11)。在所有樣品中都出現(xiàn)了，僅有條帶3和6在直徑大于0.6mm的顆粒上出現(xiàn)。同時(shí)，條帶7和10在直徑大于圖5：不同大小顆粒AOB群落的DGGE文件0.45mm的顆粒上強(qiáng)烈顯示。根據(jù)表2，我們可以清晰的推斷，亞硝化菌僅僅能在直徑大于0.6mm的顆粒上存在。因此，亞硝化菌在圖3上幾乎不存在，這是由于反應(yīng)器操作中，在TSS中的大顆粒分?jǐn)?shù)較低所導(dǎo)致的。DGGE分析也解釋，大顆粒有比小顆粒更豐富的生物多樣性。這一結(jié)果也闡明，由于更大的空間和更適合生長的環(huán)境，更多的微生物能在大顆粒上生存(圖6)。圖6：不同直徑污泥顆粒微生物FISH分析結(jié)果 顆粒大小對AOB和NOB分布的影響雖然實(shí)驗(yàn)中進(jìn)水顆粒大小已經(jīng)被觀測，并模擬同時(shí)脫氮除磷，顆粒大小對不同生物種類分布的影響需要更進(jìn)一步的研究，這一研究將借助可見的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是在有同樣大小顆粒污泥的反