小麥種子發(fā)芽率的測定及干旱脅迫概要

1、yu n n an normal u n iver s ity2016-2017學(xué)年上學(xué)期植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)科技論文題 目小麥種子發(fā)芽率的測定及干旱脅迫對小麥部分生理生化指標(biāo)的影響姓名王曉云學(xué)號1443204000306院、系生命科學(xué)院學(xué)院專業(yè)應(yīng)用生物科學(xué)2016年12月29日小麥種子發(fā)芽率的測定及干旱脅迫對小麥部分生理生化指標(biāo)的影響王曉云，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，14應(yīng)用生物科學(xué)班，1443204000306 摘要：本論文主要研究了干旱脅迫對小麥以下生理生化指標(biāo)：脯氨酸(pro)、丙二醛(mda)、過氧化氫(h2o2)、抗氧化酶(ppo、pod)、谷胱甘肽(gsh)的含量的影響。本實(shí)驗(yàn)選用小麥

2、種子及其幼苗作為實(shí)驗(yàn)材料， 用快速測定方法測定小麥種子的發(fā)芽率，同時在實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)立對照組和實(shí)驗(yàn)組 測定小麥幼苗干旱脅迫生理生化指標(biāo)并對其抗旱性進(jìn)行評估。所有干旱脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)生理生化指標(biāo)的含量都采用分光光度計測定；根據(jù)對照組和實(shí)驗(yàn)組所 得的數(shù)據(jù)分析后表明干旱對小麥的生理生化指標(biāo)的含量都有一定的影響，經(jīng)干旱脅迫后小麥中pro、mda、h2o2、ppo、pod、gsh的含量相比正常生長條件 下的小麥含量都呈現(xiàn)上升的趨勢?？傮w而言，受干旱脅迫的小麥的抗旱性強(qiáng)于普通生長的小麥。關(guān)鍵詞：小麥、干旱脅迫、pro、mda、h2o2、ppo gsh、wss、pod引言：植物生活的環(huán)境不是恒定不變的，我國幅

3、員遼闊，地形復(fù)雜，氣候多變， 植物的抗逆性機(jī)理與農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)關(guān)系密切。對植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境稱為逆境，又 叫脅迫。脅迫包括生物脅迫和非生物脅迫。生物脅迫(biotic stress)有病害，蟲 害和雜草；非生物脅迫(abiotic stress)包括寒冷，高溫，干旱，鹽漬，水澇等。1小麥?zhǔn)俏覈狈降貐^(qū)的主要糧食作物，但是近幾年隨著氣候的變化，小麥產(chǎn)量安全問題日益突出。植物最常遭受的有害影響就是缺水，即干旱脅迫。干旱脅迫后，sod、pod和cat等組成的保護(hù)酶系在清除活性氧、保持細(xì)胞膜穩(wěn)定性 方面起著重要的作用。植物體內(nèi)游離脯氨酸和可溶性蛋白可作為胞質(zhì)滲壓劑也對 低溫脅迫下的植物細(xì)胞起保護(hù)作用。3本

4、試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了前人研究的結(jié)果， 同時發(fā)現(xiàn)干旱脅迫對細(xì)胞膜透性的影響較少?？梢姼珊祵π←湹纳怼⑸籍a(chǎn)生重要的影響，進(jìn)而影響小麥的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，為了減小環(huán)境對 小麥生產(chǎn)的影響，有必要從小麥的各項生理生化指標(biāo)含量的變化，來研究干旱脅 迫對小麥的影響，從而找到合適的方法來解決干旱脅迫問題，解決小麥生產(chǎn)安全 問題提供理論依據(jù)。1 .材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料小麥種子及小麥幼苗1.2 實(shí)驗(yàn)材料的選取和培養(yǎng)小麥種子預(yù)先在25c的培養(yǎng)箱里于蒸儲水中吸脹12h。隨機(jī)取60粒吸脹的 小麥種子，用刀片沿胚的中線切成兩半（嚴(yán)格區(qū)分兩個半粒），一半放入一只燒 杯中，另一半放入領(lǐng)一只燒杯中進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)

5、：其中30個半粒進(jìn)行ttc染色（30c水浴20 min）另30個半粒進(jìn)行曙紅染色（室溫染色10 min）洗凈后觀察ttc染色組直接觀察胚的著色情況，而紅墨水染色組需用自來水漂洗種子至洗液無色為止，然后再觀察胚的著色情況取經(jīng)上述發(fā)芽率快速測定的同一批次的小麥種子，以0.1% hgcl2消毒10 min后,漂洗干凈，于26c下吸脹12 h,播于墊有6層濕潤濾紙的帶蓋白磁盤中，每盤 200 300粒，于26c下黑暗中萌發(fā)2.53天。選取長勢一致的小麥幼苗待用。3 1.3干旱脅迫處理把上述小麥幼苗分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，將實(shí)驗(yàn)組用peg溶液澆灌處理；對照組小麥苗仍然用蒸儲水澆灌繼續(xù)培養(yǎng)。處理結(jié)束后，把小麥

6、幼苗轉(zhuǎn)移到26c下恢復(fù)培養(yǎng)7天，每天光照12h,觀察對比實(shí)驗(yàn)組和對照組小麥苗生長差異變 化情況。1.4 測定抗逆指標(biāo)含量（按照李忠光老師上課時在ppt上展示的操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。）1.4.1 測定抗逆指標(biāo)脯氨酸（pro）的含量pro的提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對照組的小麥幼苗，加入 3 ml 3%磺基水楊酸（ssa）和少許石英砂，充分研磨后用2 ml 3% ssa沖洗研缽，用離心機(jī)5000 rpm離心10 min,取其上清液并記錄體積。測定：取上精液各2 ml,分別加入2 ml冰乙酸和2 ml西三酮試劑，水浴煮沸 15 min,冷卻后再5000 rpm離心10 min （若沒沉淀可略此步驟）

7、， 分別測定 a520。（運(yùn)用紫外分光光度法測定。）i _(mol.g 1fw)a520v 總pro content =v顯l wv用1.4.2 測定抗逆指標(biāo)可溶性糖和丙二醛（mda）的含量提取：分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對照組小麥幼苗，加入 3 ml 10%tca和少許 石英砂充分研磨后用2 ml 10%tca洗研缽，5000 rpm離心10 min,取其上清 液并記錄體積。測定：分別取上精液各2ml,加入0.5%tba （用10%tca配制）3ml,水 浴煮沸15 min,冷卻后用離心機(jī)5000 rpm離心5 min （視沉淀有無），分別測 定od450和od532。（運(yùn)用紫外分光光度法測定

8、。）od450=c1 85.4od532=c1 7.4+15500 c2求解方程得：c1/（mmol/l）=11.71od450c2/（umol/l）=6.45od532 - 0.56od450公式中c1為可溶性糖的濃度；c2為mda濃度。1.4.3 測定抗逆指標(biāo)h2o2的含量h2o2提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對照組小麥幼苗，加入 3ml 0.3%三氯乙 酸（tca）和少許石英砂，充分研磨后用 2mltca洗研缽，用離心機(jī)5000 rpm離 心10 mi,取其上精液并記錄體積。測定：分別取上精液各 4ml,加入0.1%ti（so4）2 用20%（v/v） h2so4配制 0.2ml, 搖勻

9、， 用離心機(jī) 5000 rpm 離心 10 min, 測定 od410。（h2o2）a410父v顯父1.4.4 測定抗逆指標(biāo)抗氧化酶（pod）的含量抗氧化酶的提?。悍謩e取對照組和實(shí)驗(yàn)組小麥幼苗 0.1 g作為實(shí)驗(yàn)材料，加 入少許石英砂和 3 ml提取液（50mmol/l pbs, ph6.0，內(nèi)含0.1mmol/ ledta, 1%pvp）,充分研磨后完全轉(zhuǎn)入離心管中，再用 2 ml提取液洗研缽，5000 rpm 離心10 min ,記錄上精液體積，用于測定 pod和ppo酶活性。pod測定：取pod反應(yīng)混合液（10mmol/l愈創(chuàng)木酚，5 mmol/l h2o2，用 pbs溶解）2.95 m

10、l,加入酶液50 ml （空白調(diào)零用pbs取代），立即記時，搖勻， 讀出反應(yīng)0.5和1.5min時的a470。ppo測定：取ppo反應(yīng)混合液（20 mmol/l鄰苯二酚，用pbs溶解）2.9 ml, 加入酶液0.1 ml （空白調(diào)零用提取液取代），立即記時，搖勻，讀出反應(yīng) 0.5和 1.5min 時的 a410。以每分鐘a值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（u）,則：a470v顯w ta410v總 x 0.01 w t w1.4.5 測定抗逆指標(biāo)gsh的含量gsh的提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對照組的小麥幼苗，加入 3ml 5%三氯 乙酸（tca）和少許石英砂，充分研磨后用 2ml

11、 5% tca洗研缽，5000 rpm離 心10 min ,上精液并記錄體積。測定：上精液各1ml （空白用3%三氯乙酸代替），分別加入0.4mlm naoh、 1ml 2mm dtnb ,然后于 25 c下 5 min,測定 a412a4121 _(mol.g 1fw)22 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析對小麥種子發(fā)芽率及經(jīng)干旱脅迫后小麥中 pro、mda、h2o2、ppo pod、 gsh的含量的測定，與正常生長的小麥做比較，得出干旱脅迫對小麥部分生理 生化指標(biāo)的影響。計算分析中需要用到的各項指標(biāo)單位：pro 含量單位：umol.g-1 fw;可溶性糖含量單位：mmol/l;內(nèi)二醛含量單位：umol/l

12、oh2o2 含量單位：umol.g -1 fw;pod 活性單位：mol.g-1fwmin-1;ppo活性單位：u.g-1fw;gsh 含量單位：umol.g-1 fw;2.1 小麥種子發(fā)芽率測定2.1.1 刁、麥種子發(fā)芽率的測定結(jié)果和計算隨機(jī)抽取六十粒種子，對半切開，每組染色 60半粒。ttc染色：具有生命活力的有60半粒（胚紅色，胚乳顏色較淺甚至發(fā)白）；曙紅染色：具有生命活力51半粒（胚乳沒被染紅），不具生命力的 9半粒 （胚乳和胚一起被染紅）。表一ttc染色和曙紅染色測定小麥發(fā)芽率結(jié)果*發(fā)芽率活性小麥（半粒）ttc 染色60100曙紅染色5185注：*占計數(shù)種子的百分比。2.1.2 刁、

13、麥種子發(fā)芽率結(jié)果分析從表一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，用ttc染色測定的小麥發(fā)芽率要比用曙紅染色的 發(fā)芽率高。但是在實(shí)驗(yàn)中我們是將同一顆種子分成兩半，應(yīng)該不存在發(fā)芽率的差 異?？赡苁窃趯?shí)驗(yàn)過程中，由于曙紅染色的個體較難分辨而產(chǎn)生結(jié)果的誤差。兩組種子的發(fā)芽率都超過了 85%,說明這一批種子的生命活力較高。在實(shí)驗(yàn)中，ttc染色中胚被染紅和胚乳顏色有一定的差異，而這個差異比較 明顯。ttc （2,3,5一氯化三苯基四氮唾）是脂溶性光敏感復(fù)合物，1894年首次合 成用來檢測種子的生存能力，1958年開始用來染色檢測哺乳動物組織的缺血梗 塞。它是呼吸鏈中叱噬一核昔結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反 應(yīng)而

14、呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白。曙紅染色液進(jìn)行染色時小麥種子胚乳被染紅是死種子的標(biāo)志。因?yàn)榕呷樯弦?有胚乳細(xì)胞，每一種活細(xì)胞膜都具有一定的選擇透過性不易把外界的放進(jìn)來，但是如果小麥種子失去了活力胚乳細(xì)胞死亡，則其細(xì)胞膜失去選擇透過性胚乳就會 被染紅。2.2 旱脅迫對小麥幼苗脯氨酸（pro）含量的影響2.2.1 .干旱脅迫對小麥幼苗pro含量測定結(jié)果現(xiàn)象：提取液經(jīng)過離心以后會變紅，無沉淀產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)處理：表二 小麥幼苗脯氨酸（pro）含量od520pro 含量實(shí)驗(yàn)組2.8920.089對照組0.0490.0022.2.2 干旱脅迫小麥幼苗pro含量變化

15、的影響的分析實(shí)驗(yàn)中經(jīng)離心后變紅，無沉淀產(chǎn)生，可能是因?yàn)樵诒敬卧囼?yàn)脯氨酸被3ml3%磺基水楊酸（ssa）酸化而變紅。3從表二可以看出，小麥在干旱脅迫下時的脯氨酸的含量很高，為正常植株中的脯氨酸含量的44.5倍，這說明正常情況下小麥胚芽鞘內(nèi)脯氨酸含量較低，但 當(dāng)遇到干旱脅迫時小麥胚芽鞘內(nèi)的含量可以增加數(shù)十倍甚至幾百倍。這一結(jié)果與山東農(nóng)業(yè)科學(xué)洪法水李樊和在研究自然干旱脅迫下小麥品種游離脯氨酸與抗旱 性的關(guān)系所得到的結(jié)果一致。42.3 干旱脅迫下小麥幼苗可溶性糖，mda的含量測定2.3.1 干旱脅迫下小麥幼苗可溶性糖， mda變化情況的結(jié)果數(shù)據(jù)現(xiàn)象：無懸浮物，無沉淀產(chǎn)生，無明顯顏色變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)

16、處理表三小麥幼苗mda含量及可溶性糖含量小麥mda含量可溶性糖含量實(shí)驗(yàn)組0.11624.693對照組0.0702.7282.3.2 干旱脅迫對小麥幼苗可溶性糖，mda的影響分析實(shí)驗(yàn)說明無沉淀產(chǎn)物產(chǎn)生，對測量其含量無影響。從表三可以看出，通過對照組對比，實(shí)驗(yàn)組可溶性糖和mda的含量明顯增加。在干旱的脅迫下會使植物葉片 mda和可溶性糖大量積累。peg模擬干旱脅迫使可溶性糖含量大幅提高?？扇苄蕴鞘巧矬w內(nèi)重要成 分之一，是生物體中的重要能源和碳源5?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以降低細(xì) 胞的滲透勢以維持細(xì)胞的膨壓，防止細(xì)胞內(nèi)大量的被動脫水。mda在逆境脅迫條件下，植物往往發(fā)生膜脂過氧化作用.質(zhì)膜相對

17、透性的大小是 膜傷害的重要標(biāo)志之一。mda是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其積累是活性氧毒害 作用的表現(xiàn)。mda含量通常被作為判斷膜脂質(zhì)過氧化作用的指標(biāo)7。細(xì)胞膜透 性和mda含量的的變化是植物細(xì)胞月i脂透過反應(yīng)的表現(xiàn)，mda能與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，從而引起細(xì)胞內(nèi)各種膜的損傷，當(dāng) mda含量大量增加時，表明體內(nèi)細(xì)胞受到嚴(yán)重的破壞，膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，細(xì)胞功能下降0小麥幼苗在peg溶液干旱處理后其mda大量積累以增加其抗旱能力。2.4 干旱脅迫下小麥幼苗h2o2的含量的測定2.4.1 干旱脅迫下小麥幼苗h2o2含量測定的結(jié)果和現(xiàn)象現(xiàn)象：無明顯變化結(jié)果和數(shù)據(jù)處理：表四小麥幼苗過氧化氫的含量od

18、410h2o2 含量實(shí)驗(yàn)組1.1550.006對照組0.4750.0022.4.2 干旱脅迫下小麥幼苗h2o2的含量的影響分析環(huán)境脅迫可降低植物葉片對光能的利用能力，使其吸收的光能中過剩的程 度加大而引發(fā)光抑 制，也可誘發(fā)植物體內(nèi)活性氧積累而造成氧化脅迫6。由表 4可知，小麥在干旱脅迫下，h2o2的含量劇增。經(jīng)h2o2脅迫鍛煉的小麥遭受 干旱脅迫時，能使體內(nèi)o2-及h2o2的含量維持在較低的水平，因而保護(hù)了膜、葉 綠素、蛋白質(zhì)等免受氧化傷害。從表四可以看出，干旱脅迫下小麥的h2o2含量有較大增加，實(shí)驗(yàn)組為對照 組的三倍，由此，初步判斷h2o2脅迫鍛煉，提高了小麥幼苗的抗氧化能力，增強(qiáng) 了其抗旱

19、性。2.5 干旱脅迫下小麥幼苗抗氧化酶的測定2.5.1 干旱脅迫下小麥幼苗抗氧化酶的測定的現(xiàn)象及結(jié)果現(xiàn)象：有茶褐色物質(zhì)生成結(jié)果及數(shù)據(jù)處理：表五小麥幼苗對抗氧化酶pod含量od470pod 含量實(shí)驗(yàn)組1.1228.072對照組0.0301.9852.5.2 干旱脅迫下小麥幼苗抗氧化酶的含量變化分析過氧化物使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)。由表五可以看出，實(shí)驗(yàn)組的pod含量比對照組增加了接近四倍。植物機(jī)體 內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)，而過氧化酶（pod）則是該系統(tǒng)的主要物質(zhì)之一。逆境 脅迫下，活性氧自由基增加，使植物細(xì)胞遭受氧活化脅迫。而pod對于消除細(xì)胞的活性氧對細(xì)胞膜的傷害，減少膜脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定膜的

20、穩(wěn)定性起到重要作用。 此外，在輕度和中度脅迫下。pod活性保持增加，在嚴(yán)重脅迫下 pod活性則會 開始下降，活性氧的消除系統(tǒng)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下的pod活性比正常水平的pod活性強(qiáng)，從而也證明了試驗(yàn)中小麥幼苗處于輕度或者是 中度干旱脅迫之下。2.6 干旱脅迫下小麥幼苗gsh含量的測定2.6.1 干旱脅迫下小麥幼苗gsh含量測定的現(xiàn)象和結(jié)果現(xiàn)象：無明顯現(xiàn)象結(jié)果和數(shù)據(jù)處理：表六小麥幼苗gsh含量od412gsh 含量實(shí)驗(yàn)組0.9626.083對照組0.1320.8352.6.2 干旱脅迫下小麥幼苗gsh含量變化的分析由表二的實(shí)驗(yàn)可以看出，干旱脅迫下的 gsh大量增加，實(shí)驗(yàn)組是對照組

21、的90倍。在干旱脅迫下也一定程度上造成了 gsh的積累。gsh是體內(nèi)重要的抗氧 化劑和自由基消除劑，如與自由基、重金屬等結(jié)合，從而把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn) 化為無害的物質(zhì)。gsh含量的增加，在一定程度上，反應(yīng)了玉米苗在干旱逆境 中，也能合成一些產(chǎn)物，增加其抗旱性，以便植物能在干旱逆境中生長。3 .討論和思考本次實(shí)驗(yàn)通過測量了小麥種子的活性、測定了小麥干旱苗和正常苗的脯氨酸 含量、過氧化氫的含量、ppo和pod的含量、gsh的含量及細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖 和mda的含量。通過干旱脅迫下的苗和正常苗的各種物質(zhì)含量的對比和分析， 說明小麥幼苗在干旱的條件下，細(xì)胞內(nèi)的pod和ppo的活性增強(qiáng)和h2o2的含 量明

22、顯增加，致使小麥幼苗細(xì)胞內(nèi)的ros動態(tài)平衡破壞，使其不能消除ros對 自身的傷害；h2o2的含量增加，細(xì)胞的組織會受到破壞，所以小麥幼苗會表現(xiàn) 出萎焉，枯卷，干黃等現(xiàn)象。但是在小麥細(xì)胞受到傷害的同時，細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸、 gsh、可溶性糖和mda的含量也會增加，它們的含量增加能增強(qiáng)細(xì)胞的保水能 力，維持植物的生命，增強(qiáng)植物的抗旱性，便于植物在干旱條件下生長。在自然界中，不僅僅是小麥在干旱條件下會發(fā)生這一系列的變化，其他的植物也會在干旱條件下發(fā)生 pod、pp。gsh和mda等物質(zhì)的含量增加，增強(qiáng) 保水性和抗旱性。除此之外，植物在其他的逆境中細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)物質(zhì)也會發(fā)生變 化，以便于其在逆境中維持生命，增加抗性。本實(shí)驗(yàn)表明在干旱脅迫下，pro大量積累有助于細(xì)胞或組織持水，防止脫水， 故可視為作物對干早環(huán)境的一種保護(hù)性適應(yīng)。植物體內(nèi)的抗氧化酶系