2[1-2].細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)-4h

1、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置 常用儀器與設(shè)備 高級(jí)實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房 培養(yǎng)細(xì)胞所用液體的配制 實(shí)驗(yàn)室安全管理細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件：無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器， 潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外 燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長條件：細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測條件：細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器， 高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：細(xì)胞保存條件：液氮罐細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)凈化工作室- 我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)我國藥品生產(chǎn)潔凈室

2、（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn) -潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)風(fēng)淋室風(fēng)淋室:風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風(fēng)淋室的板壁采用輕質(zhì)隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進(jìn)口不銹鋼制作，吹淋口方向可調(diào)，風(fēng)淋時(shí)間可在30-99秒間的調(diào)整。風(fēng)淋室可以配合

3、加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35較為適宜。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)傳遞窗傳遞窗:該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。PB系列傳遞窗按用途分為標(biāo)準(zhǔn)型和生物潔凈型兩種。（后者帶空氣自凈裝置）按門互鎖形式分為機(jī)械互鎖和電子互鎖兩種外殼按材料分為彩鋼板型、薄鋼板噴塑型和全不銹鋼型三種通用型尺寸如下表所列，特殊規(guī)格按用戶要求制作。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)高效過濾器高效過濾器: 高效過濾器是用超細(xì)玻璃纖維紙作濾料，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。 特點(diǎn)：具有低阻

4、高效、輕質(zhì)、容塵量大等特點(diǎn)，層高的要求，縮小凈化設(shè)備靜壓箱體積等優(yōu)點(diǎn)。 適用于常溫常壓常濕條件下環(huán)境空氣的凈化，尤其適用于需要高效空氣過濾器覆蓋率高的凈化廠房。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)潔凈層流罩潔凈層流罩: 技術(shù)性能參數(shù)： (1)凈化等級(jí)：100級(jí)(美國聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)209E) (2)平均風(fēng)速：0.250.45m/s(可調(diào)) (3)噪音：62dB(A) (4)電源：220V/50HZ 層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空氣凈化設(shè)備。它主要由箱體、風(fēng)機(jī)。初效空氣過濾器、高效空氣過濾器、阻尼層、燈具等組成，外殼為不銹鋼或彩鋼板。該產(chǎn)品既可懸掛，又可地面支撐，結(jié)構(gòu)緊湊，使用方便?？梢詥蝹€(gè)使用，也可多個(gè)聯(lián)接組成帶狀潔

5、凈區(qū)域，形成潔凈隧道。 潔凈層流罩是將空氣經(jīng)風(fēng)機(jī)以一定的風(fēng)壓通過高效空氣過濾器后，由阻尼層均壓，使?jié)崈艨諝獬蚀怪睂恿餍蜌饬魉腿牍ぷ鲄^(qū)，從而保證了工作區(qū)內(nèi)達(dá)到工藝所需的高潔凈度。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)IIII級(jí)級(jí)A A型生物安全柜型生物安全柜:一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗(yàn)、檢測不受污染，又能保證被研究的對(duì)象（如病菌、細(xì)菌等）不外溢，保護(hù)周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設(shè)備。該設(shè)備可廣泛應(yīng)用于低、中等危險(xiǎn)度（病原體

6、1-3，DNA重組P1-P3）的臨床細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)及生命科學(xué)的研究，加工、檢驗(yàn)部門。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)濾 器Zeiss濾器：濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)大容量高壓滅菌器 全自動(dòng)手提式滅菌器 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)超純水儀離心機(jī)細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培 養(yǎng) 板細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)6

7、孔/12孔/24孔/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板常用培養(yǎng)瓶細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)規(guī)格:25.0ml, 表面積:12.5 cm規(guī)格:50.0ml, 表面積:25.0 cm規(guī)格:250.0ml,表面積:75.0 cmCO2培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松， 以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒 （90 ，14 h)。 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中 以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)移液器細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)單道可調(diào)移液器量程: 220ul550ul10-100ul20-200ul100-

8、1000ul細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)顯微鏡細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)液氮罐細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)高級(jí)實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件: 細(xì)胞的營養(yǎng)需要 細(xì)胞的生存環(huán)境: 溫度: 37 37 ，O O2 2 COCO2 2: : 5%5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH:pH: 7.2-7.47.2-7.4 滲透壓 無污染 無毒細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 培養(yǎng)細(xì)胞所用液體的配制 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液：無平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：N

9、aCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無 Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)消化液消化液培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液

10、培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液.分天然培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。缺點(diǎn)：來源受限。 成分復(fù)雜，成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染易發(fā)生支原體污染 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需

11、物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁人工合成培養(yǎng)基只

12、能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如）。殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如）。血清中含有：血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） ； 多種金屬離子；多種金屬離子； 激素；激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 各種生長因子；各種生長因子； 轉(zhuǎn)移蛋白；轉(zhuǎn)移蛋白； 不明成分。不明成分。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)血清的使用血清的使用一般說來，含一般說來，含5 5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加

13、不死，但支持細(xì)胞生長一般需加 1010血清血清對(duì)于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中對(duì)于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長抑制因血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)

14、域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如因子，如激素、生長因子激素、生長因子 、結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子貼壁和擴(kuò)展因子 等。等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中

15、成功地生長和增殖。和增殖。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。的程序。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長。即使長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物補(bǔ)加物也不同。也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于

16、研究階段，難以推廣。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。 細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，3

17、0 分鐘分鐘血清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。 慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位方便、廣譜、穩(wěn)定。方便、廣譜、穩(wěn)定。細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)抗菌素的使用抗菌素的使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8080一一9595血清血清 5 5一一2020碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L

18、2.0 g/L青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)粉培養(yǎng)粉 1 1袋袋 碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g2.0 g 青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100100單位毫升單位毫升 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml, 1000ml, 過濾除菌；過濾除菌； 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值至值至7.27.2； 加血清（終濃度加血清（終濃度 1010） 培養(yǎng)基的配制細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)主要培養(yǎng)基主要培養(yǎng)基MEM：低限量Eagle培養(yǎng)基DMEM：Dulbeccos Modified Eagle Medium，貼壁細(xì)胞IMDM：Iscoves Modified Dulbeccos Medium，密度低、 生長困難細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞RPMI1640：Moor等研制成功，懸浮、腫瘤、原代、傳代 等細(xì)胞199、109培養(yǎng)基：Morgan研制成功Mccoys 5A：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)清潔液的配制細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)浸泡（自來水）、浸泡（自來水）、刷洗（洗潔精）、刷洗（洗潔精）、酸泡（酸泡（24小時(shí)）、小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、60烘干烘干細(xì)胞工程-實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)常用玻璃器皿清洗安全制度：安全制度：1）注意