組蛋白去甲基化酶GASC1維持食管癌腫瘤干細胞及其抑制劑抗腫瘤分子機制研究

1、組蛋白去甲基化酶GASCit持食管癌腫瘤干細胞及其抑制劑抗腫瘤分子機制研究食管癌是全球最常見的第六大癌癥 ,其發(fā)病率我國最高 , 新確診的食管癌患 者, 每年有 50%以上來自中國。食管癌預(yù)后極差 , 多數(shù)就診時已為中晚期 , 五年生 存率僅 10%左右 1 。顯著的地域性分布差異性是食管癌流行病學(xué)的突出特征 , 高、低發(fā)區(qū)之發(fā)病 率差異可達 500 倍。以河南省為例 , 河南北部的林州、安陽等地是中國也是世界 食管癌發(fā)病率和病死率最高的地區(qū) 2 。半個世紀(jì)以來 , 經(jīng)過數(shù)代腫瘤學(xué)臨床先輩與防治專家艱苦卓絕的攻關(guān)探索 , 在食管癌的診療與預(yù)防方面取得了舉世矚目的成績 , 但該腫瘤發(fā)病機制復(fù)雜

2、,防 治研究的工作非常艱巨 , 食管癌發(fā)生演進的分子機制亟待有所突破 3v/sup。組蛋白去甲基化酶 GASC他稱KDM4C鱗狀細胞癌擴增基因1 (Gene Amplified in Squamous Cell Carcinoma 1,GASC1 ),最初是從低分化食 管鱗狀細胞癌(ESCC細胞系KYSE-150中克隆出來的一個高度擴增的基因 4 。研究顯示,GASC1通過H3K9信號通路，對胚胎干細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(如 NANO、NOTCH1SOX2和OCT4等)進行轉(zhuǎn)錄后修飾，從而對于維持胚胎干細胞自 我更新和分化潛能起至關(guān)重要的作用 5,6 。食管鱗狀上皮正常情況 下不斷自我更新 ,需要

3、正常干細胞或早期祖細胞利用其高度增殖分化潛能 ,來維 持食管粘膜不斷脫落與更新。癌癥干細胞(Cancer stem cells,CSCs )學(xué)說認為腫瘤細胞內(nèi)存在著“干性” 細胞,負責(zé)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā) 7-9 。多能胚胎干細胞（embryonic stem cells,ESCs ） H3K9的甲基化狀態(tài)維持是通過轉(zhuǎn)錄因子和組蛋 白去甲基化酶活性間復(fù)雜的相互作用 10,11 。作為H3K9去甲基化酶GASC1研究顯示其與維持胚胎干細胞的特征至關(guān)重要6v/sup。但食管癌細胞是否存在 CSC細胞亞群,GASC1在食管癌CSC隹持中的作用 , 以及其小分子抑制劑是否具有抗腫瘤效用尚不明確12

4、。因此,本課題擬通過細胞系、 動物模型以及臨床組織標(biāo)本 ,多途徑探討 GASC1 及其小分子抑制劑在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制 , 闡明新型靶點治療藥物 的作用機理 , 為篩選鑒定食管癌診治新靶標(biāo)和新型藥物的發(fā)現(xiàn)設(shè)計提供實驗基礎(chǔ)。 研究目的 :GASC1 及其小分子抑制劑在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機制。第一部分:GASC1在ESCC中表達情況及與臨床病理特征的關(guān)系方法1.利用Western blotting 、RT-PCR 免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry,IHC ）, 在已建人源ESC（細胞系、正常永生化上皮細胞系、患者源性ESC（原代培養(yǎng)腫瘤 細胞株、以

5、及新鮮ESCCS組織與癌旁正常組織,檢測GASC的表達情況。2.調(diào)查 GASC與患者臨床病理特征及生存之間的關(guān)系,明確GASC與 ESC（惡性表型之間 的相關(guān)性。結(jié)果1.利用 Western Blot檢測GASC在 4株ESCC細胞系中的2株中表達 明顯（KYSE-150 KYSE-30 ,在正常人永生化上皮細胞（SHEE呈現(xiàn)低水平表達； 在5株患者來源原代培養(yǎng) ESC（細胞株中表達3株（EC-1、2、3）。2.利用Western Blot、RT-PCR及 IHC方法分別檢測GASC在 ESC（癌與癌旁組織的表達情況：在 癌與癌旁組織間的表達沒有明顯差異 , 但在不同分化程度的癌組織間存在表達

6、差 異 , 分化越差 , 表達越高GASC的表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)：高表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高。3.總生存率的Kaplan - Meier分析表明,2年生存率GASC陽性組為62.6%,GASC陰 性組為81.6%;GASC表達增加的腫瘤患者2年總生存率明顯低于表達減少的腫瘤 患者(P=0.041 )第二部分：ESCC-CSC勺分離與鑒定方法1.利用干細胞無血清懸 浮培養(yǎng)法,觀察ESC住田胞系和原代培養(yǎng)細胞株是否可以成球懸浮生長。2.利用流式細胞熒光激活細胞分選法(Fluorescence-activated Cell Sorting,FACS )和 Aldefluor 干細胞鑒定試劑盒 ,

7、 以乙醛脫氫酶 1(Acetaldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)為干細胞分子標(biāo)志,分別在已建人源ESC(細胞系和患 者源性ESCCM代培養(yǎng)腫瘤細胞株中檢測和分離 ALDHvsup+v/sup細胞亞群。3. 利用干細胞無血清懸浮培養(yǎng)法,比較ALDH+/sup細胞亞群及 ALDH-v/supffl胞亞群在體外無血清培養(yǎng)基的懸浮成球能力。4. 體內(nèi)試驗 ： 在重癥聯(lián)合免疫缺陷( Severe Combined ImmunDeficiency,SCID )裸鼠乳腺脂肪墊皮下接種 ALDH+/sup及ALDH-v/sup法田胞，觀察移植瘤發(fā)生發(fā)展情況。5.進一步研究 ALDH+

8、/sup細胞是否具有長期成瘤潛力和自我更新能力,評估子代細胞在 連續(xù)移植中成瘤能力 ： 從小鼠皮下移植瘤獲得父代移植瘤細胞 , 再次分離單細胞 懸浮液,利用FACS離選ALDH+/sup和ALDH-v/sup胞,再次移植 到受體小鼠體內(nèi) , 連續(xù)獲得三代移植瘤模型細胞進行分析。6.再次利用FACSffi IHC方法,檢測ALDH+/sup細胞在體內(nèi)移植瘤“干 性”維持情況。結(jié)果1.ESCC細胞在干細胞培養(yǎng)基(非粘附、無血清、含生長因 子)形成干細胞球體,以KYSE-150，和低分化患者源性ESC住田胞成球能力為著。2.利用FACS方法,檢測ESC住田胞系和ESCCM代培養(yǎng)細胞株中ALDH+v/

9、sup細胞亞群（從 3.92%到 14.7%不等）。KYSE-15C細胞ALDH+v/sup比例約為 10.1%。3. ALDH+0 ALDH-?代細胞在非粘附、無血清的條 件下培養(yǎng)7天,ALDH+v/sup體在5000細胞/ml的密度下能夠產(chǎn)生較多的 細胞球體。從球體分離出的 ALDH+/sup細胞在體外能夠自我更新,ALDH+S體百分率和干細胞球體啟動能力顯示出幾乎無限的增長 潛力。4. 按照普通培養(yǎng)方法,經(jīng)過96小時,MTS結(jié)果顯示，ALDH+v/supffl胞較ALDH-v/supffl胞具有更強的增殖能力。5.軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示,ALDH+v/supffl胞較未分類的 ESC

10、C細胞以及 ALDH-v/sup成了 更多的克隆,顯示出明顯增強的增殖能力。6. 從高、低分化兩位食管鱗癌患者新鮮組織制備食管癌原代細胞 , 通過ALDEFLUOR?SteCell （ STEMCELL?TECHNOLOGICS 干細胞檢測和流式細胞儀 篩選，將 ALDH+ ALDH-v/supffl胞，分別以 102、 103、104、105、106 的細胞濃 度接種到SCID裸鼠乳房脂肪墊皮下,每組5只，觀察2個月。104細 胞濃度的成瘤小鼠數(shù)目：ALDH+v/supffl胞:5/5;ALDH-v/sup 細 胞:2/5 。103細胞濃度的成瘤小鼠數(shù)目：ALDH+v/sup!田胞:5/5;

11、ALDH- 細胞:0/5。102細胞濃度的成瘤小鼠數(shù) 目:ALDH+v/sup!田胞:2/5;ALDH- 細胞:0/5 （二個月內(nèi)沒有腫瘤 形成）106細胞濃度的成瘤小鼠數(shù)目：ALDH+v/supffl胞:5/5;ALDH-v/sup 細胞:5/5,但 ALDH+/sup細胞在小鼠體內(nèi)形成 腫瘤的體積、重量以及腫瘤生長的速度均大于ALDH-v/supffl胞。7.利用FACS僉測裸鼠移植瘤細胞ALDH舌性,顯示ALDH+/sup衍生的移植瘤依然 保持著較高的ALDH+/sup細胞亞群;HE和IHC結(jié)果顯示,由 ALDH+/sup細胞形成的腫瘤組織學(xué)和GASC抗原特征類似于原發(fā)腫瘤。第三部分:G

12、ASC1參與 ESCC-CS的維持方法1.明確GASC在ESC（干細胞的 表達：利用qPCR和Western blotting, 檢測了 GASC在 ESC（細胞系及原代培養(yǎng) 細胞株 ALDH+/sup和 ALDH-v/supffl胞的表達情況。2.明確 GASC1 對ESC（普通培養(yǎng)細胞系的作用：構(gòu)建GASC慢病毒干擾載體敲減GASC基因表達, 利用qPCF和Western blotting 驗證敲減效；聯(lián)合GASC抑制劑咖啡酸（Caffeic acid,CA ）處理，觀察GASC基因敲減或CA抑制其表達對ESC（細胞克隆形成能力（平板克隆試驗）、細胞增殖能力（MTT試驗）、細胞周期（流式細

13、胞儀分析）的 影響。3.明確GASC對ESCCf細胞“干性”維持的作用：體外實驗：根據(jù)干細胞“靜 止”在G0G側(cè)的特征，利用流式細胞儀分析GASC基因敲減或CA抑制下細胞周 期特點的變化；運用FACS及Aldefluor分析法，分析ESCC富集培養(yǎng)干細胞在 GASC基因敲減及CA處理下ALDH+v/sup亞群比例的變化；觀察其非粘附性 無血清體外干細胞培養(yǎng)方法下 ALDH+/sup亞群成球能力和自我更新能力 的變化。4.體內(nèi)試驗：經(jīng)SCID裸鼠乳房脂肪墊分別皮下種植 ESC親本細胞、GASC1 慢病毒敲減細胞和CA處理后細胞，觀察移植瘤潛伏期和生長速度，以明確GASC1 對原位腫瘤的作用；經(jīng)S

14、CID裸鼠鼠尾靜脈注射ESCC親本細胞、GASC慢病毒敲 減細胞和CA處理后細胞,觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成情況,以明確GASC對寸轉(zhuǎn)移瘤的 作用;在SCID裸鼠食管癌移植瘤模型,經(jīng)腹腔注射不同濃度CA,觀察移植瘤變化, 以進一步明確GASC抑制劑CA的抗腫瘤作用。5.利用FACS和IHC方法,鑒別各實驗組移植瘤 ADLH+v/sup細胞比例, 明確GASC寸ESC（干細胞亞群“干性”維持的作用。結(jié)果 1.通過FACS方法在 原代培養(yǎng)細胞株分選 ALDH+/sup細胞亞群,利用RT-PCR和 Western blot 方法,分別檢測GASC在 ALDH+/sup和ALDH-v/supffl胞亞群的表

15、達 情況。結(jié)果顯示,相對于 ALDH-群,GASC1 在 ALDH+v/sup亞群 中明顯高表達。2.利用RT-PCR和Western Blot證實通過shRNAs慢病毒成功實 現(xiàn)GASC 的表達敲減。3.利用平板克隆試驗、MTT式驗、細胞周期流式細胞儀檢測試驗,發(fā)現(xiàn)GASC1 基因敲減或其抑制劑CA處理，引起ESCC各細胞株克隆、增殖、遷移能力下降。4.Aldefluor 分析顯示GASC基因敲減或CA處理,導(dǎo)致ESC（原代培養(yǎng)細胞株 ALDH+/sup細胞比例下降，并在非粘附性無血清體外培養(yǎng)下，細胞成球能 力下降 , 在隨后的體外連續(xù)繁殖中持續(xù)下降。5.GASC1對ESC（原位瘤的影響：應(yīng)

16、用SCID裸鼠移植瘤模型顯示,GASC1敲減 及CA處理組小鼠腫瘤體積,均較對照組縮小,腫瘤潛伏期延長。6.GASC1對ESCC 轉(zhuǎn)移瘤的影響：和對照組相比,GASC1敲減及CA處理組小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和體積 均下降。7.CA對ESC（裸鼠移植瘤模型的治療作用：利用CaA腹腔注射,引起小鼠腫瘤 體積縮小 , 且呈劑量依賴性 ;8 周后處死小鼠 , 與父代腫瘤細胞相比 , 對照組殘余瘤ALDH+v/sup細胞比例穩(wěn)定；CA處理組呈現(xiàn)ALDH+v/sup細胞比例 顯著下降。第四部分：GASC1-N0TCH通路調(diào)控食管癌干細胞作用機制方法 1.應(yīng)用Agilent 全基因組微陣列分析法 , 對采用細胞微

17、球懸浮培養(yǎng)法富集的食管癌干細胞 KYSE150S本細胞株（Esopha-sphere GASC1+ 及 GASC沉默細 胞株（Esopha-sphere GASC1-）進行分析，評估siRNA干擾下的下調(diào)基因。利用GC分析對差異表達基因進行功能注釋,應(yīng)用qPCRS行轉(zhuǎn)錄驗證,并選取 重要轉(zhuǎn)錄因子Notch1進行功能學(xué)研究。2.檢驗通過抑制GASC可導(dǎo)致多能性相 關(guān)基因下調(diào)與組蛋白修飾相關(guān)的假設(shè) ：使用 AlphaLISA 調(diào)查去甲基化抑制劑 CA 是否影響分選的ALDH+/sup細胞中全蛋白甲基化狀態(tài)。使用了定量染色質(zhì)沉淀技術(shù)（ qChIP）, 檢測多能相關(guān)性基因啟動子在 GASC1 抑制過程

18、中組蛋白的變化。使用抗體進行芯片分析,分別識別H3K9me或H3K9me3 在NOTCH啟動子區(qū)域的擴增情況。3.研究CA阻斷GASC脫甲基酶功能是否通過表觀遺傳學(xué)修飾影響異種移植 瘤的生長,檢測CA是否在體內(nèi)全面影響H3K9甲基化:利用western blot 分析 ALDH+/sup來源的異種移植瘤經(jīng)CA處理后組蛋白提取物中H3K9?基化水 平。4.驗證這些效應(yīng)是否反映了靶基因在腫瘤生長抑制中的表達：利用IHC法分 析NOTCH和H3K9me在異種移植瘤中的表達。驗證CA處理是否促進了 NOTCH啟動子表觀遺傳標(biāo)記的改變：利用IHC法檢 測H3K9me標(biāo)記在異種移植瘤中的狀態(tài)。結(jié)果 1.Agilent全基因組微陣列分析 ALDH+ESCC-CSCs GASC基因敲除和 CA處理48小時的細胞,我們 確定了 694個下調(diào)重疊基因。用GO分析功能注釋差異表達基因,發(fā)現(xiàn)重疊下調(diào)表達基因在乙醛脫氫酶(NAD活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/干性維持、細胞周期調(diào)控和分化等方面具有較強的 功能。2.在這些基因中，NOTCH基因是維持ESCC細胞多能性和自我更新的重