生物反硝化作用

1、生物反硝化作用1引言反硝化作用是使固定的n由土壤返回大氣的主要生物過程。反硝化作用在n循環(huán)過程中的中心作用雖然曾使它成為大量研究的主題，但從田間的定量水平到基本的微生物生物化學(xué)來說，該過程仍然是土壤n轉(zhuǎn)化中很不了解的一個方面。農(nóng)業(yè)土壤中因反硝化作用造成的n損失的定量估計有巨大的差異，其范圍為施入肥料n的0-70%（rolston等，1976，1979，craswell，1978，kisse1和smith，1978；kowalnko，1978）。hauck（1981）在對采用15n的大田n研究進(jìn)行評論時估計，肥料n的平均虧損在25-30%之間。這種估計出的肥料n損失可能主要是由于反硝化作用造成的

2、，但也會涉及到其它機制（第二十三章，hauck和tanji）。ryden和lund（1980）研究了一些加利福尼亞州的灌溉土壤，他們發(fā)現(xiàn)因反硝化作用損失的n總量范圍為95-233千克/（公頃.年）。肥料或土壤有機質(zhì)產(chǎn)生的n03-對地下水或供水污染的潛在威脅促進(jìn)了人們在過去10年中對反硝化作用的研究。一氧化二氮（氧化亞氮,n2o）在平流層的化學(xué)反應(yīng)中的作用也引起了對反硝化作用過程的興趣（johnston，1971，crutzen，1970）。已經(jīng)假設(shè)，隨著在作物生產(chǎn)中應(yīng)用的工業(yè)或生物固定的n量的增加，由于反硝化作用而產(chǎn)生的n2o將導(dǎo)致地球臭氧防護層的明顯破壞（crutzen和ehhalt，197

3、7；mce1roy等，1977；pratt等，1977；sze和rice，1976）和（或）將通過影響對流層的輻射平衡而造成地球表層的不斷升溫（wang等，1976）。土壤中的反硝化作用既能產(chǎn)生n20，也能產(chǎn)生n2；因此該過程既可作為n2o的來源，又可成為n2o還原為n2時的貯庫。反硝化作用在陸地n2o的收支中的重要意義還沒有完全弄清楚，但這一問題可促進(jìn)人們對反硝化作用的進(jìn)一步研究，它不僅增加了對反硝化作用，而且也增加了對土壤一般的微生物n代謝的理解。2生物化學(xué)和微生物學(xué)基礎(chǔ)2.1定義和途徑在美國土壤學(xué)會出版的土壤科學(xué)名詞小辭典（1979）中，反硝化作用被定義為“通過微生物的活動，將硝酸鹽或亞

4、硝酸鹽還原為氣態(tài)分子氮或氣態(tài)氮氧化物的過程”。但包括硝化作用和n03-還原為nh4+的某些微生物n代謝類型也可能通過no2-的還原作用而導(dǎo)致氣態(tài)n氧化物（n20,n0，或兩者都有）的產(chǎn)生（ritchie和nicholas，1972，1974，bo11ag和tung，1972；yoshida和alexander，1970），為了避免混淆，似乎需要有一個更為明白無誤的定義。大多數(shù)微生物學(xué)家認(rèn)為，反硝化作用是存在于有限的一些微生物屬中的一個呼吸過程。在該過程中n的氧化物可作為呼吸作用電子傳遞的末端電子受體，這種電子傳遞將底物提供的一個“還原”電子通過許多電子載體傳遞到一個氧化性更強的n氧化物上。在電

5、子傳遞到至少幾種n氧化物的過程中，能量就通過電子傳遞的磷酸化作用而被保存下來。在反硝化細(xì)菌把no3-或no2-還原為n2和（或）n2o時，它可以在缺乏分子態(tài)氧的條件下生長。只能還原為氣體產(chǎn)物（主要是n2和n2o）的陰離子的還原作用和產(chǎn)生的氣體的數(shù)量都具有一些使反硝作用有別于其它類型的微生物n代謝的特點。在硝化作用的過程中，n2o產(chǎn)生的確切機制是不清楚的，n2o氣體可能是羥胺氧化（hooper和terry，1979）或n02-被n02-還原酶（ritchie和nicholas，1972，1974）還原的產(chǎn)物。blackmer等（1980）曾提出土壤中發(fā)生硝化作用時所產(chǎn)生的n2o來自n02-的還原

6、作用，而且，已經(jīng)證明降低o2的有效性可增強培養(yǎng)物和土壤中nh4+氧化菌產(chǎn)生n2o（blackmer等,1980；goreau等，1980）。有人提出，當(dāng)o2不足時，硝化微生物可轉(zhuǎn)變?yōu)橄託夂粑ɑ蚍聪趸饔茫┑男问剑╬ayne，1973），但尚未證明n氧化物可以作為化能自養(yǎng)nh4+氧化菌生長的唯一的末端電子受體。在n02-還原為nh4+的過程中，n2o產(chǎn)生的機制甚至比硝化作用過程中的機制更不清楚（bollag和tung，1972；yoshida和alexander，1970）。也有些報道表明，當(dāng)腸細(xì)菌中的n2o-還原為nh4+時可產(chǎn)生n2o（tiedje，1981）。在這些微生物中，至少有一種，

7、即肺炎克雷伯氏菌（klebsiella pneumoniae），已報道表明，n2o的發(fā)生與利用n2o作為嫌氣呼吸時唯一的末端電子受體有關(guān)（hom等，1980）。yoshinari（1980）最近報告過n2o可被一種能將n03-還原為nh4+的發(fā)酵微生物還原為n2。把反硝化作用與過去認(rèn)為有著很大不同的其它代謝過程區(qū)分開來的困難是由于n代謝的知識日益增長所造成的。未來的研究結(jié)果才有可能更清楚地勾劃出這些代謝過程的差異或者需要擴大反硝化作用的概念。這種論述將與這里所定義的反硝化作用有關(guān)。在過去的10年中，其它評論已涉及到本論題的內(nèi)容，在某些方面還更為詳細(xì)（focht和verstraete，1977，

8、delwiche和bryan，1976；stouthamer，1976；garch，1975；payne，1973）。反硝化作用發(fā)生的總的要求是（1）存在具有代謝能力的細(xì)菌；（2）合適的電子供體，如有機c化合物、還原態(tài)s化合物或分子態(tài)氫（h2），（3）嫌氣條件或限制o2的有效性，（4）n的氧化物，如no3-，no3-或n2o作為末端電子受件，反硝化作用過程中n氧化物還原的途徑一般認(rèn)為是：（+5）（+3）（+2）（1）（0）n03-no2-non2on2這種假設(shè)的還原順序已提出一段時間了，而且已積累了很多支持每種n氧化物在該途徑中的作用的證據(jù)。應(yīng)用同位素混合和交換的研究對兩種更有“爭議”的中間產(chǎn)

9、物，即no和n2o進(jìn)行了探索。st.john和hollocher（1977）應(yīng)用15n標(biāo)記的n02-對銅綠假單孢菌（pseudomonos aeruginosa）進(jìn)行了研究，他們未能發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的15n與非標(biāo)記的no貯庫具有交換作用，而且n2產(chǎn)物也未表現(xiàn)出同位素混合作用。這些工作者得出這樣的結(jié)論：no不是反硝化作用過程中的一種游離產(chǎn)物。firestone等（1979a）報道了來自n02-的標(biāo)記13n確實表現(xiàn)出能與加入的兩種假單孢桿菌培養(yǎng)中的非標(biāo)記的no發(fā)生大量迅速的混合。這一工作表明，no或者是一個主要的中間產(chǎn)物，或者是能與這樣的一種中間產(chǎn)物迅速達(dá)成平衡。至于no是否起著專一中間產(chǎn)物的作用，仍然存

10、在著許多不同的看法（zumft和cardenas，1979；zumft和vega，1979；st.tohn和hollocher，1977；delwick和bryan，1976）。產(chǎn)生這種分歧的原因?qū)⒃谟嘘P(guān)n02-和no還原酶的段落中作進(jìn)一步的討論。新近的同位素交換和動力學(xué)證據(jù)對還原途徑中所涉及到的游離轉(zhuǎn)次亞硝酸（transhyponitrite）（o-n=n-d）2-產(chǎn)生了爭議（hollocher等，1980）。用15n對銅綠假單孢菌（st.tohn和hollocher，1977）以及用15n對一些培養(yǎng)物和土壤（firestone等，1980）的交換研究指出，n2o是在n02-還原為n過程中的

11、一種游離的專一中間產(chǎn)物。這些工作，以及在n2o還原酶抑制劑乙炔的存在下，一般所觀察到的n2o的化學(xué)數(shù)量的積累作用似乎都證明n2o可以為反硝化作用的一種主要中間產(chǎn)物（balderston等，1976；yoshinari和knowles，1976）。但是，brgan（1980）新近所做的工作對這種結(jié)論提出了一些懷疑。把15n標(biāo)記的n02-和14n-n2o加入處于穩(wěn)定期的施氏假單胞菌（pseudomonas stutzeri）的培養(yǎng)物中以后，bryan測定了15n15n，15n 14n和14n 14n在產(chǎn)生n2時的方式。如果簡單的還原順序no3-no2-non2on2成立的話，那么將只能產(chǎn)生15n

12、15n。和14n 14n-n。但發(fā)現(xiàn)了二次類型的分布，其n2的主要形式為15n 14n。bryan（1980）也曾報道過雖然銅綠假單胞菌能在形成n2的最后還原步驟中得到能量，但它不能在加有n2o的基質(zhì)上生長。這些結(jié)果的意義并不都是清楚的，因此，n2o作為反硝化作用過程的中間產(chǎn)物的問題還不能得到圓滿解答。2.2 有關(guān)的微生物據(jù)報道，約有23個屬的細(xì)菌具有反硝化作用的能力。表8-1中所列出的反硝化細(xì)菌屬包括了13個已經(jīng)確證的或有廣泛記錄的細(xì)菌屬。已報告在棒狀桿菌屬（corynebacterium）、黃單胞菌屬（xanthomonas ）、不動細(xì)菌屬（acineobacter）和葡萄菌屬（glueo

13、nobacter）中存在著反硝化細(xì)菌的菌株，其中大部分還沒有肯定的分類歸屬。jeter和ingraham（1981）編輯了更為完整的目錄，并包括了對色桿菌屬（chromobacterium）、噬細(xì)胞菌屬（cytophaga）、奈瑟氏菌屬（neisseria）、西蒙斯氏菌屬（simonstella）、硫小螺菌屬（thiomicrospira）和熱絲狀菌屬（thermothrx）的反硝化細(xì)菌種的討論。與ha11所編撰的能把n03-異化還原為no2-的73個細(xì)菌屬的目錄相比較，反硝化作用則似乎只有相對有限的代謝能力。對payne（1976）以及focht和verstraete（1977）以前所編輯的

14、材料最明顯的增補是根瘤菌屬（rhizobium）、黃桿菌屬（flavobacterium）和農(nóng)桿菌屬（agrobacterium）（zablotowicz等，1978；pichinoty等，1976，1977）。一種表觀上具有微需氧反硝化能力的磁性螺菌（magnetic spirillum）的原始報道也是令人感到興趣的（escatamte-semerena，1980）。在所研究的微生物中，大部分都具有把no3-、no2-或n2o作為唯一的末端電子受體而進(jìn)行還原的能力。少數(shù)菌株，如氣味產(chǎn)堿桿菌（alcaligenes odorans），則不能利用no3-（pichinoty等，1976，1978

15、b；vangai和klein，1974）。其它少數(shù)菌株（一般是熒光假單孢桿菌）會產(chǎn)生n2o作為最終產(chǎn)物（payne和balderston，1978；greenberg和becker,1977；renner和becker，1970）或者在n2o培養(yǎng)基上生長得很差（st.john和hollocher，1977，bryan,1980）。極少見有關(guān)微生物能在no培養(yǎng)基上生長的報告（pichinoty等，1978a；ishaque和aleem，1973）。由于no是固有毒性的化合物，所以能在其上生長不是非同尋常，就是很難證實。大部分的反硝化細(xì)菌是化能自養(yǎng)生物。這就是說，它們能利用化學(xué)能源（不是光源），它

16、們還能利用有機c化合物作為電子供體（還原劑）和作為細(xì)胞的碳源。有一種行光合作用的細(xì)菌紅假單胞菌（rhodopseudomonas sphaeroides）已證明是反硝化菌，但當(dāng)進(jìn)行反硝化作用時，它能以化能自養(yǎng)菌的方式生長（satoh，1977）。一些反硝化細(xì)菌也能以無機營養(yǎng)菌的方式生長；脫氮硫桿菌（thiobacillus denitrificans）能利用還原的s化合物，脫氮副球菌（paracoccus denitrificans）和產(chǎn)堿桿菌屬的一些種都能利用h2用為電子供體（thauer等1977；buchanan和gibbons，1974)。脫氮硫桿菌在進(jìn)行反硝化作用時，也能以自養(yǎng)生物的

17、方式（利用co2用為c源）進(jìn)行生長。幾乎所有的反硝化菌都是好氣生物，只有當(dāng)n氧化物存在時才能進(jìn)行嫌氣生長。利用o2作為一種電子受體所進(jìn)行的呼吸和利用n氧化物作為電子受體所進(jìn)行的呼吸都是相類似的過程，在該過程中，反硝化作用所利用的許多電子載體也可用于o2的呼吸作用（圖8-1）。丙酸桿菌屬（propionibacterium）中的細(xì)菌似乎是目前僅知的能進(jìn)行反硝化作用的專性嫌氣發(fā)酵生物（thauer等，1977；payne，1976）。該屬中的種已被證實至少擁有電子傳遞與nox還原作用相偶合所必需的細(xì)胞色素（stouthamer，1976），但有關(guān)這些微生物對n氧化物進(jìn)行還原的實質(zhì)性證據(jù)尚不完備。芽

18、孢桿菌屬(bacillus)的一些反硝化菌種是既能進(jìn)行發(fā)酵作用又能進(jìn)行呼吸作用的兼性微生物。(表：表8-1 能進(jìn)行反硝化作用的細(xì)菌屬 )屬*一些種的重要特征產(chǎn)堿菌屬通常能從土壤中得到分離(alccligenes)土農(nóng)桿菌屬一些種是植物的病原菌(agrobacterium)固氮螺菌屬(擬)能進(jìn)行n2固定作用，通常與禾本科植物結(jié)合在一起(azospirillum)芽孢桿菌屬已報道是高溫反硝化菌(bacillus)黃桿菌屬新近分離的反硝化菌種(flavobcaterium)適鹽菌屬(嗜鹽細(xì)菌屬)需要高濃度的鹽才能生長(haiobacterium)生絲霉菌屬既能進(jìn)行無機營養(yǎng)型又能進(jìn)行異養(yǎng)型的生長(hy

19、phomicrobium)副球菌屬能在發(fā)酵罐中進(jìn)行反硝化作用(paracoccus)丙酸桿菌屬通常能從土壤中得到分離(propionibacterium)根瘤菌屬能與豆科植物進(jìn)行共生固氮(n2)作用(rhizobium)紅假單胞菌屬光合細(xì)菌(rhcaopseudomonas)硫桿菌屬一般以化能自養(yǎng)型方式生長(thiobacillus)注釋：*這里涉及的許多屬都要在教科書中找到。更詳細(xì)的資料可參看jeter 和ingraham(1981),focht和verstraete(1977),garcia(1975),buchaman和gibbons(1974)的材料。 少數(shù)固n2微生物，其中包括巴西固

20、氮螺菌（azospirilum basilense）（從前認(rèn)為是螺菌spirilum lipoferum）和大豆根瘤菌（rhizobium japonicum）時，它們也都是反硝化菌（zablotowicz等，1978；eskew等，1977，neyra等，1977），neyra和van berkum（1977）以及scott和scott（1978）報道過固氮螺菌屬的種能產(chǎn)生與反硝化作用相偶合的固n2作用。但是，nelson和know1es（1978）用o2和no3-對巴西固氣螺菌的兩個過程進(jìn)行控制的研究結(jié)果指出，在很大程度上固n2作用和反硝化作用是不會同時發(fā)生的。no3-轉(zhuǎn)化為no2-的主動

21、還原作用（active reduction）已經(jīng)顯示出可以抑制這種微生物的固氮酶活性（magalhaes等，1978）。在土壤中，固n2活性只有在加入的no3-被反硝化作用耗盡之后才可以檢測出來（yoshinari等，1977）。要確定土壤中哪些反硝化微生物在功能上起著重要作用是十分困難的。gamb1e等（1977）對19種土壤進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)最經(jīng)常被分離出來的細(xì)菌是假單孢桿菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬的菌種?？梢灶A(yù)期這些屬的許多種可在實驗室最經(jīng)常采用的分離土壤微生物的加富培養(yǎng)基上良好地生長，在決定哪些細(xì)菌在土壤反硝化菌中起著重作用方面，至少存在著兩個主要困難：培養(yǎng)基的固有選擇性或者幾乎無法實現(xiàn)的在培

22、養(yǎng)基中模擬復(fù)雜的土壤環(huán)境的工作，以及所有反硝化菌都具有的雙重代謝能力。這就是說從可能發(fā)生反硝化作用的土壤中分離出來的菌株并不一定意味著該微生物在自然環(huán)境中是以反硝化菌的方式正常地生長的。smith和tiedje（1980）的研究清楚地證實了這兩個問題的重要意義。在實驗室培養(yǎng)基上能以反硝化菌方式生長良好的土壤分離體在沒有加c的土壤上不會有多大的競爭性，而在no3-肉汁上生長最緩慢的菌株則在飽和土壤上生長得最為迅速。這些工作者也發(fā)現(xiàn)，不同分離體生長或存活的能力主要取決于土壤是處于嫌氣（水飽和的土壤）還是好氣條件下。 gamble等（1977）在其對土壤的研究中發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌（pseudomin

23、as fluorescens）包括有已分離到的大型單種。但對該微生物的研究在深度上還很不夠。最普通選作生理研究的反硝化菌是脫氮副球菌、pseudomonas perfectomarinus以及銅綠假單胞菌。在這些種中，只有銅綠假單胞菌能在gamb1e等（1977）所研究的土壤中找到。本章所討論的有關(guān)反硝化作用的生物化學(xué)知識有可能是利用土壤環(huán)境中不甚重要的微生物進(jìn)行研究而獲得的。種之間的酶學(xué)特性和控制方面的類似性都很可能存在，但將這些研究結(jié)果推廣至大田土壤上則需要有條件地進(jìn)行。2.3 細(xì)胞控制在任何代謝過程中，都可在兩個基礎(chǔ)水平上進(jìn)行控制，即酶的合成或?qū)嶋H存在的酶的活性。就反硝化作用而言，一些參

24、數(shù)（例如o2和no3-）都可在兩個水平上控制其過程。本節(jié)要討論的是反硝化作用的遺傳學(xué)，控制基因發(fā)生或隨后酶合成的條件，以及最后還要討論影響酶活性的參數(shù)。將可以非常明顯地看出，no3-還原為no2-的還原作用的研究比隨后發(fā)生的還原步驟的研究要深入得多。這可部分歸因于這樣的事實，即呼吸時no3-還原為no2-的過程普遍存在于許多細(xì)菌中而不只是存在于反硝化菌中（hall，1978）。硝化菌中存在的異化作用硝酸還原酶（dnr）的特性與no3-呼吸菌（respirer）中所發(fā)現(xiàn)的那些特性十分相似。因此，從no3-呼吸菌得到的信息可普遍外推用于反硝化作用。2.3.1 遺傳學(xué)關(guān)于控制n氧化物還原酶合成的基因

25、還知道得很少，van hartengsveldt等（1971）、vaa hartengsveldt和stouthamer（1973）已分離出銅綠假單胞菌的dnr突變型的基因，并作了部分鑒定占在分離出來的5種不同的突變型中，發(fā)現(xiàn)有4種己失去了用于同化目的的n03- 還原n02- 為的能力。這就意味著銅綠假單胞菌只有一種既用于同化作用，又可用于反硝化作用的n03- 還原酶。但是，近期測定的結(jié)果表明，4種突變型的n03- 還原酶都不能同化或異化n03- ，其中3種含有多重突變體。第4種菌株則不具把mo參入到進(jìn)行同化作用或異化作用的no3還原酶中去的能力（sias等,1980）。burke等（1980

26、）和calder等（1980）報道了從脫氮副球菌中分離出dnr突變型的工作，并證明這些突變型中也有一種可能把mo滲入到酶中。van hartingsveldt等（1971）報道過n02- 還原酶活性受到影響的5種銅綠假單胞菌突變型的分離工作。因此獲得了一些基因在細(xì)菌基因組上的位置的原始材料。細(xì)胞色素的光譜研究表明，這些變種可能無法合成n02- 還原酶的d-型細(xì)胞色素。有關(guān)對no或n2o還原活性的遺傳控制至今尚未有見報道。2.3.2 酶的合成異化作用n03- 還原酶的合成一般在o2存在時受到阻遏，而當(dāng)o2缺乏時，則發(fā)生去阻遏作用。在許多研究過的生物中，當(dāng)o2的供應(yīng)受限制時（calder等，198

27、0；zumft和vega，1979；swain等，1978）或假設(shè)o2的需要超過供應(yīng)速率時，n03- 還原酶就易于合成。sias和ingraham（1979）報道道了當(dāng)o2的供應(yīng)速率為0.02毫摩爾/（o2升.分鐘），并在有n03- 存在時，銅綠假單胞菌對dnr的合成就是完全的去阻遏作用。事實上，已發(fā)現(xiàn)這些“半好氣”（semiaerobic）條件對脫氮富副球菌（calder等，1980）和銅綠假單胞菌（carlson，1981）產(chǎn)生dnr是很適宜的。在02的有效性受到限制的條件下，好氣呼吸作用顯然為n03-還原作用合成新的蛋白質(zhì)提供了所需要的能量。實際上，已經(jīng)證明從高度好氣條件突然改變?yōu)閲?yán)格的

28、嫌氣條件后，一些反硝化菌就不能生長。推測這可能是由于重新合成另一套酶的機制缺乏能量所致（payne等,1971）相反，一些微生物，如脫氮硫桿菌在大量合成dnr時似乎需要進(jìn)行嚴(yán)格的嫌氣生活（justin和ke11ey，1978）。即使在n03- 缺乏時，單獨的嫌氣生活也足以使一些微生物如p.perferctomarinus能夠進(jìn)行dnr的合成（payae等，1971；stouthamer，1976）。但是，在許多反硝化菌中，n03- 的存在為dnr的合成所需要，或能大大地增強dnr的合成（calder等，1980；sias和ingraham，1979；stouthamer，1976）。包括n02

29、- 、疊氮化物和氯酸鹽在內(nèi)的其它一些化合物也能作為dnr合成的誘導(dǎo)物或刺激劑（carlson，1981；calder等，1980；stouthamer，1976）。在有足量的o2存在時，dnr不能正常合成的觀察結(jié)果與一般所觀察到的代謝方式相一致，這種方式是當(dāng)細(xì)胞中存在有可以產(chǎn)生更高能量的替代末端受體時，就會阻止某一電子受體的還原酶的形成（stouthamer，1976）。這就為o2對n03- 還原酶合成的阻遏作用提供了一種合理的解釋，但對其阻遏作用的機制則無法提供什么信息。在stouthamer1976年的評論中，他論述了一種氧化還原控制的模式。在該模式中，電子傳遞鏈成分的氧化還原狀態(tài)或末端n

30、03- 還原酶都可作為調(diào)節(jié)還原酶合成的因子，該模式似乎與burke等（1980）和calder等（1980）最近用脫氮副球菌進(jìn)行研究的結(jié)果相一致。該研究涉及疊氮化物作為dnr誘導(dǎo)物的作用和突變對合成調(diào)節(jié)的影響。反硝化過程中所涉及的其它還原酶的合成調(diào)節(jié)作用不像n03- 還原酶的研究那樣深入。20世紀(jì)70年代初期用p.perfectomarinus所作的研究指出，所有進(jìn)行反硝化作用的酶活性只要在02缺乏時就能同時被誘導(dǎo)出來（payne，1973，payne等，1971；payne和riley，1969）。但從那時起，其它微生物研究中所積累的大量證據(jù)表明，n02- 還原酶的合成與dnr的合成并不是協(xié)

31、同調(diào)節(jié)的，而且可普遍觀察到n02- 還原酶的大量合成落后于n03- 還原酶合成數(shù)小時（calder等，1980；zumft和vega，1979；nelson和knowles，1978；swain等,1978；williams等，1978）。這些研究的大部分工作都是在把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到有n03-存在的嫌氣條件下進(jìn)行的。n02- 還原酶合成的滯后現(xiàn)象可能說明積累足量的n02- 以引起合成的誘導(dǎo)作用或放大需要時間。但是，一些研究者報道在“半好氣”條件下n02- 還原酶并不像n03- 還原酶那樣易于合成（calder等，1980；zumft和vega，1979；swain等，1978）。這表明n02- 還

32、原酶合成的滯后現(xiàn)象可能是由于受到不同的02控制所造成的。這些研究的大部分工作都是利用n03- 作為誘導(dǎo)物而進(jìn)行的，因此，根據(jù)02的作用來描述產(chǎn)生n02- （或n03- 的消耗）的作用是有困難的。justin和kelley（1978）報道在脫氮硫桿菌中，當(dāng)n02- 存在時，n02- 還原酶可在02濃度比n03- 還原酶合成時為高的條件下進(jìn)行合成。 在一些微生物中，n02- 還原酶的合成落后于n03- 還原酶合成的觀察結(jié)果可以解釋當(dāng)改變成反硝化條件時培養(yǎng)基和土壤中通常會有n02- 積累的現(xiàn)象。但是，正如后面還要討論的那樣，對n02- 的積累還有其它的解釋。像dnr一樣，一些微生物如p.perfec

33、tomarinus和alcaligenes 種或achromob acter種，其n2o還原酶的合成顯然是在“半好氣”條件下進(jìn)行的（payne等，1971；matwub aara，1971）。由于能在n03- 生長，所以，n2o還原活性的誘導(dǎo)作用是可以被普遍觀察到的現(xiàn)象（payae，1973）。然而，由于還原作用的產(chǎn)物n2o可能是實際上的最初誘導(dǎo)物，所以仍然不知道n03- 和n02- 能否作為n2o還原酶合成的有效誘導(dǎo)物。曾有報道，在n2o上生長的細(xì)胞其n2o還原作用的速率比在n03- 或n02- 上生長的細(xì)胞要高（matsubara，1971；payne 等，1971；delwiche，19

34、59）。firestone和tiedje（1979）報道了n2o還原活性的形成在土壤和培養(yǎng)物中其它反硝化酶類合成后數(shù)小時才發(fā)生。這種方式可能是由n2o的積累及其隨后的誘導(dǎo)作用或n2o還原酶合成的放大作用所造成的。n2o還原活性基形成的滯后現(xiàn)象可以部分地解釋在培養(yǎng)和土壤轉(zhuǎn)變?yōu)橄託鈼l件后通常所觀察到的n2o的暫時織累作用。2.3.3 酶的活性當(dāng)活躍的反硝化細(xì)菌被轉(zhuǎn)移到完全好氣的條件下生長時，n03- 的還原作用便停止了（john，1977；stouthamer，1976）。o2對n03- 還原作用的抑制似乎并不是由于o2對酶本身的直接影響所造成的，o2要能影響還原作用的話，它必須是作為一種末端電子

35、受體而發(fā)生作用。vaa hartingsvel和stouthamer（1974）報道了銅綠假單胞菌的一種突變型不能在好氣條件下合成某種電子轉(zhuǎn)遞成分，但當(dāng)把它從嫌氣生長條件轉(zhuǎn)移到好氣條件時，n03-的還原作用并不受多大的影響，同樣亦已提出在某些情況下，n03- 的呼吸作用在改變?yōu)楹脷鈼l件后的短期內(nèi)能繼續(xù)進(jìn)行，直到o2的電子傳遞鏈起作用為止（stoulthamer，1976）。也有報道，當(dāng)細(xì)胞在好氣條件下培養(yǎng)時，細(xì)胞中先期形成的n03- 還原酶只能被緩慢地鈍化，但從產(chǎn)氣克雷伯氏菌（klebstella aerogenes）中提純出來的n03- 還原酶則不會因暴露于o2中而遭到鈍化（stoutham

36、er，1976）。在用脫氮副球菌的研究過程中，john（1977）發(fā)現(xiàn)當(dāng)o2使所有細(xì)胞中的n03- 還原作用立即停止時，02和n03- 的還原作用同時都能在膜囊中發(fā)生。脫氮副球菌的完整細(xì)胞和膜囊之間這種差異的原因尚不清楚。反硝化作用中其它n氧化中間產(chǎn)物的存在似乎并不影響n03- 還原的速率。n02- 的存在不影響脫氮副球菌中n03- 的還原速率（john，1977）。但亞硝酸鹽可能將使n02- 還原過程中能量的產(chǎn)生部分地解偶聯(lián)（meijer等，1979b）。o2對反硝化作用過程中n02- 還原活性的影響似乎與它對n03- 還原作用的影響非常相似，即n02- 還原作用只有在缺乏o2 時才能發(fā)生（

37、john，1977）。如前所述，當(dāng)硝化細(xì)菌在n03-上生長時，通?？捎^察到有n02- 的積累（payne，1973）。payne和riley（1969）用p.perferctomarinus進(jìn)行的研究證明，在部分純化的細(xì)胞提取液中n03- 可直接抑制no的還原作用。因此，payne（1973）提出n03- 的這種抑制作用會引起n02- 的積累。近年來，betlach（1979）在可使n03- 還原酶活性失活的鎢酸鹽條件下，對生長著的熒光假單胞菌和一種黃桿菌屬進(jìn)行的研究證明，n02- 還原作用的速率不會受到n03- 的影響。在n03- 和n02- 都能被還原的細(xì)胞中，n02- 的積累速率似乎簡要

38、地反映出n03- 和n02- 還原速率的差異。02的存在或把它當(dāng)作一種電子受體都會影響到n2o的還原作用。betlach（1979）用一些培養(yǎng)物進(jìn)行的研究指出，與o2有關(guān)的n2o的產(chǎn)生量隨著o2有效性的增加而提高，而氣體產(chǎn)生的總量則有所下降。有關(guān)o2對反硝化作用的氣態(tài)產(chǎn)物影響的類似觀察結(jié)果也已在土壤中得到（firestone等，1979b；cady和bartholomew，1961，nommik，1956）。這些結(jié)果可以根據(jù)02對n2o還原作用的抑制影響大于它對先前還原作用的影響來予以解釋。但是，betlach（1979）在進(jìn)行硝化作用過程中還原步驟的動力學(xué)模式研究后提出，如果0能同等地抑制反

39、硝化作用中的所有步驟，那么，隨著o2濃度的提高，必將增加與n2有關(guān)的n2o的產(chǎn)生量。在嫌氣條件下，培養(yǎng)物（delwiche和bryan，1976；payen，1973）中以及土壤（garcia，1975）中通常都能積累n2o。對這種觀察結(jié)果的一種普遍解釋是n03-（或n02-）比n2o是更好的一種電子受體（payne，1973；delwiche，1959）。這種解釋與土壤中所觀察到的結(jié)果相一致，在土壤中，n2o的還原速率隨n03- 或n02- 的增加而下降（ firestone 等，1979b；blackmer和bremner，1978）。但是，batlach（1979）用幾種不同的反硝化培養(yǎng)

40、物進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)n03- 或n02-（及其還原作用）的存在對n2o還原作用速率沒有影響。n03- 或n02- 對土壤和培養(yǎng)物中n2o還原作用影響的差異可能是由電子供體（c的化合物）的有效性不同所造成。如果反硝化作用的速率受到還原當(dāng)量的有效性（在某些土壤中可能確實存在）的限制，那么，選擇利用n03- 或n02- 的優(yōu)點就是很明顯的了。但是，如果是反硝化作用的受體受到限制，那么n03- 和n02- 都可能以最大的速率遭到還原。sorensen等（1980）報道過硫化物可抑制熒光假單胞菌中n2o的還原作用（和no的還原作用）的速率。一些其它的環(huán)境參數(shù)也顯示了能引起與n2有關(guān)的n2o量的增加（表8-2

41、），其它一些因子（ph，c，溫度）將在與這些論題有關(guān)的后續(xù)段落中進(jìn)行討論。在某些情況下，如在n03-/ n02-和硫化物的影響下，n20的積累似乎是由n2o還原作用受到抑制而造成的。就其它因子而言，與n2有關(guān)的n2o產(chǎn)量的增加機制尚不清楚。betlach（1979）利用反硝化作用的動力學(xué)模式，預(yù)言能引起反硝化作用總速率下降的任何因子都能導(dǎo)致n2o產(chǎn)量的增加。(表：表8-2 影響反硝化作用過程中產(chǎn)生n2o和n2比例的因子一覽表 )因子對n2o/n2的影響no3-的濃度增加no3-就會增加其比率no2-的濃度增加no3-就會增加其比率o2的濃度增加n2就會增加其比率ph降低ph就會增加其比率并增強

42、no2-的影響硫化物增加硫化物就會增加其比率碳已報道增加c的有效性就會降低其比率eh低于0毫伏的氧化還原電位的變化不會影響其比率(sorensen等，1980）酶的狀態(tài)與前面還原酶有關(guān)的n2o還原活性的合成（或缺乏）都會增加或降低比率注釋： 2.4 特異還原酶的特性2.4.1 硝酸還原酶在細(xì)菌中，n03- 被還原為n02- 有兩個明顯的生理目的。第一個目的，n03- 最終被還原為nh4+并作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的唯一n源。第二個目的，在嫌氣條件下，n03- 可用作呼吸時的末端電子受體為生長提供能量。根據(jù)pichinoty（1973）提出的區(qū)分法，在反硝化作用過程中，n03- 還原為n02- 可作為第二

43、個目的，而催化這個還原步驟的酶稱作異化硝酸原酶（dnr）或硝酸還原酶a。在嫌氣條件下產(chǎn)生的n03- 還原酶a，因最初其具有把氯酸鹽還原為亞氯酸鹽的能力而得到了驗證。關(guān)于n03- 還原酶a和b的討論，可參看stouthamer（1976）的材料。在能利用n03- 進(jìn)行呼吸作用的所有微生物中，不管其還原的最產(chǎn)物終是n02-、n2o、n2或nh4+，都可以認(rèn)為n03- 還原為n02- 的過程是相似的。純化dnr的特性因研究的細(xì)菌種和采用的純化方法而有所不同。從埃希氏大腸菌（escherichia coli）、產(chǎn)氣克雷伯氏菌以及脫氮副球菌中分離出來的dnr酶已得到了較為全面的研究。這種酶一般由多個亞基

44、元組成，而且在某些情況下，一種細(xì)胞色素b與dnr可以得到共純化（stouthamer，1976）。這些研究過的酶有幾種共同的特性，每一種酶都含有mo、fe（可以作為血紅素和非血紅素的fe），以及不穩(wěn)定的硫化物基因。正如前面已討論過的，不能摻入mo的突變型能產(chǎn)生出鈍化的酶（見前節(jié)）。當(dāng)鎢酸鹽或釩酸鹽供給生長在鉬酸鹽中的微生物時，這些金屬都能摻入到n03- 還原酶中，因而產(chǎn)生出非功能性的酶（betlach，1979，scott等，1979；southamer，1976）當(dāng)fe或mo的螯合或結(jié)合劑，如硫（代）氰酸鹽（螯合mo），或紅菲繞啉（結(jié)合fe），都會強烈地抑制dnr的活性（stouthamer

45、，1976）。這些研究結(jié)果表明，mo和fe是酶產(chǎn)生活性必不可少的組成部分，但沒有跡象表明，這些金屬是否直接參與由dnr引起的將電子傳遞到n03- 的過程。電子順磁共振（epr）的研究方法已用于探討幾種細(xì)菌，包括脫氮副球菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣克雷伯氏菌的氧化型和還原型n03-還原酶中mo的氧化狀態(tài)。這些epr研究的結(jié)果已由stouthamer（1976）作了總結(jié)。epr的某些數(shù)據(jù)已用于解釋氧化型的n03-還原酶含有mo（v），而mo（）則存在于還原的酶中（stouthamer，1976）。但是，有人亦提出了epr數(shù)據(jù)的其它解釋（bray等，1976）。fe-s中心的電子是順磁共振研究指出，氧化型的n

46、03-還原酶含有非血紅素fe（），而且這些fe-s中心可直接參與將電子傳遞到n03-的過程（stouthamer，1976）。幾乎在所有的硝化微生物中，至少發(fā)現(xiàn)有一種類型的細(xì)胞色素b 參與于將電子傳遞到n03-的過程（stouthamer，1976）。如圖8-1所示，已經(jīng)提出在細(xì)胞色素b的水平上將電子傳遞到n03-的過程已從好氣的電子傳遞鏈上分支了出來（stouthamer，1980；haddock和jones，1977；payne，1976）。(圖：圖8-1 假設(shè)的反硝化作用電子傳遞圖式)圖注 它與boogerd等（1980、haddock和jones 1977）以及john和whatley

47、（1975）提出的脫氮副球菌和圖式相類似有跡象表明，在某些微生物如脫氮硫桿菌（sawhney和nicholas，1978）中，一種細(xì)胞色素c參與了將電子傳遞到dnr的過程（thauer等，1977）。可以期望，n03- 還原作用（和反硝化作用）中所涉及到的特異電子載體將隨不同的微生物而變化。在大部分反硝化細(xì)菌中，異化n03- 還原酶是結(jié)合于膜上的（haddock和johns，1977）。已有證據(jù)表明，在大腸桿菌（一種n03- 呼吸菌）中，n03- 還原酶的復(fù)合體鑲嵌在細(xì)胞質(zhì)膜上，而與n03- 的結(jié)合和n03- 的還原作用就發(fā)生在外膜表面上（jones和garland，1977；boxer和cl

48、egg，1975；garland等，1975）。但是，kristjanson和hollocher（1979）曾報道，在大腸桿菌中，n03- 還原酶的結(jié)合位置是在膜的內(nèi)表面上。sawada和satoh（1980）發(fā)現(xiàn)，n03- 還原酶位于光營養(yǎng)反硝化的紅假單胞菌（r.sphaeroides）中的外膜位置上。在脫氮副球菌中，已有證據(jù)表明， n03- 可從細(xì)胞質(zhì)接近dnr，而且一種n03- 載體能把n03- 傳遞到細(xì)胞內(nèi)（kristjanssin等，1978；john，1977）。 kristjansson等（1978）提出由于內(nèi)部離子減少造成了一個濃度梯度，所以通過促進(jìn)擴散作用，n03-（和n02

49、- ）可以順濃度梯度而進(jìn)入細(xì)胞。從反硝化細(xì)菌或具有n03- 還原活性的全部細(xì)胞中提純出來的n03- 還原酶的動力學(xué)參數(shù)只有為數(shù)極少的測定數(shù)值。純化dnr酶的km測定值范圍由銅綠假單胞菌（fewson和nicholes，1961b）的16微摩爾/升到鹽脫氮副球菌（paracoccus halodenifrificans）（rosso等，1973）的1300微摩爾/升。betlach（1979）曾報道在一些反硝化細(xì)菌中n n03- 還原活性的michaelis常數(shù)低于以前所報道的純化還原酶常數(shù)（15微摩爾/升）。全部細(xì)胞的km出測值可能反映了n03- 還原作用或n03- 傳遞至細(xì)胞中的動力學(xué)狀況。

50、2.4.2 亞硝酸還原酶在反硝化作用中涉及的n03- 還原酶似乎有兩種一般的類型。一種是含cu蛋白質(zhì)，已在裂環(huán)無色桿菌（achromobacter cyclochstes）、r.sphaeroides f.sp.denitrficans 以及以前曾作為脫氮假單胞菌來敘述的一種alcaligenes中發(fā)現(xiàn)（sawada等，1978；iwasaki和matsubara，1972；iwasaki等，1963）。第二種類型為n03- 還原酶，它是一再細(xì)胞色素cd，且似乎更為常見，并研究得較為詳細(xì)。這種酶由兩個相同的亞基組成，每一個亞基都含有一個c-型和一個d-型的血紅素，其分子量約為120 000。細(xì)

51、胞色素cd的特性在脫氮副球菌和銅綠假單胞菌中研究得更為深入；但是，對p.perfectomarinus，脫氮硫桿菌和糞產(chǎn)堿菌（alealigenes faecalis）中的n02- 還原酶也作了很好的鑒定（zumft等，1979；sawhney和nicholas，1978；gudat等，1973；payne，1973）。在這些細(xì)菌中至少有幾種n02- 還原酶（如圖8-1所示）能從呼吸鏈的細(xì)胞色素c水平位置上接受電子（bamforth和quayle，1978；payne，1976；john和whatley，1975）。關(guān)于n02- 還原酶在細(xì)胞中的確切位置存在著很大的分歧。在cox和payne（

52、1973），以及matsubara和iwasaki（1971）的早期研究中已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的可溶性部分有n02- 還原活性。這是一個關(guān)鍵之所在，因為還原酶與細(xì)胞膜表觀結(jié)合的證據(jù)不足，所以導(dǎo)致一些研究者得出n02- 的還原作用并不與atp的產(chǎn)生相偶合的結(jié)論。最近，sssaraste和kkuruen（1978）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素cd結(jié)合在銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜上，但還原酶很容易因操作而溶解下來。在p.perfectomarinus中，zumft和vega（1979）發(fā)現(xiàn)，n02- 還原酶在膜的結(jié)合體和細(xì)胞可溶部分中都能發(fā)生。saraste和kuronen（1978）報道了細(xì)胞色素cd可以結(jié)合在銅綠假單胞菌細(xì)胞膜

53、的內(nèi)表面上；但是，wood（1978）用同樣的微生物進(jìn)行的研究卻指出存在著一個周質(zhì)（細(xì)胞外質(zhì)）位置（perilasmic location）（外膜表面）。在其它兩種微生物中，亦已報道了有n02- 還原酶的周質(zhì)位置的存在（sawada和satoh，1980；meijer等,1979a）。一般認(rèn)為，酶不能占據(jù)一個橫跨膜的位置（transmembrane location）。n02- 還原酶在細(xì)胞內(nèi)的位置對決定n02- 在還原劑以前是否必須傳遞進(jìn)入細(xì)胞中以及對理解競爭劑或抑制劑參與n02還原作用的可能途徑都是具有意義的?？傊?，反硝化細(xì)菌中所發(fā)現(xiàn)的n02 還原作用的動力學(xué)是比較復(fù)雜的。sawada等（

54、1978）報道了從光合反硝化細(xì)菌中分離出來的含cu型n02- 還原酶的km 值為51微摩爾n02-。robinson等（1979）雖然對脫氮副球菌細(xì)胞色素cd的動力學(xué)作了較為詳細(xì)的研究，但仍然不能完全解決n02- 還原作用過程的復(fù)雜性問題。在其它可能的解釋中，他們提出酶可能受到反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用。saraste和kuronen（1978）用完整的細(xì)胞，細(xì)胞上清液和純化的酶（細(xì)胞色素cd型）對銅綠假單胞菌中n02- 的km值作了測定。在每種情況下，lineweaver-burk的試驗都揭示了n02- 還原作用的動力學(xué)具有一個明顯的雙相特性。（biphasic character），其兩個km值范

55、圍為6微摩爾/升和50-85微摩爾/升n02-。saraste和kuronen對這種雙相動力學(xué)作了幾種推斷性的解釋，其中包括二聚酶上的兩個n02- 結(jié)合點之間相互作用的可能性。betlach（1979）在他所研究的反硝化培養(yǎng)物中顯然找到了簡單的n02- 還原作用的動力學(xué)，并報告了在產(chǎn)堿菌屬的一個種中，在黃桿菌屬的一個種中和在熒光假單胞菌中km值分別為12.6和5摩微爾/升n02-。已發(fā)現(xiàn)純化n02- 還原酶形成的最為常見的n02- 還原產(chǎn)物是no（legall等，1979；zumft等，1979；payne，1973）。但是，在一些微生物中，no和n2o都是由n02- 還原酶所產(chǎn)生的（zumf

56、t和vega,1979；sawheny和nicholas，1978，matsubara和iwasaki，1972）。雖然許多證據(jù)都確實支持n02- 還原酶使n02- 還原為no是單一步驟，單一電子的還原作用，但在將活體外純化還原酶的研究結(jié)果外推到活細(xì)胞內(nèi)時必須十分謹(jǐn)慎。關(guān)于活體內(nèi)n02- 還原酶的產(chǎn)物和no作為反硝化中間產(chǎn)物的作用仍然存在著很大的分歧（zumft和vega，1979；st.john和hollocher，1977；delwiche和bryan，1976）。一些反硝化培養(yǎng)物中已發(fā)現(xiàn)no的產(chǎn)生和還原的方式都與其作為反硝化過程的產(chǎn)物的假設(shè)作用一致。根據(jù)對土壤no流出量的測定，no的散發(fā)

57、量估計為1千克n/（公頃.年）（gaballyt roy，1978），但是，仍不清楚在反硝化過程中由生物對n02-的還原作用所造成的土壤中常見的no比例是多少。亞硝酸鹽在土壤中是一種較易參與反應(yīng)的物質(zhì)，因而它具有一些可能的化學(xué)途徑。關(guān)于n02- 發(fā)生“化學(xué)反硝化作用”（chemodenitrication）的文獻(xiàn)已相當(dāng)廣泛，在這里不予評述。一些新近發(fā)表的論文包括了對n02- 反應(yīng)和no形成的卓越討論（smith和chalk，1980a，b；keeney等，1979）。2.4.3 一氧化氮還原酶不像n03- 還原酶和n02- 還原酶那樣，對no還原起作用的酶尚未得到高度的純化和進(jìn)行廣泛的研究。已

58、發(fā)現(xiàn)一些微生物的無細(xì)胞制劑具有no的還原活性（cox和payne，1973；matsubara和iwasaki，1971；miyata，1971；payne等，1971；miyata等，1969；fewson和nicholas，1961b）。在p.perfectomarines和銅綠假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)no還原酶活性存在于可溶性部分（cox和payne，1973；payne等，1971；fewson和nicholas，1961b），而在產(chǎn)堿菌屬的種中則發(fā)現(xiàn)其活性與含有膜的顆粒部分有關(guān)（matsubara和iwasaki，1971；miyata，1971）。與n02- 還原酶一樣，對no還原活性的這種可能存在的可溶性所得到的解釋是no的還原作用并不與atp的形成相偶合。用p.perfectommarinus進(jìn)行的研究理指出，no還原活性與n02-還原酶是有區(qū)別的（cox和payne,1973；payne等