微生物實驗(污泥中細菌和抗Cu離子的細菌的總數(shù)測定_金屬抗性細菌的分離、純化、保存以及菌落形態(tài)觀察)

1、環(huán)境工程微生物學實驗方案實驗題目：污泥中細菌總數(shù)測定和抗Cu細菌的分離、純化、保存以及菌落形態(tài)觀察組長：XXX組員： 一、 實驗目的1. 學習污泥樣品的采取方法和污泥樣品細菌總數(shù)測定的方法。2. 了解平板菌落計數(shù)法的原則。 3. 熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備工作。4. 了解配制微生物培養(yǎng)基的基本原理，掌握常規(guī)的配制、分裝培養(yǎng)基的方法。5. 學會各類物品的包裝、配制和滅菌技術。6. 從污泥中分離、培養(yǎng)微生物，掌握常用的分離微生物的方法。7. 學會接種技術。8. 觀察分離出來的幾種細菌的個體形態(tài)及與其相應的菌落形態(tài)特征。二、實驗原理1、測細菌總數(shù)原理：微生物活體數(shù)量的測定方法，常用平板培養(yǎng)計數(shù)

2、法。它是通過將樣品制成均勻的一系列不同稀釋度的稀釋液，再取一定的稀釋液接種，使其均勻分布于培養(yǎng)皿中特定的培養(yǎng)基內(nèi)，最后根據(jù)在平板上長出的菌落數(shù)計算出每克（或mL）樣品中的活菌數(shù)量。2、培養(yǎng)基原理：培養(yǎng)基是微生物生長的基質，是按照微生物營養(yǎng)、生長繁殖的需要，由碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵及微量元素和水，按一定的體積分數(shù)配制而成。調整合適的pH，經(jīng)高溫滅菌后以備培養(yǎng)微生物之用。本實驗配制固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的成分與液體相同，僅在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑使呈固態(tài)。通常加入質量濃度15-20gL的瓊脂為固體培養(yǎng)基。3、滅菌原理: 本次實驗采取加壓蒸汽滅菌法。加壓蒸汽滅菌器是能耐一定壓力的

3、密閉金屬鍋，加壓滅菌的原理在于提高滅菌器內(nèi)的蒸汽溫度來達到滅菌的目的。4、分離純化原理：本實驗使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個菌落的分離方法。此法加樣量不宜太多，只能在0.5mL以下，培養(yǎng)時起初不能倒置，先正置一段時間等水分蒸發(fā)后倒置。5、微生物的接種原理：接種就是將一定量的微生物在無菌操作條件下轉移到另一無菌的并適合該菌生長繁殖所需的培養(yǎng)基中的過程。本次實驗采取斜面接種法，使用到的接種工具是接種環(huán)（一般為電爐絲）。6、菌落形態(tài)觀察原理：由于微生物個體表面結構、分裂方式、運動能力、生理特性及產(chǎn)生色素的能力等各不相同，因而個體及它們的群體在固體培養(yǎng)基上生長狀況

4、各不一樣。按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落特征，可從菌落的形狀、大小、表面結構、邊緣結構、菌叢高度、顏色、透明度、氣味、粘滯性、質地軟硬、表面光滑粗糙等情況，初步辨別是何種類型的微生物。3、 實驗器材及試劑1.菌落總數(shù)恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸氣鍋、電子天平、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；滅菌的玻璃塞瓶1個，三角燒瓶/燒杯4個，滅菌培養(yǎng)皿9個，1ml移液管6支、10ml 2支、試管3支，PH試紙、玻璃棒、記號筆1支,100ml量筒，滴管2支。2、分離純化 （1）樣品：污泥 （2）儀器：高壓蒸汽滅菌器、干燥箱、酒精燈或煤氣燈、稀釋水、試管、刻度移液管、錐形瓶、燒杯、量筒、滴管、吸水紙、鑷子、搪瓷杯、高溫滅菌

5、鍋、移液槍（槍頭）、藥物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉網(wǎng)、藥匙、鐵架、表面皿、濾紙、pH試紙和棉花、接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、4大類菌落（培養(yǎng)皿） （3）試劑或材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和瓊脂、Cu離子試劑等四、操作步驟1. 玻璃器皿的準備（1）洗滌玻璃器皿在使用前必須洗滌干凈。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自來水沖凈。移液管先用洗液浸泡，再用水沖洗干凈。洗刷干凈的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、備用。（2）包裝 A.移液管的包裝：移液管的吸端用細鐵絲（或牙簽）將少許棉花塞入構成1-1.5cm長的棉塞，起過濾作用（以防細菌吸入口中，并避免將口中細菌吹入管內(nèi)）。

6、棉塞要塞的松緊適宜，吸時既能通氣，又不致使棉花滑入管內(nèi)。然后將塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm寬的長紙條的一端，移液管與紙條約成30度夾角，折疊包裝紙包住移液管的尖端，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，紙條螺旋式地包在移液管外面，余下的紙折疊打結，待滅菌。 B.培養(yǎng)皿的包裝：培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，用牛皮紙或報紙將8套培養(yǎng)皿（皿底朝里，皿蓋朝外，4套、4套相對而放）包好。 2. 培養(yǎng)基的配制（1）配制溶液 取一定容量的燒杯盛入100mL蒸餾水（有時也可用自來水），按培養(yǎng)基配方（0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g瓊脂、重金屬Cu離子）逐一稱取各種成分，依次加入水中

7、溶解。蛋白胨、肉膏等可加熱促進溶解，待全部溶解后，加水補足因加熱蒸發(fā)的水量。在制備固體培養(yǎng)基加熱融化瓊脂時要注意攪拌，避免瓊脂糊底燒焦。（2）調節(jié)pH，再加瓊脂 一般剛配好的培養(yǎng)基是偏酸性的，故要用質量濃度為100gL NaOH調pH至7.2-7.4.應緩慢加入NaOH，邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試。調整至所需的pH。（3）分裝 A.分裝試管：將培養(yǎng)基趁熱加至漏斗中。分裝時左手并排地拿數(shù)根試管，右手控制彈簧夾，將培養(yǎng)基依次加入各試管，用于制造斜面培養(yǎng)基時，一般裝量不超過試管高度（15mm*150mm）的15。分裝時謹防培養(yǎng)基沾在管口上，否則會使棉塞沾上培養(yǎng)基而造成染菌。（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

8、的配方：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，Nacl 0.5g,瓊脂2.0g，水100ml,pH7.2-7.4，重金屬Cu離子。） B.加硅膠塞、包裝后滅菌。滅菌條件：121攝氏度（相對蒸氣壓力為0.103MPa）,20min。（4）斜面的制作 滅菌后如需制成斜面培養(yǎng)基，應在培養(yǎng)基冷卻至50-60攝氏度，將試管擱置成一定的斜度，斜面高度不超過試管總高度的13。3. 稀釋水的制備：試管稀釋水的制備 另取5支18 mm180mm的試管，分別裝9 mL蒸餾水，塞上硅膠塞，包扎后滅菌。4. 滅菌：加壓蒸汽滅菌法（1）向滅菌器內(nèi)加入清潔軟水（蒸餾水更好）：水位應不超過水位線標志，以免水進入滅菌桶內(nèi)，浸濕被滅菌物

9、品。（2）堆放物品并注意留有空隙：將需要滅菌的物品包好后，順序放在滅菌桶內(nèi)的篩板上。（3）蓋上蓋子：對稱地堅固螺栓，注意不宜旋得太緊，以免損壞橡膠密封墊圈。（4）打開電源置滅菌溫度：通過壓力-溫度控制器旋鈕預置，溫度預置范圍在109126左右（一般是121），普通培養(yǎng)基滅菌1530min，但容器和裝量較大時，應延長，順時針方向旋轉旋鈕，滅菌溫度預置值減??；反之，預置值增大。 可根據(jù)需要確定預置滅菌溫度。（5）設置滅菌時間：按照不同的需要，將計時器旋鈕按順時針方向旋至所需的時間刻度上，當達到預置的滅菌溫度時，計時指示燈亮，計時器自動計時。（6）加熱，排放冷空氣。（7）滅菌。（8）結束（關電源）：

10、此時切忌立即放氣，一定要待指針接近“零”位時，再打開放所閥，取出物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。 滅過菌的培訓基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或者陰涼處保存?zhèn)溆谩＃?）結束（關電源）：此時切忌立即放氣，一定要待指針接近“零”位時，再打開放所閥，取出物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。 5污泥樣品的采取取距污泥面10-15cm深層污泥樣品，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出，最好立即檢查，否則需放入冰箱中保存。6細菌總數(shù)測定（1）取加入9ml水的滅菌試管。取1ml污泥樣品注入第一管9ml滅菌水內(nèi)，搖勻，再自第一管取1m

11、l至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10-1、10-2與10-3。一般中等污穢污泥樣品，取10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀釋度，污穢嚴重的取10-2、10-3、10-4三個連續(xù)稀釋度。（2）自最后一個稀釋度的試管中各取1ml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。（3）各傾注15ml已溶化并冷卻至45左右的培養(yǎng)基，立即放在桌上混勻。（4）凝固后倒置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。7. 細菌的純種分離及培養(yǎng)（平板表面涂布法）（1）取樣：用無菌瓶從人工污泥中取一定量的污泥，迅速帶回實驗室。（2）融化培養(yǎng)基：加熱融化培養(yǎng)基，待用。（3）稀釋樣品：將1瓶90ml和5管（根據(jù)

12、預備實驗數(shù)據(jù)變化）9mL的無菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次編號。用1mL無菌移液管吸取1mL10-1濃度菌液于9mL無菌水中，將移液管吹洗3次，搖勻，即為10-2濃度菌液。同法依次稀釋到10-6。（4）倒平板：將融化并冷卻至50攝氏度左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板。（5）涂布：用無菌移液槍吸取一定量的經(jīng)適當稀釋的樣品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋轉涂布均勻。（6）培養(yǎng)：送恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)（正置），如果培養(yǎng)時間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)。8. 細菌的接種（1）準備：接種前將操作臺擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌上，用75%酒精擦手

13、。（2）編號：在試管上貼標簽，注明菌號、接種日期、接種人姓名、組別等。貼在距試管口約23cm的位置。也可用記號筆注明上述內(nèi)容。（3）點燃：酒精燈。（4）手持試管：將經(jīng)上述分離培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿菌落和一支含Cu離子的待接斜面培養(yǎng)基用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于水平位置，而且管口齊平。（5）灼燒接種環(huán)：右手先將硅膠塞擰松，以便接種時容易拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)燒紅以達到滅菌的目的。（6）接種：在火焰旁，用右手小指、無名指和手掌夾住硅膠塞將其拔出。試管口在火焰上微燒一周，將管口上可能沾染的少量菌或帶菌塵埃燒掉。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，使環(huán)

14、端輕觸內(nèi)管壁，冷卻后取種，立即轉移至待接種試管斜面上，自斜面底部開始向上做“Z”形致密劃線直至斜面頂端。抽出接種環(huán)，試管過后塞上硅膠塞，將試管放回試管架。灼燒接種環(huán)，殺滅環(huán)上細菌。送培養(yǎng)箱（37）培養(yǎng)，待看結果。9. 菌落形態(tài)的觀察（1）將自己培養(yǎng)篩選的細菌菌落逐個辨認并編號，按號碼順序將各細菌的菌落特征描述、記錄。（2）繪制菌落形態(tài)圖（或者照片記錄）。主要特征細菌酵母菌放線菌霉菌菌落主要特征濕潤或較濕潤，少數(shù)干燥，小而突起或大而平坦較濕潤，大而突起，菌苔較厚干燥或較干燥，小而緊密干燥，大而疏松或大而緊密菌落透明度透明、半透明或不透明稍透明不透明不透明菌落與培養(yǎng)基結合程度結合不緊結合不緊牢固結

15、合較牢固結合菌落顏色顏色多樣顏色單調，多為乳白色，少數(shù)紅色顏色多樣顏色多樣，且鮮艷菌落正反面顏色的差別基本不同基本相同一般不同一般不同 5、 數(shù)據(jù)記錄1.污泥中細菌總數(shù)A.細菌總數(shù)的菌落計數(shù)方法進行平皿菌落計數(shù)是，可用肉眼觀察，也可借助放大鏡和菌落計數(shù)器計數(shù)。（1）先計算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個培養(yǎng)皿有較大片狀菌苔生長時，則不應采用，而應以無片狀菌苔生長的培養(yǎng)皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到培養(yǎng)皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全培養(yǎng)皿的菌落數(shù)，然后再計算該稀釋度的平均菌落數(shù)。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30300之間的，當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該污泥樣品的細菌總數(shù)（見下表）。（3）若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)在30300之間，則應按兩者菌落數(shù)以各自稀釋倍數(shù)后的總數(shù)之比（稀釋度高的數(shù)/稀釋度低的數(shù)）來決定。若其值小于2，應報告兩個總數(shù)的平均數(shù)（若大于等于2則報告其中較少的菌落總數(shù)）（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（7