胚胎冷凍保存技術(shù)

1、胚胎冷凍保存技術(shù)簡(jiǎn)介胚胎冷凍保存技術(shù)簡(jiǎn)介 毛毛 菲（中菲（中 藥）藥） 鄭志琪（生物技術(shù)）鄭志琪（生物技術(shù)） 張建飛（生物技術(shù)）張建飛（生物技術(shù)） 魏魏 彬（生科基地）彬（生科基地） 胚胎冷凍保存胚胎冷凍保存是采取特殊的保護(hù)措施和降溫是采取特殊的保護(hù)措施和降溫 程序，使胚胎或卵母細(xì)胞在程序，使胚胎或卵母細(xì)胞在-196-196的條件下停的條件下停 止代謝，而升溫后又不失去代謝恢復(fù)能力的一止代謝，而升溫后又不失去代謝恢復(fù)能力的一 種種長(zhǎng)期保存胚胎和卵母細(xì)胞長(zhǎng)期保存胚胎和卵母細(xì)胞的技術(shù)。的技術(shù)。 概 念 圖為世界首例冷凍胚胎克隆水牛“盼盼”（左）與“代孕媽媽”在一起 原原 理理 冷凍保存冷凍保存,

2、,是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或小加冷是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或小加冷 凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速度降至零下凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速度降至零下 某一溫度，對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。此時(shí)細(xì)胞的某一溫度，對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。此時(shí)細(xì)胞的代代 謝活動(dòng)被完全抑制謝活動(dòng)被完全抑制，使細(xì)胞的生命在，使細(xì)胞的生命在靜止?fàn)顟B(tài)靜止?fàn)顟B(tài)下下 保存來(lái)，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。保存來(lái)，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。 意意 義義 胚胎移植不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，提高了胚胚胎移植不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，提高了胚 胎移植技術(shù)的效率；胎移植技術(shù)的效率； 長(zhǎng)期保存優(yōu)良母?；蜃羁煽康募夹g(shù)措施；長(zhǎng)期保存優(yōu)良母?；蜃羁煽康募夹g(shù)措施； 便

3、于國(guó)際間交流；便于國(guó)際間交流； 替代種畜引種。替代種畜引種。 冷凍損傷原因冷凍損傷原因 胚胎的冷凍是一個(gè)脫水過(guò)程，冷凍保存的關(guān)鍵是胚胎的冷凍是一個(gè)脫水過(guò)程，冷凍保存的關(guān)鍵是 設(shè)法設(shè)法減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)胚胎造成的損傷減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)胚胎造成的損傷。 在冷凍過(guò)程中，胚胎細(xì)胞中的水分將從細(xì)胞中游在冷凍過(guò)程中，胚胎細(xì)胞中的水分將從細(xì)胞中游 離出來(lái)冷凍成冰晶，一方而對(duì)胚胎細(xì)胞造成機(jī)械離出來(lái)冷凍成冰晶，一方而對(duì)胚胎細(xì)胞造成機(jī)械 性損傷即性損傷即冰晶損傷冰晶損傷，另一方而導(dǎo)致未結(jié)冰的細(xì)胞，另一方而導(dǎo)致未結(jié)冰的細(xì)胞 內(nèi)溶液滲透壓急劇增高，造成蛋自質(zhì)變性即內(nèi)溶液滲透壓急劇增高，造成蛋自質(zhì)變性即溶液溶液 損傷。損傷

4、。 誘發(fā)結(jié)晶誘發(fā)結(jié)晶 使用冷凍保護(hù)劑使用冷凍保護(hù)劑 玻璃化玻璃化 損傷保護(hù)損傷保護(hù) 誘發(fā)結(jié)晶誘發(fā)結(jié)晶 在在-7-7左右時(shí)通過(guò)人工強(qiáng)制誘發(fā)結(jié)晶，以避免較大冰晶的形成和劇烈左右時(shí)通過(guò)人工強(qiáng)制誘發(fā)結(jié)晶，以避免較大冰晶的形成和劇烈 的溫度變化。的溫度變化。誘發(fā)結(jié)晶主要在降溫速率較慢的冷凍方法中使用。誘發(fā)結(jié)晶主要在降溫速率較慢的冷凍方法中使用。誘發(fā)誘發(fā) 方法有兩種：用液氮預(yù)冷過(guò)的鑷子夾麥管中部含卵母細(xì)胞的冷凍液方法有兩種：用液氮預(yù)冷過(guò)的鑷子夾麥管中部含卵母細(xì)胞的冷凍液 上部；在冷凍液中加入制冷劑晶母等。上部；在冷凍液中加入制冷劑晶母等。 使用冷凍保護(hù)劑使用冷凍保護(hù)劑 玻璃化玻璃化 損傷保護(hù)損傷保護(hù) 誘發(fā)

5、結(jié)晶誘發(fā)結(jié)晶 使用使用冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑滲入到細(xì)胞內(nèi)后，能增加整個(gè)細(xì)胞的粘度和細(xì)胞內(nèi)的溶冷凍保護(hù)劑滲入到細(xì)胞內(nèi)后，能增加整個(gè)細(xì)胞的粘度和細(xì)胞內(nèi)的溶 質(zhì)濃度，使質(zhì)濃度，使冰晶生長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)力減弱，減少冰晶的形成。冰晶生長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)力減弱，減少冰晶的形成。 玻璃化玻璃化 損傷保護(hù)損傷保護(hù) 滲滲 透透 性性：甘油、乙二醇（甘油、乙二醇（EGEG）、丙二醇（）、丙二醇（PGPG）和）和 DMSODMSO等，防止溶質(zhì)效應(yīng)。等，防止溶質(zhì)效應(yīng)。 非滲透性非滲透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVPPVP和聚蔗糖等，和聚蔗糖等， 降低胚胎外液的冰點(diǎn)，減少胚胎外冰晶形成，并能促使降低胚

6、胎外液的冰點(diǎn)，減少胚胎外冰晶形成，并能促使 胚胎內(nèi)部的水分外流，從而最終減少胚胎內(nèi)部冰晶的形胚胎內(nèi)部的水分外流，從而最終減少胚胎內(nèi)部冰晶的形 成。成。 冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑 特點(diǎn)：分子量小于100，易于滲透 特點(diǎn)：分子量大，不進(jìn)入細(xì)胞 誘發(fā)結(jié)晶誘發(fā)結(jié)晶 使用冷凍保護(hù)劑使用冷凍保護(hù)劑 玻璃化玻璃化 玻璃化是高濃度的冷凍保護(hù)液在低溫或超低溫下溶液由液相變?yōu)楣滔嗖ＡЩ歉邼舛鹊睦鋬霰Ｗo(hù)液在低溫或超低溫下溶液由液相變?yōu)楣滔?時(shí)，其內(nèi)部的分子、離子分布不改變其原有的分布，不形成有規(guī)則外時(shí)，其內(nèi)部的分子、離子分布不改變其原有的分布，不形成有規(guī)則外 表的物質(zhì)形態(tài)，可表的物質(zhì)形態(tài)，可有效避免冰晶形成有效避免冰

7、晶形成時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)和亞時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)和亞 細(xì)胞器膜的牽拉斷裂和尖銳刺傷。細(xì)胞器膜的牽拉斷裂和尖銳刺傷。 損傷保護(hù)損傷保護(hù) 一，保護(hù)劑的加入一，保護(hù)劑的加入 大都采用一步法加入保護(hù)劑。胚胎移入保護(hù)液時(shí)溫度大都采用一步法加入保護(hù)劑。胚胎移入保護(hù)液時(shí)溫度 應(yīng)為應(yīng)為18201820，平衡時(shí)間為，平衡時(shí)間為1525min1525min。 二，裝管二，裝管 胚胎冷凍一般采用胚胎冷凍一般采用0.25ml0.25ml精液冷凍細(xì)管。精液冷凍細(xì)管。 1.1. 將細(xì)管有棉塞的一端插入裝管器。將細(xì)管有棉塞的一端插入裝管器。 2.2. 按按保護(hù)液（保護(hù)液（段）段）氣泡氣泡胚胎和保護(hù)液（胚胎和保護(hù)液

8、（段）段） 氣泡氣泡保護(hù)液（保護(hù)液（段）段）順序裝管。順序裝管。 3.3. 在實(shí)體顯微鏡下檢驗(yàn)胚胎是否裝入管內(nèi)。在實(shí)體顯微鏡下檢驗(yàn)胚胎是否裝入管內(nèi)。 4.4. 封管。封管。 冷凍過(guò)程冷凍過(guò)程 冷凍過(guò)程冷凍過(guò)程 三，保存三，保存 常規(guī)冷凍法常規(guī)冷凍法 一步冷凍法一步冷凍法 玻璃化冷凍法玻璃化冷凍法 歷史：歷史：19721972年首先獲小鼠胚胎冷凍成功；年首先獲小鼠胚胎冷凍成功； 19731973年牛的胚胎冷凍后獲得成功，并年牛的胚胎冷凍后獲得成功，并 產(chǎn)下后代。產(chǎn)下后代。 操作流程：操作流程： （1 1）抗凍液中平衡：）抗凍液中平衡：室溫下（室溫下（20-2520-25），）， 在含有在含有1-

9、21-2摩爾摩爾升抗凍劑的磷酸緩沖液升抗凍劑的磷酸緩沖液 （PBSPBS）中，胚胎經(jīng)）中，胚胎經(jīng)1010分鐘平衡，使細(xì)胞內(nèi)分鐘平衡，使細(xì)胞內(nèi) 部抗凍劑濃度基本達(dá)到飽和。部抗凍劑濃度基本達(dá)到飽和。 常 規(guī) 冷 凍 法 （2 2）植冰（誘發(fā)結(jié)冰）：）植冰（誘發(fā)結(jié)冰）： 植冰的概念：植冰的概念：在液氮中冷卻后的鑷子或棉簽夾在液氮中冷卻后的鑷子或棉簽夾 住塑料細(xì)管上端（棉栓端），使抗凍液迅速住塑料細(xì)管上端（棉栓端），使抗凍液迅速 通過(guò)通過(guò)66左右冰點(diǎn)，左右冰點(diǎn)，強(qiáng)制性地使細(xì)胞外液強(qiáng)制性地使細(xì)胞外液 形成冰晶形成冰晶，稱(chēng)之為植冰。，稱(chēng)之為植冰。 目的：目的：當(dāng)溫度降到抗凍液冰點(diǎn)附近時(shí)，經(jīng)植冰當(dāng)溫度降到抗

10、凍液冰點(diǎn)附近時(shí)，經(jīng)植冰 迅速凍結(jié)，迅速凍結(jié)，以防胚胎細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶以防胚胎細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生冰晶，給，給 胚胎造成物理性的損傷，致使胚胎死亡。胚胎造成物理性的損傷，致使胚胎死亡。 將胚胎移入事先配置好抗凍液的將胚胎移入事先配置好抗凍液的0.250.25毫毫 升塑料細(xì)管內(nèi)封口后進(jìn)行冷卻。當(dāng)溫度降至升塑料細(xì)管內(nèi)封口后進(jìn)行冷卻。當(dāng)溫度降至 66左右時(shí)，用上述方法誘發(fā)結(jié)冰。左右時(shí)，用上述方法誘發(fā)結(jié)冰。 常 規(guī) 冷 凍 法 （3 3）自動(dòng)降溫儀中緩慢降溫）自動(dòng)降溫儀中緩慢降溫：植冰后的細(xì)管按：植冰后的細(xì)管按 一定速度緩慢降溫。一定速度緩慢降溫。 以以0.330.33分鐘降至分鐘降至30-30-3535時(shí)投入

11、液氮；時(shí)投入液氮； 以以1.01.0分鐘的速度降至分鐘的速度降至8080時(shí)投入液氮；時(shí)投入液氮； 以以0.50.5分鐘降至分鐘降至30-30-3535時(shí)投入液氮。時(shí)投入液氮。 原理：原理：植冰后使細(xì)胞外液濃度相對(duì)增高，促使細(xì)植冰后使細(xì)胞外液濃度相對(duì)增高，促使細(xì) 胞內(nèi)部水分充分脫出，因此緩慢降溫是非常必胞內(nèi)部水分充分脫出，因此緩慢降溫是非常必 要的。由于脫水使細(xì)胞內(nèi)部充分收縮，同時(shí)抗要的。由于脫水使細(xì)胞內(nèi)部充分收縮，同時(shí)抗 凍劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部使內(nèi)部溶液黏性增大，這凍劑滲透到細(xì)胞內(nèi)部使內(nèi)部溶液黏性增大，這 時(shí)投入液氮中，時(shí)投入液氮中，由于過(guò)冷抑制冰晶形成由于過(guò)冷抑制冰晶形成。 常 規(guī) 冷 凍 法

12、（4 4）解凍：）解凍：貯存在液氮中的塑料細(xì)管取出貯存在液氮中的塑料細(xì)管取出 后，迅速浸入室溫或后，迅速浸入室溫或3737水浴中解凍。水浴中解凍。 （5 5）除去抗凍劑：）除去抗凍劑： 原因：原因： 解凍后的胚胎，細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑濃解凍后的胚胎，細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑濃 度較高，對(duì)胚胎有毒害作用；此外，若直度較高，對(duì)胚胎有毒害作用；此外，若直 接移入等滲生理溶液中，水分會(huì)伸入細(xì)胞接移入等滲生理溶液中，水分會(huì)伸入細(xì)胞 內(nèi)引起膨脹，使細(xì)胞受損傷。內(nèi)引起膨脹，使細(xì)胞受損傷。 抗凍液：抗凍液：蔗糖溶液；蔗糖溶液； 常 規(guī) 冷 凍 法 也叫一步細(xì)管法。也叫一步細(xì)管法。 該方法是由慢速冷凍法改進(jìn)而來(lái)，細(xì)該方法是由慢

13、速冷凍法改進(jìn)而來(lái)，細(xì) 管內(nèi)的冷凍液和蔗糖液是分開(kāi)的，因管內(nèi)的冷凍液和蔗糖液是分開(kāi)的，因 此，在細(xì)管內(nèi)用蔗糖液可一步脫除甘此，在細(xì)管內(nèi)用蔗糖液可一步脫除甘 油抗凍劑，從而油抗凍劑，從而利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng) 用用。 一 步 冷 凍 法 被冷凍的人工胚胎 存放冷凍胚胎的液氮罐 幾種常見(jiàn)的玻璃化冷凍方法：幾種常見(jiàn)的玻璃化冷凍方法： （1 1）RallRall等（等（19851985）玻璃化冷凍保存法：）玻璃化冷凍保存法：是最初發(fā)明的玻是最初發(fā)明的玻 璃化冷凍保存方法，他們采用的璃化冷凍保存方法，他們采用的VS1VS1玻璃化溶液，是以透玻璃化溶液，是以透 過(guò)性抗凍劑過(guò)性抗凍劑二甲基亞砜（

14、二甲基亞砜（DMSODMSO）為主體溶液）為主體溶液，為緩和其，為緩和其 化學(xué)毒性，添加了乙酰胺化學(xué)毒性，添加了乙酰胺(AA)(AA)、丙二醇、丙二醇(PG)(PG)和非透過(guò)性和非透過(guò)性 抗凍劑聚乙二醇抗凍劑聚乙二醇(PEG)(PEG)。PEGPEG具有促進(jìn)玻璃化形成的作用。具有促進(jìn)玻璃化形成的作用。 胚胎在玻璃化溶液中平衡時(shí)，濃度由低到高（胚胎在玻璃化溶液中平衡時(shí)，濃度由低到高（2525-50-50 -100-100VS1VS1）；平衡溫度由高到低（）；平衡溫度由高到低（22-4-22-4-44）三步完）三步完 成，計(jì)成，計(jì)3535分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。

15、 玻璃化冷凍法 （2 2）ScheffenScheffen等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法： 主體抗凍劑：主體抗凍劑：丙三醇（丙三醇（G G）和丙二醇）和丙二醇(P)(P)； 玻璃化溶液：玻璃化溶液：上述兩種抗凍劑各含上述兩種抗凍劑各含2525混合混合 而成而成(PG25)(PG25)，兩者混合后可降低溶液的化，兩者混合后可降低溶液的化 學(xué)毒性，無(wú)需添加細(xì)胞非透過(guò)性抗凍劑。學(xué)毒性，無(wú)需添加細(xì)胞非透過(guò)性抗凍劑。 方法：方法：室溫下（室溫下（20-2520-25），胚胎于），胚胎于1010丙三丙三 醇溶液中平衡醇溶液中平衡1010分鐘，然后在分鐘，然后在PG25PG25中平衡中平衡 3030

16、秒鐘，然后投入液氮中冷凍保存。秒鐘，然后投入液氮中冷凍保存。 玻璃化冷凍法 （3 3）KasaiKasai等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法： 主體抗凍劑：乙二醇主體抗凍劑：乙二醇（EGEG）為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑）為細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑 （透過(guò)性保護(hù)劑），其具備分子量小、溶液滲（透過(guò)性保護(hù)劑），其具備分子量小、溶液滲 透壓高、細(xì)胞膜透過(guò)性強(qiáng)的特點(diǎn)；透壓高、細(xì)胞膜透過(guò)性強(qiáng)的特點(diǎn)；聚蔗糖聚蔗糖 （FicollFicoll）為細(xì)胞外液抗凍劑，有利于促進(jìn)玻）為細(xì)胞外液抗凍劑，有利于促進(jìn)玻 璃化形成；璃化形成；蔗糖蔗糖(Sucrose)(Sucrose)是為了冷凍前胚胎是為了冷凍前胚胎 細(xì)胞的脫水，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞的脫水，細(xì)胞內(nèi)部EGEG的調(diào)整及解凍后的的調(diào)整及解凍后的EGEG 的脫出。的脫出。 玻璃化溶液：玻璃化溶液：上述三種抗凍劑經(jīng)上述三種抗凍劑經(jīng)mPBSmPBS調(diào)整成調(diào)整成EFSEFS 玻璃化溶液；玻璃化溶液； 方法：方法：室溫胚胎在室溫胚胎在EFSEFS玻璃化溶液中玻璃化溶液中2-52-5分鐘平衡分鐘平衡 后，即投入液氮。后，即投入液氮。 玻璃化冷凍法 （4 4）ZhuZhu等玻璃化冷凍保存法：等玻璃化冷凍保存法： 主體抗凍劑：主體抗凍劑：乙二醇、甘油和二甲基亞砜；乙二醇、甘油和二甲基亞砜； 玻璃化溶液：玻璃化溶液：E