生物樣品前處理課件

1、趙 世 光現(xiàn)代生化分離技術(shù)現(xiàn)代生化分離技術(shù)Separation Methods in Biochemistry Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering2生物樣品前處理生物樣品前處理第二章第二章 生物樣品前處理生物樣品前處理Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical E

2、ngineering3生物樣品前處理生物樣品前處理第一節(jié) 樣品分離的預(yù)提取第二節(jié) 細(xì)胞的破碎與分離 第一章 緒論Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering4生物樣品前處理生物樣品前處理第一節(jié) 樣品分離的預(yù)提?。ㄇ疤幚恚?前處理的目的：對目標(biāo)組分進(jìn)行初步富集，前處理的目的：對目標(biāo)組分進(jìn)行初步富集，對干擾成分對干擾成分進(jìn)行去除；進(jìn)行去除； 2.1.1 2.1.1 概述概述預(yù)處理材料的種類和特點預(yù)處理材料的種類和特點 動物細(xì)胞

3、反應(yīng)液動物細(xì)胞反應(yīng)液植物細(xì)胞反應(yīng)液植物細(xì)胞反應(yīng)液微生物細(xì)胞反應(yīng)液微生物細(xì)胞反應(yīng)液植物組織提取液植物組織提取液動物組織提取液動物組織提取液“發(fā)酵液發(fā)酵液” “” “產(chǎn)物產(chǎn)物”，胞內(nèi)，胞內(nèi)oror胞外？胞外？組織組織Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering5生物樣品前處理生物樣品前處理2.1.2 2.1.2 植物組織提取物的制備植物組織提取物的制備Anhui University of Technology and Sci

4、enceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering6生物樣品前處理生物樣品前處理一些酶必須從富含酚、多酚的綠葉、水果和其它組織中一些酶必須從富含酚、多酚的綠葉、水果和其它組織中提取，大量的分類化合物給提取帶來困難。在完整的細(xì)胞提取，大量的分類化合物給提取帶來困難。在完整的細(xì)胞組織中，酶和酚類物質(zhì)處于彼此隔離的狀態(tài)，細(xì)胞組織被組織中，酶和酚類物質(zhì)處于彼此隔離的狀態(tài)，細(xì)胞組織被破壞后，彼此接觸，很容易發(fā)生酶促反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物苯醌破壞后，彼此接觸，很容易發(fā)生酶促反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物苯醌和單寧類還會繼續(xù)和酶蛋白質(zhì)反應(yīng)，

5、破壞目的酶的活性。和單寧類還會繼續(xù)和酶蛋白質(zhì)反應(yīng)，破壞目的酶的活性。所以要在預(yù)處理階段去除酚類化合物。所以要在預(yù)處理階段去除酚類化合物。 2.1.2.1 2.1.2.1 植物組織中酶的提取植物組織中酶的提取Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering7生物樣品前處理生物樣品前處理例子：植物組織中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取例子：植物組織中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1. 步驟：步驟：100g100g新鮮葉片新鮮葉片切成小片（打孔器

6、、切片）切成小片（打孔器、切片）置入提取置入提取液中（穩(wěn)定酶活性）液中（穩(wěn)定酶活性）PVPPPVPP預(yù)浸泡（預(yù)浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性酮，可溶性PVPPVP聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮，），）間歇高速攪拌（充分接間歇高速攪拌（充分接觸混勻）觸混勻）紗布過濾紗布過濾濾液加入濾液加入PVPPPVPP重復(fù)輕攪（重復(fù)一重復(fù)輕攪（重復(fù)一次）次）離心去除離心去除PVPPPVPP酶粗提液。酶粗提液。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Bioc

7、hemical Engineering8生物樣品前處理生物樣品前處理2. 條件討論條件討論低溫（低溫（45度），器皿、溶液預(yù)冷、操作要快；度），器皿、溶液預(yù)冷、操作要快；57倍于固形材料的提取液，攪拌不產(chǎn)生氣泡（氣泡不倍于固形材料的提取液，攪拌不產(chǎn)生氣泡（氣泡不利于酶活穩(wěn)定）；利于酶活穩(wěn)定）；PH6.57.0，中性，未知蛋白酶要遠(yuǎn)離等電點；，中性，未知蛋白酶要遠(yuǎn)離等電點；PVPP優(yōu)良，不溶性；優(yōu)良，不溶性；PPO抑制劑，抑制劑，DTT、2-ME；蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，劇毒。（苯甲磺酰氟）酒精溶解，劇毒。Anhui University of Technolog

8、y and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering9生物樣品前處理生物樣品前處理2.1.2.2 2.1.2.2 多糖提取多糖提取重要活性多糖重要活性多糖步驟：原料步驟：原料粉碎粉碎醇醚回流脫脂醇醚回流脫脂水提取水提取粗提液粗提液去蛋白策略：去蛋白策略：SevagSevag法，蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中變法，蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中變性性TCATCA法，低濃度的法，低濃度的TCATCA可沉淀蛋白質(zhì)，離心后即可除去可沉淀蛋白質(zhì)，離心后即可除去蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。Anhui University

9、of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering10生物樣品前處理生物樣品前處理2.1.2.3 2.1.2.3 細(xì)菌重組蛋白的提取細(xì)菌重組蛋白的提取重組蛋白：工程菌可表達(dá)大量的重組目的蛋白，重組蛋白：工程菌可表達(dá)大量的重組目的蛋白，40%40%總蛋總蛋白含量，但易形成包涵體（蛋白質(zhì)以不溶形式包涵在細(xì)白含量，但易形成包涵體（蛋白質(zhì)以不溶形式包涵在細(xì)胞質(zhì)中）。胞質(zhì)中）。Anhui University of Technology and ScienceTeachi

10、ng and Research Section Department of Biochemical Engineering11生物樣品前處理生物樣品前處理例：例：E. coli.E. coli.中提取重組蛋白中提取重組蛋白1. 步驟：步驟：酶解菌體細(xì)胞：離心收集菌體酶解菌體細(xì)胞：離心收集菌體溶菌酶溶菌酶去核酸（去核酸（DNaseDNase）電泳檢測；電泳檢測；清洗包涵體：去除雜蛋白，保證包涵體蛋白不被溶清洗包涵體：去除雜蛋白，保證包涵體蛋白不被溶解；解；溶解包涵體：釋放目的蛋白；溶解包涵體：釋放目的蛋白；目的蛋白再折疊：恢復(fù)活性目的蛋白再折疊：恢復(fù)活性Anhui University of T

11、echnology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering12生物樣品前處理生物樣品前處理第二節(jié) 細(xì)胞的破碎與分離微生物代謝產(chǎn)物：微生物代謝產(chǎn)物： 胞外產(chǎn)物（氨基酸、細(xì)菌堿性蛋白酶、糖化酶等）胞外產(chǎn)物（氨基酸、細(xì)菌堿性蛋白酶、糖化酶等） 胞內(nèi)產(chǎn)物（大多數(shù)蛋白質(zhì)、類脂）胞內(nèi)產(chǎn)物（大多數(shù)蛋白質(zhì)、類脂） 微生物代謝產(chǎn)物大多數(shù)分泌到胞外，但有些目標(biāo)產(chǎn)物微生物代謝產(chǎn)物大多數(shù)分泌到胞外，但有些目標(biāo)產(chǎn)物存在細(xì)胞內(nèi)部。目前重組存在細(xì)胞內(nèi)部。目前重組DNADNA技術(shù)，表達(dá)的產(chǎn)品（如胰技術(shù)，表達(dá)的

12、產(chǎn)品（如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素等），都是胞內(nèi)產(chǎn)物。首島素、干擾素、白細(xì)胞介素等），都是胞內(nèi)產(chǎn)物。首先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。取。 2.2.1 概述概述Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering13生物樣品前處理生物樣品前處理2.2.2 2.2.2 常用破碎方法常用破碎方法機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破

13、碎法、X-X-presspress法等；對物料的擠壓和剪切作用法等；對物料的擠壓和剪切作用非機械法：酶溶法、化學(xué)滲透法、凍融法、干燥法等；非機械法：酶溶法、化學(xué)滲透法、凍融法、干燥法等；Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering14生物樣品前處理生物樣品前處理2.2.2.1 2.2.2.1 珠磨法珠磨法原理：原理：進(jìn)入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑（玻功小珠、進(jìn)入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑（玻功小珠、石英砂、氧化

14、鋁石英砂、氧化鋁d1mmdG+G-G+酵母。酵母。易失活物質(zhì)不宜用（超聲波可促使產(chǎn)生一些化學(xué)自由，易失活物質(zhì)不宜用（超聲波可促使產(chǎn)生一些化學(xué)自由，基因使敏感活性物質(zhì)失活），可加入保護(hù)劑基因使敏感活性物質(zhì)失活），可加入保護(hù)劑N2N2、PMSFPMSF等等 特點：特點：Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering20生物樣品前處理生物樣品前處理溶菌酶（細(xì)菌），溶菌酶（細(xì)菌），-3-3，3-3-葡聚糖酶，葡聚糖酶，-1-1，6-

15、6-葡聚糖酶，葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鍵內(nèi)切酶，殼多糖酶，細(xì)胞蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽鍵內(nèi)切酶，殼多糖酶，細(xì)胞壁溶解酶（復(fù)合酶），酵母。酶有專一性。壁溶解酶（復(fù)合酶），酵母。酶有專一性。特點：特點：條件溫和，核酸泄出量少，選擇性釋放產(chǎn)物（可從細(xì)胞不同條件溫和，核酸泄出量少，選擇性釋放產(chǎn)物（可從細(xì)胞不同位置）位置）價格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用價格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，最佳條件不易確定；通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，最佳條件不易確定；產(chǎn)物抑制的存在：在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖產(chǎn)物抑制的存在：在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖酶葡聚糖酶

16、2.2.2.4 2.2.2.4 酶溶法酶溶法外加酶外加酶Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering21生物樣品前處理生物樣品前處理 將新鮮的生物材料存放于一定的將新鮮的生物材料存放于一定的pHpH和適當(dāng)?shù)臏囟认潞瓦m當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶，細(xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。出來。特點：特點：

17、 對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)變性。對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)變性。 自溶后，細(xì)胞懸浮液粘度上升，過濾速率下降。自溶后，細(xì)胞懸浮液粘度上升，過濾速率下降。自溶法自溶法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering22生物樣品前處理生物樣品前處理2.2.2.5 2.2.2.5 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法原理：原理：使用某些可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲使用某些可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性）的化學(xué)試劑，使胞內(nèi)物質(zhì)有

18、選擇地滲透出來透性）的化學(xué)試劑，使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來，稱為化學(xué)滲透法。，稱為化學(xué)滲透法。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering23生物樣品前處理生物樣品前處理 表面活性物質(zhì)：促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作表面活性物質(zhì)：促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞破碎用有助于細(xì)胞破碎 EDTAEDTA螯合劑：與結(jié)構(gòu)中螯合劑：與結(jié)構(gòu)中ca2+ca2+或或Mg2+Mg2+螯合，使其原有螯合，使其原有結(jié)構(gòu)破壞而破裂結(jié)構(gòu)破

19、壞而破裂 有機溶劑：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高級醇等，有機溶劑：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高級醇等，能被細(xì)胞壁中的類脂吸收，使胞壁膜溶脹，導(dǎo)致細(xì)能被細(xì)胞壁中的類脂吸收，使胞壁膜溶脹，導(dǎo)致細(xì)胞破碎；胞破碎； 變性劑：與水中氫鍵作用，減弱水的極性，使疏水變性劑：與水中氫鍵作用，減弱水的極性，使疏水性化合物溶于水性化合物溶于水Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering24生物樣品前處理生物樣品前處理特點特點選擇性釋放產(chǎn)物?？墒挂?/p>

20、些較小分子量的溶質(zhì)，如多肽選擇性釋放產(chǎn)物?？墒挂恍┹^小分子量的溶質(zhì)，如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)。在胞內(nèi)。細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。離和進(jìn)一步提取。通用性差，某種試劑只能作用于某種特定類型細(xì)胞；通用性差，某種試劑只能作用于某種特定類型細(xì)胞；時間長、效率低，胞內(nèi)物一般釋放率不超過時間長、效率低，胞內(nèi)物一般釋放率不超過80%80%；有些化學(xué)試劑有毒，在其后產(chǎn)物提取精時，需分離除去有些化學(xué)試劑有毒，在其后產(chǎn)物提取精時，需分離除去。A

21、nhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering25生物樣品前處理生物樣品前處理 將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。

22、適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。性。 2.2.2.6 2.2.2.6 反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)融化法融化法原理：原理：Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering26生物樣品前處理生物樣品前處理使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用

23、丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥2.2.2.72.2.2.7干燥法干燥法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering27生物樣品前處理生物樣品前處理X-pressX-press法：將濃縮的菌體懸浮液冷卻至法：將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25-25形成形成冰晶體，利用冰晶體，利用500MPa500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點，但不