伴有紅細(xì)胞和血小板異常的植物固醇血癥臨床及發(fā)病機(jī)制的研究

1、伴有紅細(xì)胞和血小板異常的植物固醇血癥臨床及發(fā)病機(jī)制的研究巨大血小板病( giant platelet disorders,GPD )是一組異質(zhì)性疾病 , 表現(xiàn) 為血小板減少 , 巨大血小板和不同程度的出血。 近年來 , 隨著實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的進(jìn) 展, 新的巨大血小板病不斷地被發(fā)現(xiàn) , 但至今還有相當(dāng)多的病例不能被分類和鑒 定, 易造成誤診。在臨床實(shí)際工作中 , 我們發(fā)現(xiàn)一些巨大血小板病不是血小板本身的病變 , 而 是其它疾病的一種特殊表型。最近我們遇到了一種罕見的病例 , 患者除表現(xiàn)巨大 血小板減少外 , 還表現(xiàn)為紅細(xì)胞異形、溶血性貧血和血漿植物固醇明顯增高。對這種伴有巨大血小板的特殊病例進(jìn)行深

2、入細(xì)致的研究 , 有助于臨床醫(yī)生正 確的認(rèn)識此類疾病 ,及時(shí)地作出診斷、鑒別診斷和治療 , 并為將來的進(jìn)一步研究提 供理論根底。目的巨大血小板減少與溶血性貧血共存在血液病中十分罕見 , 而且 人們對其認(rèn)識不清。一些血液病表現(xiàn)為溶血性貧血伴血小板減少 , 如 Evans 綜合征、血栓性血 小板減少性紫癜等 ,但它們的血小板體積不大。 1969年由 Ducrou 等提出的地中 ?？谛渭t細(xì)胞增多癥 / 地中海巨大血小板減少癥 , 臨床上表現(xiàn)為口形紅細(xì)胞增多 性溶血性貧血和巨大血小板 , 但僅見于澳大利亞的 Adelaide 地區(qū) , 未見于其它地 中海地區(qū) , 其病因和發(fā)病機(jī)制不清。1974年Bha

3、ltacharyya等首次報(bào)道了植物固醇血癥(又稱B -谷固醇血癥)， 它是一種罕見的常染色體隱性遺傳性脂質(zhì)代謝性疾病。 特征是植物固醇特別是谷 固醇在血液和組織中積聚 , 從而引起黃色瘤 , 早發(fā)性冠心病、動脈硬化、關(guān)節(jié)炎等。2005年Rees等首次報(bào)道了表現(xiàn)為口形紅細(xì)胞增多和巨大血小板的植物固醇 血癥。最近 , 我們發(fā)現(xiàn)了來自江蘇鹽城的一個(gè)家庭的 3 個(gè)孩子自幼表現(xiàn)為溶血性 貧血和巨大血小板減少 , 與地中海巨大血小板減少癥相似 , 但隨著年齡的增長逐 漸出現(xiàn)皮膚的黃色瘤。為了了解這種血液學(xué)異常與植物固醇之間的關(guān)系 , 為了說明此類疾病發(fā)生的 分子機(jī)制以及將此類疾病與其它巨大血小板病區(qū)別開

4、來 , 我們對此家系的臨床、 生物化學(xué)和分子生物學(xué)特征進(jìn)行了研究。 方法第 1 局部建立特異精確的血漿植物 固醇測定方法 , 以便植物固醇血癥的診斷。制備谷固醇、豆固醇和二氫膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液及收集患者、他們父母和10 名正常人非抗凝禁食血2ml。100卩l(xiāng)血清或標(biāo)準(zhǔn)溶液用1mol/L氫氧化鉀乙醇溶液 皂化, 正己烷溶液提取 ,苯甲酰氯溶液衍生。衍生物再用正己烷溶液提取，然后在氮?dú)饬飨聯(lián)]發(fā)蒸干。非揮發(fā)物用100卩l(xiāng) 四氫呋喃：乙腈1:1 溶解液溶解后,取10卩l(xiāng)注入高效液相色譜HPLC進(jìn)行 測定。HPLC儀為美國 Agilent1100 系統(tǒng)，層析柱為 Diamonsil C18,流 動相為乙腈和

5、異丙醇75:25,v/v ,流速為1ml/min。在235nm的波長下測定紫 外吸收值。第 2 局部分析一個(gè)植物固醇血癥家系的臨床特征。 光學(xué)顯微鏡觀察紅細(xì)胞和 血小板形態(tài)。比濁法測定血小板聚集。流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜糖蛋白 GP。PCF法擴(kuò)增ABCG和ABCG基因的所有外顯子和側(cè)翼序列，DNA測序確定基因 異常，限制性內(nèi)切酶Bfa I分析該家系及70名正常人相應(yīng)序列的PCR產(chǎn)物。第3局部用HPLC法檢測3名患者、他們父母和6例正常人紅細(xì)胞膜的固醇含量將谷固醇與紅細(xì)胞在體外進(jìn)行孵育 , 觀察正常人紅細(xì)胞形態(tài)變化并檢測其滲 透脆性。結(jié)果第 1 局部植物固醇血癥患者血漿谷甾醇和豆甾醇濃度明顯高于正

6、常 人均值。他們父母的谷固醇和二氫膽固醇濃度比正常人均值輕度增高 , 而豆固醇未見 增高。第2局部 3名患者臨床上主要表現(xiàn)巨大血小板和紅細(xì)胞形態(tài)異常 ,如球形、 口形紅細(xì)胞和靶形細(xì)胞。紅細(xì)胞滲透脆行增加。出血時(shí)間延長、對瑞斯托霉素誘導(dǎo)聚集反響降低。 他們血漿谷固醇、豆固醇和二氫膽固醇濃度明顯增高而總膽固醇濃度正常。發(fā)現(xiàn)在ABCG基因外顯子1中18802位堿基發(fā)生C-T突變,導(dǎo)致22位的谷氨酰 胺Q變?yōu)榻K止密碼子。3名患者均為純合子,其父母及兩個(gè)親屬為雜合子。對 ABCG基因測序未見異常。限制性內(nèi)酶Bfa I分析70名正常人相應(yīng)序列的PCF產(chǎn)物未發(fā)現(xiàn)相同的基因突變。第3局部 3名患者紅細(xì)胞膜的谷

7、固醇、 豆固醇和二氫膽固醇濃度明顯增高。 谷固醇與紅細(xì)胞孵育后 , 紅細(xì)胞異形明顯 , 可見口形、球形紅細(xì)胞和靶形細(xì)胞 谷固醇組紅細(xì)胞滲透脆性較對照組升高。結(jié)論1.本研究采用改進(jìn)的HPLC法對血漿植物固醇進(jìn)行定量檢測，該法具有 簡便快速 , 靈敏度高 , 需血樣品量小及別離效果好等優(yōu)點(diǎn) , 為植物固醇血癥的診斷 提供了一種切實(shí)可行的檢測方法。 2. 血細(xì)胞是血漿植物固醇毒性作用的一個(gè)靶子 顯著增高的血漿植物固醇導(dǎo)致了紅細(xì)胞和血小板的異常 ; 紅細(xì)胞和血小板的異常 是植物固醇血癥的一種特殊的表型 ; 伴有巨大血小板和或難以解釋的溶血性 貧血的患者需與植物固醇血癥鑒別。3. ABCG5基因外顯子1上的一個(gè)新的無義突變構(gòu)成了伴有紅細(xì)胞和血