基因工程試題及答案全集

1、作業(yè)一： 一、名詞解釋：1、 基因：是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)， 是DNA(脫氧核糖核酸)分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的 DNA分子片段2、 基因組該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子3、 操縱子：原核生物的幾個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因往往排列在一起，轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結(jié)構(gòu)基因與其上游的啟動子，操縱基因共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位，稱操縱子。4、啟動子：是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，包括至少一個轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在真核基因中增強(qiáng)子和啟動子常交錯覆蓋或連續(xù)。有時，將結(jié)構(gòu)

2、密切聯(lián)系而無法區(qū)分的啟動子、增強(qiáng)子樣結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱啟動子。5、 增強(qiáng)子：是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高 100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占100200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為812bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。6、 基因表達(dá)：是指細(xì)胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。二、簡答題1、說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答：限制性內(nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則 ,即屬名+種名+株名的各一

3、個首字母 ,再加上序號. 基本原則： 3-4 個字母組成 ,方式是：屬 名+種名+株名+序號; 首字母： 取屬名的第一個字母 ,且斜體大寫 ;第二字母： 取種名的第一個字母 ,斜體小寫 ;第三字母： (1) 取種名的第 二個字母,斜體小寫;(2) 若種名有詞頭 ,且已命名過限制酶 ,則取詞頭后的第一字母代替 .第四字母： 若有株名 ,株名則作為第四字母 ,是否 大小寫，根據(jù)原來的情況而定,但用正體.順序號：若在同一菌株中分離了幾種限制酶 ，則按先后順序冠以I, II ,山, 等，用正體.2、什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性？受哪些因素影向？答：I類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這

4、種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。條 件的改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現(xiàn) 第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星號活性。概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：(1) 高甘油含量 (5， vv)；(2) 限制性內(nèi)切核酸酶用量過高 (100UugDNA)；(3) 低離子強(qiáng)度 ( IDNA （linear form，線型，質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子）ocDNA （開環(huán)DNA , open circularDNA，ocDNA，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈

5、上有一到幾個切口）但是由于瓊脂糖濃度、電場強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和溴化乙錠等的影響，會出現(xiàn)相反的情況。3、帶電量: 核酸分子是兩性解離分子， pH3.5 是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團(tuán)中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中 向負(fù)極泳動；而 pH8.O-8.3 時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電 荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。4、 堿基組成：對遷移率影響不明顯，單鏈DNA形成發(fā)頭結(jié)構(gòu)，影響遷移率，單鏈（1kb）小于雙鏈 DNA （1kb）不同濃度瓊脂糖凝膠的有效分離范圍DNA 在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍聚丙烯酰胺濃度

6、有效分離范圍(hp)(hp)二甲苯青FFFF3J53J510001000200020004604601001005.05.080-50080-50026026065658.08.060604004001C01C0454512.012.040-20040-2007070202015.015.025251501506060151520.020.0 10010012121、 DNA降解，應(yīng)避免核酸酶污染；2、 電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；3、 所用電泳條件不合適 電泳時電壓不應(yīng)超過 20V/cm，溫度V 30C

7、；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)v 15 C ;核查所用電泳緩沖液是否有足 夠的緩沖能力；4、 DNA上樣量過多減少凝膠中DNA上樣量；5、 DNA樣含鹽過高電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽；6、 有蛋白污染 電泳前酚抽提去除蛋白；7、 DNA變性 電泳前勿加熱，用 20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。染色劑及其原理染色劑：核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)岀帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色，目前還有其他不僅安全的染色劑。溴化乙錠(ethidium bromide,EB )最常用 260nm，300nm，360nm，發(fā)出 590nm 橙紅色。原理溴化乙錠：含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一

8、個三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大約每2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的 590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合 DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠(0.5ug

9、/ml)時，可以檢測到少至10ng的NDA條帶。原理 銀染：銀染色液中的銀離子(Ag )可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收。EB的替代物:GoldView DNA染料是一種可代替溴化乙錠(EB)的新型DNA染料，使用方法與之完全相同。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA時,GoldView與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號，其靈敏度與EB相當(dāng)，在某些波段甚至超過 EB。GeneFinder具有安全、靈敏等突出優(yōu)點(diǎn)，可以代替溴化乙錠(EB)作為各

10、種核酸電泳的染色劑。第五章 PCR技術(shù)PCR的英文全稱：Polymerase Chain ReactionPCF技術(shù)的基本原理： 類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。過程：PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA勺變性：模板DNA經(jīng)加熱至93C左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈， 以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，弓I物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDN

11、A聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制 原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性 - 退火 - 延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán) 需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。反應(yīng)體系：影響PCR特性、擴(kuò)增效率的因素影響PCF產(chǎn)量及準(zhǔn)確性的因素：1、酶的濃度：常用范圍為14U/100卩l(xiāng)。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多 會導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。酶量低，擴(kuò)增產(chǎn)物不夠 。2、 dNTPs的濃度：dNTPs的濃度

12、：主要影響產(chǎn)量、特異性和保真度。在PCF反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻 入，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。PCR常用的濃度為50200卩mol/L，不能低于1015卩mol/L。 四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導(dǎo)聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應(yīng)。決定最低dNTP濃度的因素是靶序列 DNA的長度和組成，例如，在 100卩l(xiāng)反應(yīng)體系中，4X dNTPs濃度若用20卩mol/L，基本滿足合成 2.6 卩 g DNA或 10pmol

13、 的 400bp 序列。50 g mol/L 的 4 XdNTPs可以合成 6.6 卩 g DNA,而 200 卩 mol/L 足以合成 25 卩 g/DNA。3、 PCR緩沖液：72C時，反應(yīng)體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2。二價陽離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí) 驗(yàn)表明，Mg2就于Mn2+而Ca2+無任何作用。(1) Mg2+對引物退火、解鏈的溫度、PCR產(chǎn)量和特異性、引物二聚體形成和酶的活性和特異性有影響。Mg2+的最佳濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200 g mol/L時)，但并非對任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結(jié)合時，

14、都要把 Mg2+濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為 110mmol/L。Mg2+過量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物， Mg2不足易使產(chǎn)量 降低。樣品中存在的較高濃度的螯合劑如 EDTA或高濃度帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)如磷酸根，會與Mg2+吉合而降低Mg2+有效濃度。dNTP 含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2+勺有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4X dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此，在高濃度 DNA及 dNTP條件時，必須相應(yīng)調(diào)整 Mg2+的濃度。常用范圍： 0.5-2.5mmol/L 之間，常用為 1.5-2.0 mmol/L(2) Tris -HCl緩沖液：在PCR

15、中使用1050mmol/L的Tris - HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，20mmol/l Tris pH8.3(20C)時，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.86.8之間。(3) KCl濃度：K+濃度在50mmol/L時能促進(jìn)引物退火。但現(xiàn)在的研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高于50mmol/L將會抑 制Taq酶的活性，少加或不加 KCl對PCR結(jié)果沒有太大影響。(4) 明膠：明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100 g g/ml(5) 二甲基亞砜(DMSO：加入10%DMS有利于減少DNA的二

16、級結(jié)構(gòu)，使(G+C %含量高的模板易于完全變性，在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCRT物直接測序更易進(jìn)行，但超過10%寸會抑制Taq DNA聚合酶的活性、降低保真性，因此，大多數(shù)并不使用 DMSO4、退火 ( 復(fù)性 ) 溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。變性后溫度快速冷卻至 40C60C，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%勺引物，55C為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫

17、助選擇合適的溫度：Tm 值( 解鏈溫度 )=4(G+C) 2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-（510C ）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度（特別是開始的階段）可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。5、 變性溫度及時間：慮模板的因素和酶的因素普通TaqDNA聚合酶酶的半衰期：92.5 C 95 C 97C2h 40m 5m變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。一般情況下， 93C94C Imin足以使模板DNA變性，若低于93C則 需 延長時間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步

18、若不能使靶基因模板或PCRT物完全變性，就會導(dǎo)致 PCR失敗。常用 94 C 30 秒6、 延伸溫度與時間：主要考慮Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性以及引物與模板結(jié)合的溫度：7580 C時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷 酸，70 C延伸率大于60個核苷酸/秒，55 C時為24個核苷酸/秒.溫度過高（90 C以上）或過低（22 C）都可影響Taq DNA聚合酶的活性，該酶雖然在 90C以上幾乎無DNA合成。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075 C之間，常用溫度為72C,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸

19、時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。7、 循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在 3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特 異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。8、 引物濃度：弓I物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在 0.11卩mol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會降低PCR的產(chǎn)率。9、 模板濃度 ： 模板濃度高易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。能

20、將皮克 （pg=10-12g） 量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克 （ug=10-6g） 水平。 能從 100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞; 在病毒的檢測中， PCR 的靈敏度可達(dá)3個RFU空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實(shí)驗(yàn)人員所控制，實(shí)驗(yàn)可按已知靶序列量逆減的方式（1ng,0.1ng,0.001ng 等），設(shè)置一組對照反應(yīng)，以檢測擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求。10、 平臺效應(yīng)：反應(yīng)初期，靶序列 DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCF產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期 ，這種現(xiàn)象稱為平臺效應(yīng)。PCR擴(kuò)增效率及DN

21、A聚合酶,PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。定量PCR時，一定要在平臺期前進(jìn)行檢測。11、溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在 9095C變性，再迅速冷卻至4060 C,引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075 C，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100300bp時）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94 C變性，65C左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。第六章

22、核酸分子雜交概念：1、 分子雜交(hybridization):有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過堿基互補(bǔ)退火形成穩(wěn)定的雙 鏈分子的過程。2、 印跡(bloting )：將DNA RNA或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過程。3、 探針(probe)：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或 RNA片段。雜交的種類：固相雜交(solid-phase hybridization)是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)(硝酸纖維素膜或尼龍濾膜)上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。液相雜交(solution hbri

23、dization)指使變性的待測核酸單鏈與已知的核酸單鏈(探針)在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。DNA與 DNA雜交DNA與RNA雜交RNA與RNA雜交幾種常見的雜交：分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的 DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：(1) Southern 雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA探針為 DNA或 RNA(2) Northern雜交：RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上或尼龍

24、膜，然后用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或 RNASouthern雜交原理和步驟原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到 硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或 RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示岀待檢的片段 及其相對大小。步驟：Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列，它包括下列步驟：(1) 酶切DNA,凝膠電泳分離各

25、酶切片段，然后使DNA原位變性。(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。(3) 預(yù)雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。(4) 讓探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。(5) 通過顯影檢查目的 DNA所在的位置。轉(zhuǎn)膜的方式：將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種：(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移：本方法由Southern發(fā)明，故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單 ，不需要用其他儀器。缺點(diǎn) 是轉(zhuǎn)移時間較長，轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。 電泳轉(zhuǎn)移：將DNA變性后，可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用，可直接轉(zhuǎn)移

26、較大的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時，才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3)真空轉(zhuǎn)移：有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器，它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上， 緩沖液從上面的一個貯液槽中流下，洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速，在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移岀來。 轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號比 Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會使凝膠碎裂， 并且在洗膜不嚴(yán)格時，其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。探針標(biāo)記的方法：1、缺口平移法 (Nick Transla

27、tion )原理及過程：反應(yīng)體系中 DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用 DNA聚合酶I 5 - 3 外切酶活性，在缺口處按 5- 3方向切除單核苷酸；同時DNA聚合酶I有5 - 3 的聚合酶活性，在缺口處3端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。2、隨機(jī)引物法(6核苷酸引物標(biāo)記法)原理及過程：利用 E.coli DNA 聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有53 聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在 Klenow的

28、催化下，以引物3端為起點(diǎn)，沿模板3 - 5 方向合成DNA新鏈。 反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的 dNTP,隨機(jī)摻入新合成的 DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。3、末端標(biāo)記多核苷酸激酶的用途：DNA5-OH端磷酸化、標(biāo)記 DNA的 5 端（1 ）正向反應(yīng)（2 ）交換反應(yīng)標(biāo)記法影響雜交的因素：1、 溫度雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm1015C，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30C），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜

29、交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜父溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見下表。最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR ） : Tor =Tm - 25 C苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm - （10或15C）非苛刻復(fù)性溫度： Tns =Tm - （30或35 C ）在2X SSC反應(yīng)液中，可以根據(jù)下列公式計(jì)算最適復(fù)性溫度：TOr =0.51 （G+C%）+47 C。2、離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度增加，Tm值增加，一般用 0.9-0.75 mol/L 的NaCl3、DNA的濃度最低

30、檢測水平為單拷貝為：0.5pg4、探針的濃度：總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜 雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為510ng/ml和251000ng/ml探針質(zhì)量衡量的指標(biāo)：比活性即cpm/卩g如果比活性為108cpm/ g g，用的濃度為10卩g/ml，比活性為109cpm/g g，用的濃度為2 g g/ml。5、 探針的長度和同源性：為了保證雜交的特意性，一般需要用500pb左右的長度的探針。但是，探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復(fù)雜度）和探針濃度。在濃度一定時，雜交率主要影響因素

31、是探針的長度，長的探針雜交時間很長，而短探針容易退火，因此標(biāo)記好的探針長度 為100 nt左右，太短將探針與目的序列的結(jié)合。6、雜交液的成分 ：反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，tm值可降低0.72 C。6M尿素，降低Tm約30C 惰性多聚體可用來促進(jìn) 250個堿基以上的探針 的雜交率。對單鏈探針可增加 3倍，而對雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。7、雜交的時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增 多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行 16h左右。8、 雜交液的體積： 一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因?yàn)?/p>

32、在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。一般雜交液的用量為1ml/10cm2一、名詞解釋基因工程:在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建遺傳物質(zhì)的新組合，并使之滲入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)， 而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。穿梭載體：人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。指帶有兩種宿主復(fù) 制子，因而能在兩種生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子。southern雜交:DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為

33、DNA，探針為DNA或 RNA。PCR：聚合酶鏈反應(yīng) Polymerase Chain Reaction，通過模擬體內(nèi) DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的4、無水乙醇消毒效果最好，但價格昂貴，因此用70%酒精消毒。（錯）7.抽提DNA時，水飽和酚的作用。酚的作用主要使技術(shù)。載體：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA分子叫載體。克隆:（名詞）是指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體。（動詞）是指產(chǎn)生在遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體的過程。二、填空1、基因工程

34、所用的工具酶有核酸酶、聚合酶、連接酶、修飾酶四大酶類。2 限制性內(nèi)切酶1U酶定義為 在建議使用的 Buffer及溫度下，在 20 pl （ 50訕）反應(yīng)體系中反應(yīng) 1小時，使1厲入DNA完全消化所需的 酶量，weiss和TNB為_酶活性單位。3、 在抽提DNA中，酚的作用是去除蛋白 ，氯仿的作用是增加比重，有助于分相。加入異戊醇的作用是防止起泡把DNA碰斷，同時有助于離心后界面更清晰 _。4、 限制性內(nèi)切酶識別序列具有旋轉(zhuǎn)對稱，反向重復(fù)結(jié)構(gòu)特征。5、 質(zhì)粒有 嚴(yán)緊型 和 松弛型 兩種類型，在克隆基因中常用的是松弛 型，在表達(dá)研究中常用的是嚴(yán)緊 型。6、 在沉淀DNA時，常用_2J咅體積的無水乙醇。若反應(yīng)體系中無單價離子存在，常加入 110體積的3MNaAc或KAc,其作用是 _中和DNA上的負(fù)電荷，減小排斥力，使其易于沉淀。7、 為提高重組轉(zhuǎn)化效果，對同一種酶切后載體進(jìn)行脫磷處理。8、 在制備感受態(tài)細(xì)胞時，為了提高轉(zhuǎn)化率，常用冰凍的CaCI?處理和短暫的42c熱擊處理。9、 當(dāng)目的片段無