藥效學實驗的設計

1、藥效學實驗設計藥效學實驗設計藥理實驗設計三原則：l對照對照controll隨機隨機randoml重復重復replication一對照（一對照（controlcontrol）l1自身對照：自身對照：是在同一個體身上觀察給藥前后某種指標的變化，此種對照可減少個體差異，但不能克服隨時間而變的因素的影響。如肝炎有自愈傾向，給藥后肝功好轉(zhuǎn)不一定是藥物的作用，故自身對照實驗可能會得出錯誤結(jié)論。除非有可靠證據(jù)說明檢測指標不隨時間而變或同時設組間對照，否則不宜使用自身對照。一對照（一對照（controlcontrol）l2組間對照組間對照：是實驗中設若干平行組，進行各組間比較。這種設計符合平行對照的原則，最為

2、常用。l 組間對照實驗設計：組間對照實驗設計：l 1正常對照組正常對照組（或陰性對照組，或空白對照組）：正常動物，給藥物賦型劑。給藥途徑同給受試藥組。l 2模型對照組：模型對照組：如制備肝硬化、高血壓、心肌梗塞等。不用藥物治療，給賦型劑，給藥途徑同給受試藥組。l 3陽性對照組：陽性對照組：制造動物病理模型，給已知藥物作對照。一對照（一對照（controlcontrol）l 陽性對照藥的選則：陽性對照藥的選則：選已知藥物，如研究目的是報批新藥，應選已批準上市的藥物作對照；如系理論研究，可選未上市藥物。所選藥物盡量是同類藥，以便比較作用強度，或公認的有效藥物，如抗?jié)兯幯芯恳话氵x法莫替丁。如抗癌藥

3、研究一般選環(huán)磷酰胺。l 設陽性對照組的目的設陽性對照組的目的：l 考察實驗方法的可靠性、穩(wěn)定性。l 考察受試藥的作用性質(zhì)、強度，從而發(fā)現(xiàn)受試藥的優(yōu)缺點。l 陽性對照藥的劑量選則陽性對照藥的劑量選則：如要比較陽性藥與受試藥的作用強度，應設多個劑量組。如受經(jīng)費等的限制，也可設一個劑量組，但此時設陽性對照組的作用只是考察方法的可靠性，不能得出受試物作用強弱的結(jié)論。l 陽性對照藥的給藥途徑陽性對照藥的給藥途徑，如能做到，盡量同受試藥組。一對照（一對照（controlcontrol）l要使對照組與實驗組具有可比性，必須符合一致性原則一致性原則：l除處理因素不同外，非處理因素應均衡一致（同時、同地、同條件

4、、同種、同批、同病情）一對照（一對照（controlcontrol）l在用動物疾病模型（如高血壓）實驗時，在動物A的基礎上加了處理B高血壓，加上溶媒C，故欲判定藥物D的作用，給藥組的設計必須滿足下述設計：l模型對照組：A+B+Cl藥物實驗組：A+B+D一對照（一對照（controlcontrol）l為了判定實驗模型的成功與否，即此指標的變化（血壓升高）是否是由于造型的結(jié)果還是自發(fā)性波動，必須另設空白對照組。故更完整的實驗設計應如下：l空白對照組：A+Cl模型對照組：A+B+Cl藥物實驗組：A+B+D一對照（一對照（controlcontrol）l空白對照并不是不給任何處理的對照，而應施以和受試

5、組相同的操作條件，如動物的質(zhì)量、飼養(yǎng)條件、藥物溶媒、給藥途徑、給藥次數(shù)、手術過程。二隨機（二隨機（RandomRandom）l隨機包括隨機包括隨機分組隨機分組和和隨機操作隨機操作。l1隨機分組：隨機分組：l 隨機分組就是按照機遇原則來進行抽樣或分組，其目的是使一切干擾因素分配到各組時只受純機遇的抽樣誤差的影響，由于機遇對每個組來說是相等的，未知因素可對每個組產(chǎn)生影響，使每個組的同一指標平行增加或減少，這就避免了實驗者主觀因素或其它偏差性誤差的影響。如觀察藥物對大鼠實驗性胃潰瘍的影響，應先造成大鼠胃潰瘍模型，然后將已成型動物隨機分配到各組中，從而避免了造型過程中人為的影響。對于短時內(nèi)難完成的造型

6、，應先確定隨機順序，按隨機順序操作，并將動物按隨機順序分配到各組。二隨機（二隨機（Random)Random)l 隨機化手段可用隨機數(shù)字表，這在一般統(tǒng)計學書上均可撿索到。也可用電腦統(tǒng)計學軟件生成。l 近年來提倡均衡下的隨機（隨機區(qū)組法），即先將能控制的因素（性別、體重、病情嚴重程度等）均衡地分檔，然后在每一檔中隨機取出等量動物分配到各組，使哪些較難控制因素（如活潑程度、饑飽程度、疲勞程度）得到隨機安排。二隨機（二隨機（Random)Random)l典型分組舉例典型分組舉例：l 某實驗者有小鼠60只，各半，體重18-22 g, 欲分為6組，如何分組？l分別將鼠分開，各一籠，每籠30只。l 2將鼠

7、30只按體重分籠，分別為18g, 19 g, 20 g, 21 g, 22 g,共5籠。每籠有同一體重鼠4-8只。二隨機（二隨機（Random)Random)l 3按電腦統(tǒng)計軟件，生成隨機順序如下：l 第一批：6，3，2，4，1，5l 第二批：1，4，5，3，2，6l 第三批：4，5，2，3，6，1l 第四批：2，4，5，3，1，6l 第五批：3，6，1，5，2，4二隨機（二隨機（Random)Random)l 4.備好6只鼠籠，分別標為A.正常對照組，B.模型對照組，C.陽性對照組，D.某藥低劑量組，E.某藥中劑量組，F(xiàn).某藥高劑量組。l 5. 從18 g籠（如有4只小鼠）開始取小鼠，按第一

8、批隨機順序，依次放入F組、C組、B組、D組。A組和E組各缺1只鼠，從體重最為接近的19 g籠中取出，依次放入A組和E組。第二批和第五批隨機方法依此類推。l 重復上述過程，將30只鼠隨機分入6個實驗組中。分組結(jié)果，各實驗組小鼠同性別鼠數(shù)量相等，各組平均體重相近，各組在不同體重檔次中的小鼠數(shù)相近。各組鼠的營養(yǎng)狀態(tài)及活潑程度接近。二隨機（二隨機（Random)Random)l2隨機操作：隨機操作：l實驗過程如可能受隨時間變化而變化的已知和未知因素的影響，則操作過程的順序（不論是組間或是組內(nèi)）也應是隨機的，不應按一固定順序進行，否則會出現(xiàn)順序誤差。 l操作典型錯誤舉例操作典型錯誤舉例：l某實驗者進行抗

9、心肌梗塞實驗，60只大鼠，分為6組進行冠狀動脈結(jié)扎，分別分為假手術對照組（只開胸不結(jié)扎冠狀動脈）10只、模型對照組10只，陽性對照組10只，藥物低、中、高劑量組各10只。實驗時按組別順序依次對第1-6組進行手術。二隨機（二隨機（Random)Random)l錯誤錯誤：該實驗各組手術依次進行，未遵照隨機操作的原則，實驗結(jié)果可能會受隨時間變化因素的影響，如受麻醉、動物體內(nèi)生理狀態(tài)（如血糖水平）的時晨變化、環(huán)境的經(jīng)時性變化，如室溫等。這些因素可能導致順序誤差。體外實驗如一次操作時間短（如在一個細胞培養(yǎng)平板上的操作），對指標不發(fā)生影響時，可以順序操作，此時應嚴格控制實驗條件，使其穩(wěn)定不變，特別是環(huán)境變

10、化。樣品數(shù)不宜過多，以便縮短操作時間。體外實驗如在短時間內(nèi)分批進行（如在幾塊細胞培養(yǎng)平板上的實驗），每批均應同時做對照組，以消除順序誤差。l正確的操作順序正確的操作順序：共分10批進行。第1批手術動物，每組各做一只（平行操作），各組順序隨機排列。第2-10批如法進行。三重復三重復l藥理實驗的結(jié)果應能穩(wěn)定地重現(xiàn)出來，重現(xiàn)實驗過程稱重復。重復有二個含義：一是只做一批實驗，在不同個體身上重復，如每一實驗組要做多只動物，小鼠和大鼠一般每組要在10只以上，這種重復適合于絕大多數(shù)實驗。另一種重復的含義是，每次每組做10只 小鼠（體內(nèi)）或4管樣品（體外），反復重復3次，這主要是一些特殊實驗的要求，如抗腫瘤藥

11、的研究。三重復三重復l 重復時要求每組要有足夠的動物數(shù)或標本數(shù)，不同實驗要求的樣本數(shù)不同，基本規(guī)律是實驗個體的指標變異愈小，則均數(shù)的標準差愈小，所需樣本數(shù)愈小，反之要增大樣本數(shù)。一般說來，計量資料從每個個體中獲得的信息多，所需樣本數(shù)小，計數(shù)資料對信息浪費大，所需樣本多。預試時對照組與實驗組有差別，但顯著性檢驗時P0.05,可能系樣本數(shù)不足所致，正式實驗時可增大樣本數(shù)，如組間確有差異，樣本數(shù)增大后可達顯著性水平，如組間確無差別存在，樣本數(shù)增大后對照組與實驗組在預試時出現(xiàn)的差別就會消失。至于增大到多少合適，應參考預試結(jié)果進行統(tǒng)計學運算，運算方法可參考藥理實驗方法學（第2版）第177頁“實驗設計中的

12、樣本數(shù)問題” 一節(jié)。三重復三重復l 重復實驗時要嚴格控制實驗條件，在各次重復中使條件盡量前后一致，嚴防干擾因素對各批實驗的影響。應控制的干擾因素包括：（1）動物：品系、性別、體重、年齡、飼料、飼養(yǎng)環(huán)境，（2）藥物：批號、劑量、溶解度、穩(wěn)定性、注射容量、注射速度、酸堿度、溫度、保存條件。（3）儀器：靈敏度、精確度、零點飄移、電壓穩(wěn)定性及操作熟練程度。（4）環(huán)境：室溫、氣壓、濕度、季節(jié)，甚至實驗的上午或下午、動物的群養(yǎng)和獨養(yǎng)也影響實驗結(jié)果。四四 劑量確定劑量確定l受試藥組受試藥組：制造動物病理模型，給未知藥物。l 劑量組劑量組：至少設2個劑量組，一般在三個劑量組以上。l 劑量的選則：劑量的選則：劑

13、量的最終確定，應以預試結(jié)果為據(jù)。在進行預試時，可參考下列方法：l （1）根據(jù)文獻資料，參考結(jié)構(gòu)類似藥物的有效劑量。l （2）根據(jù)文獻資料，參考本藥在其它實驗模型中的有效劑量。l （3）參考LD50，主要藥效試驗時一般應1/31/5LD50,如有效劑量接近LD50，所測實驗結(jié)果應用價值不大。l （4）參考藥動學數(shù)據(jù)，從有效濃度推算有效劑量。（5 5）參考人用量推算：）參考人用量推算：l 早在十九世紀末年，生理學家Voit 氏等發(fā)現(xiàn)雖然不同種類的動物每kg體重單位時間內(nèi)的散熱量相差懸殊，但都如折算成每m2體表面積的散熱量，則基本一致。例如馬、豬、狗、大鼠和人的每m2體表面積每24小時的散熱量都在1

14、000 kCal 左右。藥理學家研究藥物在體內(nèi)的作用時則習慣于以mg/kg 或g/kg等方式來計算藥物的劑量。這種辦法行之于同種動物的不同個體時，問題似乎不大；但用于不同種類動物時，常常會出現(xiàn)嚴重偏小或偏大，以致無法完成實驗。1958年Pinkle氏報告6-MP等抗腫瘤藥物在小鼠、大鼠、狗和人身上的治療劑量，按mg/kg計算時差距甚大，但如改為按mg/m2體表面積計算，就都非常接近（見表2-5），此后，按體表面積計算劑量的概念逐漸為藥理學家接受，被認為尤其適用于不同動物之間劑量的換算。表表 2-5. 6-MP 對不同種屬動物和人有效劑量的變異對不同種屬動物和人有效劑量的變異 每每 天天 劑劑

15、量量 動動 物物 體重體重 （kg） 體表面積體表面積 （m2） （mg/kg） （mg/m2） 小鼠小鼠 0018 00075 40 85 大鼠大鼠 025 0045 20 111 狗狗 10 048 6 125 嬰兒嬰兒 8 04 3 63 兒童兒童 20 08 3 63 成人成人 70 185 3 108 動物的體表面積的一般計算法：動物的體表面積的一般計算法：l 從體重推算體表面積，一般認為Meeh-Rubner公式較為合適：l A=k(W2/3)/10,000l式中A為體表面積，以m2計算；W為體重，以g計算；K為常數(shù)，隨動物種類而不同，小鼠和大鼠9.1,豚鼠9.8, 兔10.1，貓

16、9.9, 狗11.2, 猴11.8,人10.6。應當指出，這樣計算出來的體表面積仍是粗略估計，不一定完全符合實測數(shù)據(jù)。l例例：試算一體重為1.5 kg的家兔的體表面積：l解：A=10.1(15002/3)/10,000l log A= log 10.1+2/3 log 1500log 10000=0.8783l A=0.1324 m2 l人或動物之間藥物劑量的換算人或動物之間藥物劑量的換算：l 為使用方便，可按“mg/kg折算 mg/m2的轉(zhuǎn)換因子”進行換算：表表 2-6 .不同種類動物間劑量換算時的常用數(shù)據(jù)不同種類動物間劑量換算時的常用數(shù)據(jù) 動動 物物 Meeh-Rubner 公公式的式的

17、K 值值 mg/kgmg/m2 轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換因子 與小鼠轉(zhuǎn)換因子與小鼠轉(zhuǎn)換因子的比值的比值 小鼠小鼠 9.1 3 1 (20 g） 大鼠大鼠 9.1 6 2 (200 g) 倉鼠倉鼠 9.0 4.1 1.37 豚鼠豚鼠 9.8 8 2.67 (400 g) 家兔家兔 10.1 12 4 (2 kg) 貓貓 9.9 14 4.67 (2.5 kg) 狗狗 11.2 19 6.33 (10 kg) 猴猴 11.8 12 4 (3 kg) 人人 10.6 36 12 (50 kg) 例例： 如某利尿藥給大鼠灌胃的有效劑量為如某利尿藥給大鼠灌胃的有效劑量為 250 mg/kg， 試計算給狗灌胃的， 試

18、計算給狗灌胃的試用劑量是多少？試用劑量是多少？ 查表得：大鼠轉(zhuǎn)換因子為查表得：大鼠轉(zhuǎn)換因子為 6,狗的轉(zhuǎn)換因子為狗的轉(zhuǎn)換因子為 19，按下式計算：，按下式計算： 由小動物劑量（如大鼠）換算大動物（如狗）劑量：由小動物劑量（如大鼠）換算大動物（如狗）劑量： 狗狗試用劑量 （試用劑量 （mg/kg） =大鼠劑量大鼠劑量(mg/kg) (大鼠的轉(zhuǎn)換因子大鼠的轉(zhuǎn)換因子/狗的轉(zhuǎn)換因子狗的轉(zhuǎn)換因子) =250 （6/19）= 85 (mg/kg) 由大動物劑量（如狗）換算小動物（如大鼠）劑量：由大動物劑量（如狗）換算小動物（如大鼠）劑量： 大鼠大鼠試用劑量 （試用劑量 （mg/kg） =狗劑量狗劑量(mg/kg) (狗的轉(zhuǎn)換因子狗的轉(zhuǎn)換因子/大鼠的轉(zhuǎn)換因子大鼠的轉(zhuǎn)換因子) =85 （19/6）= 250 (mg/kg) l由上表可見，按由上表可見，按mg/kg劑量折算成等效劑劑量折算成等效劑量，人為小鼠的量，人為小鼠的1/12，大鼠的，大鼠的1/6， 家兔、家兔、猴的猴的1/3，狗的，狗的1/2。l 高低劑量的確定：高低劑量的確定：l 如已知某藥的劑量范圍，進行藥效對比時，一般選中效劑量；進行拮抗實驗或解毒實驗時，劑量應偏高；進行多藥協(xié)同實驗時，劑量應偏低。l量效曲線測